藻蓝蛋白的分离与纯化 实验报告 开放性试验
钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特研究
钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特*研究
为发展新型海洋*物,采用SephacrylS-200凝胶层析和羟基*灰石柱层析对人工养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行了分离和纯化,得到了藻蓝蛋白纯品.测定了藻蓝蛋白的氨基*组成和含量.藻蓝蛋白的紫外、可见吸收光谱表明其最大特征吸收波长为278,360,620nm.得到的藻蓝蛋白经等电聚焦显示为一条带,其等电点为pH＝4.3.还测量了藻蓝蛋白红外吸收光谱.研究所获得的藻蓝蛋白为后续开展临床应用提供了可靠的样品.
投诉
地木耳中藻蓝蛋白的分离与纯化
将上 加人固体 ( 助 多 清液 N 0准之达 %饱和， 搅 5 2 充分 拌， 静置30而n，1侧 9下冷冻离心30 i ，弃去离心管底 x幻 mn 部沉淀。 上清液中 继续加人 (N 多 使之达到 %饱和， ) 4 H o ’ 5 充分 搅拌， Z ， 静置 然后在1以 9下离心3腼i ， b xx〕 n 弃去上清 液， 沉淀即 蓝蛋白 ( 一 y o ya i ， ) 和 蓝蛋白 为藻 C Pcc nn P h C 别藻
1.2 3 盐析 .
层析 (HA层析) ， 用磷酸盐缓冲液洗脱 (PBS 后， ) 得到了 藻蓝蛋白 (P ) 和别藻蓝蛋白 (A c ) 的洗脱峰。洗脱的 c P 顺序为藻蓝蛋白 在前， 别藻蓝蛋白 在后。
1.3 纯度鉴定
收稿日期: 20 8刁3一 0 0 2 作者简介: 李三相 ( 1 7卜) ， 9 男， 甘肃静宁人，天水师范学院生命科学与化学学院讲师， 硕士。
A0 ycn A ( 1 户 o y in， ) 的 合 。 淀 00 m讥的 酸 c c P 混 物 沉 用1 o 磷 .
缓冲液(P S) 溶解( 含0.02mol NaCI及0.( lmol EDTA) ， B L l ) X L l
定溶至一定体积， 加人固体 (NH4 多 使其浓度达2 %， ) o ’ 6 充 分搅拌， 印 in， 卫 静置 m 10以〕 9离心10m 弃去沉淀。 in， 继 续加人 (N坳 多 达3 %饱和，静置Z 仪 〕 . 0 5 h，1 众9下离心 0 n 1 mi ，沉淀即为藻蓝蛋白 (P ) 。用同样的方法，再以 C
液 (分 10、 50、 0 、 o lllm 别为 20: 1 Z o泥， 人 o 比并加 0.lm
N l 梯度洗 洗脱速度为 sm ， c a ) 脱， . / 4 l 分步收集洗 h 脱液， 每
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-2
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-23.结果分析:实验测得的藻蓝蛋白纯度只有0.509，比较我们班其他组的结果相差不算太大，但其他班有的组测得藻蓝蛋白得纯度可达到 1.7左右，相对于这个纯度，我们所提取得藻蓝蛋白纯度时偏低的，影响藻蓝蛋白纯度的原因主要有以下几个：1)冻融次数:本实验时采用冻融法破碎细胞，冻融法破碎细胞主要是因为藻体在冻结过程中，细胞内外的液态水形成冰晶体，造成体积膨大，对藻体细胞壁和细胞膜产生破坏作用，使其通透性加大，内容物流出。
藻体冻结过程中首先是从最容易生成细小冰晶体的地方开始，然后冰晶体逐渐变大，向四周扩展，将距这些地方比较近的细胞壁和细胞膜胀破，压破。
每次冻融最容易生成细小冰晶体的地方是不一样的，即在细胞内外形成冰晶的部位是不同的，这样就能对细胞不同部位的细胞壁和细胞膜产生破坏，因而多次冻融能使破碎效果提高。
冻融时间增加随能使冰晶体变大，但由于受细胞内外水分含量的限制，冰晶的长大使有限度的，因而对细胞壁和细胞膜破坏只是在原有基础上的破坏，破坏区域较少，效果较差，所以冻融时间对冻融效果影响不大。
可见，在冻融法中次数对藻蓝蛋白得率得影响比时间对它得影响大，多次反复冻融的细胞破碎效果比较好。
我们自己只冻融了一次，其余是老师整体冻融的，所以我们冻融方面应与其他组没有多大区别。
2)不同饱和度硫酸铵的盐析效果：实验过程中，饱和度在20％时，没有明显的沉淀，查资料得知，当饱和度在25％以下时，没有明显的沉淀，在25％以上后，随着硫酸铵饱和度的增加，提取率逐步升高。
从纯度看，随着饱和度的升高，纯度先降后升。
实验测得的结果偏低，可能是加入硫酸铵过程中，随着饱和度的增大，杂蛋白，藻红蛋白和别藻蓝蛋白沉淀出的量都在增大，藻蓝蛋白所占的比例减小，所以纯度减小。
由于我们过柱时取的样不是我们组的，所以无法考证是这两种原因引起我们结果偏低，只能说这两种原因对我们所得的藻蓝蛋白纯度会有影响。
藻蛋白提取实验报告
一、实验目的本实验旨在通过学习并掌握藻蛋白的提取方法，了解不同提取方法对藻蛋白提取效果的影响，并对提取得到的藻蛋白进行初步的纯化及鉴定。
二、实验原理藻蛋白主要存在于藻类植物中，如螺旋藻、小球藻等。
藻蛋白的提取方法主要有物理法、化学法和生物法。
本实验采用物理法中的冻融法提取藻蛋白，该方法操作简单，对藻类植物损伤小，提取效率较高。
三、实验材料与仪器材料：1. 螺旋藻粉2. 蒸馏水3. 0.1mol/L的KOH溶液4. 0.1mol/L的HCl溶液5. 95%乙醇6. 无水乙醇7. 丙酮8. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）仪器：1. 电子天平2. 磁力搅拌器3. 超声波清洗器4. 高速离心机5. 蒸发皿6. 烧杯7. 离心管8. 吸管9. 滤纸四、实验步骤1. 藻蛋白粗提1. 称取10g螺旋藻粉，置于100ml离心管中。
2. 加入50ml蒸馏水，充分搅拌，使螺旋藻粉充分溶解。
3. 将混合液置于冰浴中冷却，每隔30分钟搅拌一次，共冷却2小时。
4. 冷却完成后，以4000r/min的转速离心10分钟，收集上清液。
5. 将上清液转移至烧杯中，加入95%乙醇，使蛋白质沉淀，静置30分钟。
