炎症反应的交联透明质酸钠凝胶降解

炎症反应产生交联透明质酸钠凝胶降解

Nobuhiko Yui, Teruo Okano and Yasuhisa Sakurai日本女子医学院生物工程研究所

摘要制备可降解的二缩水甘油基醚（glycidyiether）交联透明质酸钠凝胶，研究体内炎症和离体羟基自由基降解交联透明质酸钠凝胶。离体是由H2O2and FeSO4反应产生羟基诱导迅速但有限制的交联透明质酸钠凝胶降解。降解样式符合假定适合于凝胶表面降解的理论方程。由于阻止透明质酸酶进入交联透明质酸钠凝胶内部，离体交联透明质酸酶的降解作用很小。交联透明质酸钠基质中掺入微球药物。在交联透明质酸钠基质降解过程中药物被释放。在体移植实验揭示了炎症应答过程交中联透明质酸钠基质的降解。因此交联透明质酸钠凝胶可以可以作为能降解的移植药物载体。

前言

药物经由多聚体基质的降解、释放、分散和溶解，多聚体基质表面降解已经得到广泛研究。过去，酯键的水解经常作为多聚体基质降解的机制。具有疏水键聚酯像多聚乙醇酸、多聚乳酸得到深入研究。经由表面侵蚀药物传输的生物降解多聚体优于经由体积降解药物的降解基质。基本上，这些多聚体的降解贯穿整个多聚体，可导致即突发的作用和掺入药物无活性。因此，药物的扩散发生在多聚体基质降解之前是有意义的。由此，生物降解的药物释放时必须被预言。因此，表面降解多聚体发展给与更多关注。

最近，为了获得药物传输体系研究了几种多聚体。这些体系的可以使用磁的、电的、超声的、温度、PH值多聚体。这些多聚体可以与酶底物反应以及药物PH敏感的溶解能力相结合。使用了作为药物缓释作用的多聚物侵蚀率的比率的多聚体，例如1,1,1 -三乙氧基乙烷

poly(orthiesters), 多聚乙缩醛（polyacetals）and 聚酸酐（polyanhydrides）。这些多聚体的表面侵蚀率（降解）通过疏水多聚体不稳定的链的水化发生的。由掺入敏感PH的不稳定的键完成刺激反应多聚体的侵蚀。酶底物反应产生局部PH变化用来改变多聚体的侵蚀率。不管怎么说，经由PH敏感多聚体的侵蚀率调节药物的释放率是相当困难。为了实现自动反馈药物传输系统“生物降解多聚体”，这个多聚体将被设计成有特殊的内部信号，保证适合药物传输的足够长的周期降解。

透明质酸钠是由氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸二糖单位重复构成的线性粘多糖。当溶解在水溶液中时透明质酸通常为高粘度液体，可以被修饰成生理性关节滑液、玻璃体和身体其他液体。众所周知HA在机体有多种重要生理功能，包括控制细胞渗透压、细胞分化、炎症过程的羟基的清除，血管生成。最近，通过微生物发酵实现了大量HA商业化。HA已经在眼外科、关节外科作为治疗因子得到使用。

在活体HA的降解主要通过两个途径实现。一是经由透明质酸酶途径，二是作为活性氧来源的羟基途径。在正常身体状态下皮肤和皮下组织中酶的活性很低，皮下注射透明质酸酶降解生理盐水透明质酸钠凝胶要好几天时间。然而，倘若透明质酸钠凝胶注射在一个部位，在这个部位就有炎症发生，羟基降解透明质酸钠凝胶速率比酶迅速和明显。在炎症的初始阶段增加了毛细血管的渗透性可以使细胞因子和吞噬细胞在炎症部位聚集。吞噬细胞可以被免疫复合体和炎症复合体激活产生杀菌因子羟基（OH）。不管怎样，宿主的保护性反应产生过多羟基可导致结缔组织损伤。羟基涉及到了器官和组织损伤和包括透明质酸钠大分子降解。透明质酸在炎症的急性期的降解机制是羟基（OH）在关节炎的滑液中得到了证据。滑液的粘性下降和HA溶解发生在离体产生酶触超氧发生之后，这已经使用单管粘度计证实了。从那时起，许多作者在离体和在体实验中羟基解聚了大分子。

刺激生物降解敏感的药物传输体系的发展中，应用了羟基降解HA。例如：具有关节病的患者治疗注射了甾体激素和HA液体。从这一点来看，交联透明质酸钠凝胶正面对着一个药物移植的炎症反应降解新家族。这样，抗炎药物的结合，像甾体激素和交联透明质酸钠凝胶依

赖炎症作为药物传输。

在这篇文章中，描述了交联透明质酸钠凝胶制备，研究由羟基降解交联透明质酸钠凝胶。离体检测了炎症应答反应中交联透明质酸钠凝胶的降解。交联透明质酸钠凝胶降解特性提示设计一个新的在体炎症调节降解凝胶是可能的。

材料和方法

交联透明质酸钠凝胶制备

分子量8.7x 10’透明质酸钠购自Shiseido Co., Tokyo, Japan, 乙二醇二缩水甘油基醚Ethyleneglycol diglycidylether (EGDGE) and多聚缩水甘油基醚Polyglycerol polyglycidylether (PGPGE) 由Nippon Oil & Fats, Co., Tokyo, Japan, 和Nagage Chemical Industry Co.,提供。透明质酸PGPGE和EGDGE化学结构在图1中显示。聚苯乙烯乳胶，直径I .O /tm, 购自Sekisui 化学公司。.

