11-乳粉中维生素C的高效液相色谱法测定

磷酸二氢钾（ pH = 2． 5） 作为流动相，这三种水相色谱柱均分离 理想。在目标峰附近无干扰峰。采用 Agilent TC － C18 分析维 生素 C 标准品的液相色谱图见图 1。
图 1 维生素 C 标准品液相色谱图（ 5 mg / L）
2． 5 方法学验证 2． 5． 1 方法的线性范围和定量限 维生素 C 在 0． 5 mg / L ～ 10 mg / L 质量浓度范围内，线性良好，得到标准曲线回归方程 为 Y = 3． 23 × 104 X － 6． 80 × 103 ，相关系数为 0． 999。方法的定 量限为 5 mg / kg。 2． 5． 2 方法的回收率与精密度 用不含维生素 C 的乳粉样 品进行添加回收 和 精 密 度 实 验，样 品 空 白 和 样 品 添 加 的 色 谱 图见图 2 ～ 图 3，乳粉中添加维生素 C 的回收率和精密度实验 结果见表 1。
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【论著】
中国卫生检验杂志 2011 年 11 月 第 21 卷 第 11 期 Chinese Journal of Health Laboratory Technology，Nov 2011； Vol 21 No 11
乳粉中维生素 C 的高效液相色谱法测定
李为鹏，林海丹* ，谢守新，陈毓芳，王岚，邹志飞
［文献标识码］ A
［文章编号］ 1004 － 8685（ 2011） 11 － 2602 － 03
Determination of vitamin C in milk powder by high performance liquid chromatography
LI Wei － peng，LIN Hai － dan* ，XIE Shou － xin，CHEN Yu － fang，WANG Lan，ZOU Zhi － fei （ Guangdong Entry － Exit Inspection and Quarantine Technology Center，Guangzhou 510623，China）
目前，维生素 C 检测常用的方法有 2，6 － 二氯酚靛酚滴定 法［1］、碘滴定法［2，3］、2，4 － 二硝基苯肼比色法［4］、邻苯二胺荧 光法［5 ～ 7］、固蓝盐 B 分光光度法［8］。这些方法操作步骤繁杂。 目前，液相色 谱 法 在 食 品 中 维 生 素 C 的 检 测 中 已 有 广 泛 应 用［9 ～ 11］。乳品中维生素 C 测定的标准方法［12］已出台，其方法 采用邻苯二胺荧光法测定。高效液相色谱法测定奶粉中维生 素 C 的文献有报道［13，14］，但测定是还原型维生素 C，不能测定 已氧化的脱氢抗坏血酸，本文对乳粉中维生素 C 的液相色谱 法进行研究，对样 品 的 提 取 溶 液 进 行 比 较 筛 选，对 去 除 蛋 白、
100 mg / kg 添加水平范围内，回收率在 84． 6% ～ 108% 之间，相对标准偏差 3． 96% ～ 7． 81% ，方法的定量限为 5 mg / kg。结
论： 该法实用、准确，适用于乳粉中维生素 C 检测。
［关键词］ 乳粉； 维生素 C； 高效液相色谱
［中图分类号］ O657． 7 + 2
维生素 C 是一种水溶性维生素，是人体必需营养素，严重 缺乏会导致坏血 病，因 此 它 又 被 称 为 抗 坏 血 酸。 人 体 无 法 对 维生素 C 进行合成，只能通过食物摄取。婴幼儿配方奶粉中 的维生素对婴幼 儿 的 健 康 成 长 尤 为 重 要，尤 其 对 无 法 进 行 母 乳喂养、将配方奶粉作为主要营养来源的婴儿而言。
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个月。临用前用 3% 偏磷酸水溶液将标准贮备溶液逐级稀释 得到的 浓 度 为 0． 5 mg / L、1． 0 mg / L、2． 0 mg / L、5． 0 mg / L、 10 mg / L的标准工作溶液。 1． 4 色谱条件