6. 以4000r/min的转速离心10分钟，收集沉淀。
7. 将沉淀用蒸馏水洗涤三次，以去除杂质。
2. 藻蛋白纯化1. 将洗涤后的沉淀溶于适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中。
2. 将混合液通过DEAE纤维素层析柱，用磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱。
3. 收集含有藻蛋白的洗脱液，经浓缩、冷冻干燥后得到藻蛋白。
五、实验结果与分析1. 藻蛋白粗提通过冻融法提取的藻蛋白，在95%乙醇中沉淀，经离心后得到淡蓝色沉淀，表明藻蛋白提取成功。
2. 藻蛋白纯化通过DEAE纤维素层析柱纯化后，得到的藻蛋白在紫外-可见光谱上呈现出典型的藻蓝蛋白特征峰，表明纯化成功。
六、实验结论本实验采用冻融法和DEAE纤维素层析柱法成功提取并纯化了藻蛋白。
实验结果表明，冻融法是一种简单、高效的藻蛋白提取方法，而DEAE纤维素层析柱法可以进一步纯化藻蛋白，提高其纯度。
钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特性研究
ISSN 100020054CN 1122223 N 清华大学学报(自然科学版)J T singhua U niv (Sci &Tech ),1999年第39卷第6期1999,V o l .39,N o .66 3520～22钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特性研究3殷 钢, 刘 铮, 刘 飞, 李 琛, 丁富新, 袁乃驹清华大学化学工程系,北京100084 收稿日期:1998208206 第一作者:男,1973年生,博士研究生 3基金项目:国家“九五”科技攻关项目,962C 03204205文 摘 为发展新型海洋药物,采用Sephacryl S 2200凝胶层析和羟基磷灰石柱层析对人工养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行了分离和纯化,得到了藻蓝蛋白纯品。
测定了藻蓝蛋白的氨基酸组成和含量。
藻蓝蛋白的紫外、可见吸收光谱表明其最大特征吸收波长为278,360,620nm 。
得到的藻蓝蛋白经等电聚焦显示为一条带,其等电点为pH =4.3。
还测量了藻蓝蛋白红外吸收光谱。
研究所获得的藻蓝蛋白为后续开展临床应用提供了可靠的样品。
关键词 钝顶螺旋藻;藻蓝蛋白;分离;纯化分类号 Q 51 螺旋藻是一种丝状多细胞螺旋形藻类生物,藻体由于含有藻蓝素而使外观呈蓝绿色。
现已发现的螺旋藻共有36个个种,多数为淡水种。
它含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、叶绿素、Β2胡萝卜素及多糖类物质,是人类理想的食物及药物资源[1]。
目前用于工厂化生产的主要是钝顶螺旋藻和极大螺旋藻。
螺旋藻作为新型药物资源成为当前海洋药物研究的焦点之一。
螺旋藻中含有丰富的藻胆蛋白,藻胆蛋白中又包含藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白以及藻红蛋白等蛋白。
藻蓝蛋白是螺旋藻中重要的捕光色素蛋白,它以近乎100%的高效率把光能优先地传递给光系统 [2]。
研究表明,藻蓝蛋白具有提高人体免疫力,促进动物血细胞再生,抑制某些癌细胞等作用[3]。
临床实验证明藻蓝蛋白—铜激光对大肠癌细胞株有很强的杀伤效应[4],同时藻蓝蛋白还是一种无毒、无副作用的理想光敏剂[5]。
万东华-藻蛋白的分离纯化及光谱性质研究
藻蛋白的分离纯化及光谱性质研究Isolation, purification of phycobiliprotein from Porphyra and itsspectroscopic properties一、实验目的和要求1. 了解藻蛋白的生理意义和功能，藻蛋白一般的纯化方法；2. 掌握盐析和凝胶层析的实验技术；3. 掌握紫外可见光谱仪检测蛋白的方法；4. 了解藻蛋白的荧光发射特性。
二、实验原理藻蛋白是藻类特有的捕光色素蛋白，参与光合作用的能量吸收和传递，主要存在于红藻、蓝绿藻和隐藻的藻胆体中。
藻蛋白主要包括藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白三类。
藻蛋白在藻类中的含量可达细胞干重的25%～28%, 除了作为荧光探针用于医学诊断、免疫学和细胞学研究之外，藻胆蛋白具有抗氧化、提高机体免疫力和抗肿瘤等重要药理功能，在功能食品、化妆品和药品中有广泛的应用前景。
我国藻类资源十分丰富，是世界上最大的紫菜生产大国，是获取藻蛋白的理想资源。
选用紫菜提取藻红蛋白，具有成本低、得率高的优点，具有较好的利用价值。
1．蛋白质的盐析沉淀盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。
由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同。
2．葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。
单个凝胶珠本身象“筛子”。
不同类型凝胶的筛孔的大小不同。
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。
藻蓝蛋白 实验报告
藻蓝蛋白的分离与纯化姓名：郭均学院：食品与生物工程班级：食安 09-2学号：200906041069藻蓝蛋白的分离与纯化一、实验目的和要求1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白的一般提取和纯化的方法；2、掌握蛋白含量测定方法；3、掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的分析技术。
二、实验原理藻蓝蛋白（PC）是一类普遍存在于藻蓝蛋白中的光合辅助色素，也是一种天天然色素蛋白，具有水溶性，可用作视频着色剂。
此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。
藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。
另外它还有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。
利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸收水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可以中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。
由于各种蛋白颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同。
研究表明可用25%硫酸铵饱和度沉淀除去杂质，55%硫酸铵沉淀藻蓝蛋白。
盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。
最常用脱盐的方法是透析。
蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，故不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂志透析掉。
蛋白质含量测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等），本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm变为595nm，在一定范围内，蛋白质含量与595nm处吸光值成正比。
离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM纤维素），阴离子交换剂有弱碱性的二乙胺基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。
用含有0.25mg的藻蓝蛋白处理培养
用含有0.25mg的藻蓝蛋白处理培养
藻蓝蛋白（Phycocyanin）是一种具有高水溶性的复合蛋白，来源于藻类，具有蓝色
的色素，用于食品和药物中的添加剂，在食品领域中被广泛使用，比如作为细胞壁保护剂，用于抑制酒精的消化酶的活性和酒精的分解。
本次试验将使用含有0.25mg的藻蓝蛋白经
0.2% NaCl机械悬浊液处理培养。
要开始进行本次实验，首先需要准备一些必要的物品，比如0.2% NaCl机械悬浊液、0.25mg藻蓝蛋白样品、实验室消毒药水和PH值仪。
然后将0.2% NaCl机械悬浊液倒入实
验仪器中，配制含有0.25mg藻蓝蛋白的溶液。
此时将一定量的PH值仪测定溶液的PH，保证溶液处于正常PH范围，确保溶液的有效性。
接下来要开始进行培养。
在培养过程中，需要控制向培养液中添加的藻蓝蛋白的比例，以保证培养的细胞的繁殖和生长，并避免可能带来的不利影响。
因此，在添加藻蓝蛋白的
过程中，应使用比例微量秤进行精准控制，以确保藻蓝蛋白的比例达到精确的要求。
此外，藻蓝蛋白是一种易受热及溶解的物质。
因此，在进行培养液处理时，需要注意
控制处理温度，以防止藻蓝蛋白失去其活性，破坏培养细胞的形态和结构。
最后，在培养过程结束后，需要对处理的培养物进行核酸免疫灭活处理，以确保实验
室内的安全性。
然后要仔细观察处理后的培养物，以考察藻蓝蛋白对其形态和结构的影响
程度，检查处理过程中有无不良反应。
有了上述步骤，我们便可以完成使用含有0.25mg
的藻蓝蛋白处理培养的试验。
聚球藻7002藻蓝蛋白的分离纯化研究
关键词 ： 聚球藻 ７ ０ ０ ２ ， 藻蓝蛋白， 反复冻融， 响应面优化 ， 分 离纯化
Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｎ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｃ—ｐ ｈ ｙ ｃ Ｏ Ｃ ｙ ａ ｎ Ｉ ｎ ｉ ｎ Ｓ ｙ ｎ ｅ ｃ ｈ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ｓ ｐ ． Ｐ ＣＣ ７ ０ ０ ２
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高纯度藻蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究
human and rat CN TF.J Neurochem,1991,57(3):1003～10125 咸海青,范 明,甘思德,等(Xian H Q,Fan M,G an S D, et al).人睫状神经营养因子的原核表达纯化及其生物效应.中国应用生理学杂志(Chinese J Appli Phsiol),1996,12(1): 21～246 Daniel M B,Stuart J E.Protein Methods.New Y ork:Wiley2Liss Press,1991.50～1607 Marston F A O,Freedman F B.Recovery and reaction of recombi2 nant proteins.Biochem Soc Trans,1988,16(1):101～1038 Marston F A O,Angal S,Lowe P A,et al.Scale2up of the recovery and reaction of recombinant proteins.Biochem Soc Trans, 1988,16(1):112～1159 Doonan S,Walter J M.Downstream processing of protein products.Biochem Soc Trans,1990,18(1):231～234Study of R enaturation of R ecombinant H uman Ciliary N eurotrophic F actor Expressed in E.coli. XIAN Hai2Qing,FAN Ming,WU Yan(Instit