交联透明质酸钠凝胶按下面方法制备

1N的氢氧化钠溶液中放入透明质酸钠20wt%溶解。在乙醇中溶解的EGDGE加入HA液中（氢氧化钠液/乙醇9;1）旋转混匀。当含HA的微球被制备的时候，EGDGE加之前，多聚乳胶加入透明质酸钠溶液。当PGPGE作为交联剂时，PGPGE溶入1N氢氧化钠溶液中，加入HA溶液（如表）。混合物放入直径10mm、高3mm的玻璃小皿中，并在60℃反应15分钟。获得凝胶放入过量水/乙醇（1:1）皿中并用1N盐酸PH值至中性。凝胶被过量水/乙醇（1:1）冲洗若干遍。最后，在实验室实施前凝胶中乙醇被水取代。

图1透明质酸PGPGE和EGDGE化学结构

表1 由PGPGE和EGDGE制备交联透明质酸凝胶

交联透明质酸钠凝胶性质

在蒸馏水中（25℃）检测交联透明质酸钠凝胶水溶胀。冷冻干燥后，用扫描电镜观察了干燥交联透明质酸钠凝胶。

交联透明质酸钠凝胶在体外降解

由硫酸铁和过氧化氢反应产生羟基降解交联透明质酸钠凝胶。该过程是众所周知过程。除了另由注释，按下例方法实施。7 mmx7 mm7 mm方形交联透明质酸钠凝胶浸泡在 5 mM

FeS04溶液中(100 ml) 2天。为了形成HA-Fe2+复合体。然后,交联透明质酸钠凝胶最初降解浸泡凝胶进入不同浓度的H2O2（100 ml）中。H2O2浓度由液体分光光度法（二甲氧苯胺反应500nm产生红颜色）检测。除了另有说明，降解交联透明质酸钠凝胶(HPLC)分析。在预测试的基础上，HPLC 分析了1ml的降解产物，HPLC (X-8010, Tosoh Co., Japan)。使用恢复相柱（Pak ODS-2201-N. 6ф×200 mm, Senshu Sci., Tokyo, Japan)。使用的溶剂是水，35℃流动速度1ml/min。降解产物保留时间1.5-3.5min。相差显微镜下（0.100 mm, 1 /400 mm2）用血球计数器记数微球释放数量估算微球释放透明质酸钠凝胶量。

在体炎症反应交联透明质酸钠凝胶降解

在下列实验前，20×10×1.8 mm凝胶平板用高压锅灭菌30分钟。确认高压灭菌没有改变平板凝胶内容，表明通过高压凝胶没有降解。外科移植凝胶平板在5周Waster大鼠(平均体重110g)背部皮下(实验用鼠46只)。切口4cm长，用5号丝线缝合，然后消毒。移植后14和28天，为了产生初始炎症反应，背部切口4cm长伤口作为伤口愈合实验。预定的周期后，用过量麻醉剂杀死大鼠，然后移植HA凝胶和局部组织一起取出。伤口愈合实验7天后杀死大鼠。残留HA用咔唑法定量分析葡萄糖醛酸。没有移植（对照组）交联透明质酸钠凝胶的大鼠背部组织葡萄糖醛酸几近阴性。

结果和讨论

前面文献和专利已经报道交联透明质酸钠凝胶制备和在体没有毒性。HA与商业化的交联剂反应，使用的交联剂例如双环氧化合物和二乙烯砜（bisepoxy compounds, divinyl sulfone.）。最适合的交联剂是通过HA分子的羟基基团形成醚键的多功能环氧化合物。本实验使用的EGDGE and PGPGE分别具有两个或四个环氧基团，它们被认为制备稳定的、亲水的交联HA凝胶是充分的够用。在本实验中，催化是使用的氢氧化钠。文献报道HA长时间暴露在高PH值中导致HA解聚作用，通常，该过程室温条件下几个小时内完成，本实验使用了相似浓度氢氧化钠液体。为了减少HA的解聚，反应15分钟后停止交联反应。用不同的摩尔浓度EGDGE 或PGPGE/ HA 制备交联透明质酸钠凝胶的结果显示在表1。尽管，交联剂的含量相当的高，每一个交联透明质酸钠凝胶都含有较高的水（95%）。交联剂的摩尔浓度和透明质酸钠是变化的0.5-1.5，EGDGE交联的透明质酸钠凝胶在潮湿的状态下是有点脆，不适合在体皮下移植。这结果表明：HA凝胶交联密度相对较低。这可以由于EGDGE 与HA反应过低，（a）EGDGE具有水不相混性（b）HA溶液具有高的粘性。在降解试验中，使用方形EGDGE交联透明质酸钠凝胶是容易处理。图2显示了扫描电镜交联透明质酸钠凝胶的横断面。观察了覆盖致密的皮肤大孔海绵样结构。当HA 凝胶含水超过95%冷冻干燥样品形成大孔。由于交联透明质酸钠凝胶制备后切除方形平面，冷冻干燥致密的皮肤也将呈现。