色谱柱： Agilent TC － C18 色谱柱，（ 250 × 4． 6 mm，5 μm） ； 流动 相： 0． 05 mol / L 磷 酸 二 氢 钾 （ pH = 2． 5 ） ； 流 速： 1． 0 ml / min； 柱温： 35℃ ； 进样量： 10 μl； 检测波长： 240 nm。 1． 5 样品处理
精 密 称 取 50 mg （ 精 确 到 0． 1 mg） 抗 坏 血 酸 标 准 品 于 100 ml容量瓶中，以 3% 偏磷酸水溶液定容至刻度，配成标准 贮备溶液浓度为 500 mg / L。置于 4℃ 冰箱避光保存，保存期 1
中国卫生检验杂志 2011 年 11 月 第 21 卷 第 11 期 Chinese Journal of Health Laboratory Technology，Nov 2011； Vol 21 No 11
维生素 C 的为水溶性化合物，一般采用水相提取，兼顾维 生素 C 分子中的二烯醇基具有极强的还原性，易氧化为脱氢 抗坏血酸，本实验 采 用 二 硫 苏 糖 醇 将 氧 化 型 的 脱 氢 抗 坏 血 酸 还原为还原型抗坏血酸，测定样品中维生素 C 的总量更准确。 维生素 C 在酸性条件稳定，因此选用酸溶液提取。实验比较 草酸溶液，偏磷酸 溶 液 和 乙 酸 溶 液 的 提 取 效 果 和 沉 淀 蛋 白 能 力，结果表明 1% 乙酸溶液和 3% 偏磷酸溶液的提取和沉淀蛋 白的效果好，兼顾维生素 C 稳定性试验结果，其在 3% 偏磷酸 溶液中最为稳定，因此本方法选择 3% 偏磷酸溶液作为提取溶 剂。 2． 3 净化条件的优化
称取 1． 0 g 试样于 50 ml 具塞塑料离心管中，加入 1． 0 ml 20 mg / ml 二硫苏糖醇，置暗处反应半小时，取出加入 3% 偏磷 酸水溶液溶解并定容至 10 ml，涡旋混匀 1 min，置水平往复振 荡器上振荡或超声波水浴中超声提取 10 min，取出，加入 5 ml 正己烷涡旋混匀 30 s，以不低于 4000 r / min 离心 5 min，下层水 相过 0． 45 μm 水相滤膜后，供液相色谱测定。
（ 广东出入境检验检疫技术中心，广州 510623）
［摘要］ 目的： 建立高效液相色谱法测定乳粉中维生素 C 的含量的分析方法。方法： 样品用 3% 偏磷酸溶液提取，正己
烷脱脂净化，用高效液相色谱仪（ C18 柱） 分析，流动相为 0． 05 mol / L 磷酸二氢钾（ pH = 2． 5） ，流速 1． 0 ml / min，二极管阵 列检测器紫外检测波长为 240 nm，维生素 C 以光谱图和保留时间定性，外标法峰面积定量。结果： 乳粉样品在 5 mg / kg ～
［基金项目］ 广东省科技计划项目（ 2009B050700034） ； 中国检验 检疫科学院计划项目（ 2009JK011）
［作者简介］ 李为鹏（ 1986 － ） ，男，学士，助理工程师，主要从事 食品添加剂检测研究。
* 通讯联系人，E － mail： linhaidangz@ yahoo． com． cn
脂肪的净化分离条件进行优化，从而建立简便、有效可行的分 析方法，适用于日常乳粉中维生素 C 的检测，同时本文对 pH 值影响维生素 C 溶液稳定性进行深入探讨。
1 材料与方法 1． 1 材料与试剂
抗坏血酸标准品（ 纯度大于 99% ） Sigma 公司； 二硫苏糖 醇（ 纯度大于 99% ） Sigma 公司； 甲醇（ 色谱纯） ； 正己烷、磷酸 二氢钾、偏磷酸、乙酸（ 分析纯） 广州分析试剂厂； 超纯水（ 由 Mill － Q 纯水器系统制得） 。 1． 2 仪器与设备
2 结果与讨论 2． 1 标准溶液稳定性
维生素 C 溶液不稳定，我们研究表明其在水溶液中的稳 定性受 pH 值的影响很大。配制不同 pH 值的标准溶液，观察 其响应值与测定时间关系，结果表明维生素 C 的标准工作液 （ 10 mg / L） 在 pH ＜ 2 的偏磷酸溶液和 pH = 2 的 1% 乙酸溶液 中 6 h 之内稳定，几乎不 降 解，24 h 后 测 定 分 别 降 低 8% 和 26% ，； 在 pH = 3 水 溶 液 中 6h 降 解 32% ，24 h 后 测 定 降 解 94% ； pH = 4 和 pH = 6 溶液中 2 h 分别降解 52% 和 58% ，24 h 后测定均降解 100% 。 2． 2 提取溶液的选择
由于乳粉中 含 有 脂 肪，需 要 脱 脂 步 骤。 在 水 相 提 取 溶 剂 中加入正己烷，液 液 分 配 脱 脂，可 除 去 油 溶 性 的 脂 类 杂 质，而 极性物质维生素 C 则仍在水相中，达到净化的效果。 2． 4 色谱条件的优化
维生素 C 是极性化合物，在普通的反相色谱 C18 柱上保留 不强，一般使用离子对试剂来增加在 C18 柱上的保留。本实验 考虑维生素 C 为酸性化合物，增加流动相的酸度，在反相色谱 C18 柱上更好地保留。试验纯水、0． 05 mol / L 磷酸二氢钾（ pH = 4） 和 0． 05 mol / L 磷酸二氢钾（ pH = 2． 5） 作为流动相的色谱 分离效果，结果表明，纯水、0． 05 mol / L 磷酸二氢钾（ pH = 4） 出 峰太快且峰形不佳，采用 100% 0． 05 mol / L 磷酸二氢钾（ pH = 2． 5） 缓冲溶液作为流动相，峰形好。色谱柱需选择具有较低 的碳载量，同时进行了完全封端的色谱柱，这类色谱柱适合高 水相流动相的应用。使用 Ultimate AQ － C18 、Agilent TC － C18 、 Ecosil － C18 等水相色谱柱进行试验，结果表明采用 0． 05 mol / L
［Abstract］ Objective： To develop a high performance liquid chromatographic （ HPLC） method for the determination of vitamin C in milk powder． Methods： Sample was extracted with 3% metaphosphate acid solution，and the extract was then treated with n － hexane for the removal of lipids prior to HPLC analysis using a mobile phase of 0． 05 mol / L potassium dihydrogen phosphate solution （ pH = 2． 5） at a flow rate of 1． 0 ml / min with PDA detection at the 240 nm． Vitamine C was affirmed according to PDA spectrogram and retention time and quantified by peak area with external standard method． Results： The recoveries of the method spiked at 3 levels （ 5 mg / kg，50 mg / kg and 100 mg / kg） were within the range of 84． 6% ～ 108% ，with RSDs ranging from 3． 96% to 7． 81% ． The detection limit of the method was 5 mg / kg． Conclusion： The method is practical，accurate and suitable for the determination of vitamin C in milk powder． ［Key words］ Milk powder； Vitamin C； High performance liquid chromatography （ HPLC）
高效液相色谱仪（ 配有岛津 LC 20AD 泵，SIL 20AC 自动进 源自文库器，SPD M20A 二 极 管 阵 列 检 测 器、LC solution 色 谱 工 作 站） ； 超声波水浴（ 博励行仪器公司） ； 高速冷冻离心机（ 德国 Sigma 公司） ； 涡旋振荡器（ 德国 Heidolph 公司） ； 水平往复振荡 器（ 德国 IKA 公司） 。 1． 3 标准工作液的配制