ute of B asic Medical Science,A cademy of M ilitary Medical Sciences,Beiji ng100850,China);Q IU Z ong2Y in(Medical U niversity of Chongqi ng, Chongqi ng400046,China).Abstract Renaturation of human cilinary neurotrophic factor expressed in recombinant bacteria,by gel filitration chromatograph,was studied.It was showed that the renaturation rate by this way was higher than that by dilution and dialy2 sis,and the protein was purified at the same time.It was a simple,rapid,good reproducibility and efficient procedure which can be used to produce ciliary neurotrophic factor in large scale.K ey w ords recombinant ciliary neurotrophic factor, renaturation,inclusion body高纯度藻蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究3王 勇 钱凯先董 强1)(浙江大学生物科学与技术系,杭州310027)(山东省医学科学院,济南250062)摘要 藻蓝蛋白(PC)具有特征性吸收光谱和荧光光谱,是一种新颖的荧光分子探针.为了获取高纯度PC,经过反复探索研究建立了Sephadex G2200、DEAE2SephadexA225、HA、Sephadex G2200的分离纯化程序。
藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)
藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)藻蓝蛋白(phycocyanin , PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素 ,能高效捕获光能。
其分子质量在 40 ku 左右 ,由α、β两个亚基组成 ,亚基分子质量都在 20 ku 左右。
肽链上共价结合 1 个开链的四吡咯环辅基 ,类似动物红细胞的血红素结构。
天然存在的藻蓝蛋白通常以六聚体(αβ) 6的形式存在。
与之相近的别藻蓝蛋白(Anthocyanin ,APC)为三聚体( αβ) 3 ,在 650 nm 处有最大吸收峰。
分离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 ,并发出紫色荧光 ,在波长620 nm 具有特异吸收峰 ,可用吸光度 A 620 / A 280表示其纯度。
因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。
藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光标记物。
一、教学目的通过藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。
整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。
有利于培养学生的学习兴趣。
二、实验方案1材料与方法1. 1 实验材料钝顶螺旋藻粉产自中国科学院武汉植物所 ,其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。
1. 2 分析方法1.2.1藻蓝蛋白浓度的测定方法一：【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138】用紫外分光光度计对粗提的藻蓝蛋白溶液进行全波段扫描, 可见藻蓝蛋白的特征吸收在620nm, 异藻蓝蛋白的特征吸收在:方法二：【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，Vol.28 No.3.11-14（2008）】 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。
混合异养螺旋藻中藻蓝蛋白的分离和纯化
混合异养螺旋藻中藻蓝蛋白的分离和纯化张义明;郭祀远;陈峰【期刊名称】《华南理工大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】1999(027)004【摘要】For phycocyanin separation and purification of Spirulina platensis, a method using fraction precipitation of ammonium sulphate, ion exchange and gel filtration chromatography was investigated. In fraction precipitation of ammonium sulphate, it was found that by adsorption spectra scan of precipitates, 300g/L ammonium sulphate solution could remove other proteins well while 500g/L and 650g/L ammonium sulphate solutions could separate c-phycocyanin and allophycocyanin well. After ion exchange chromatography and gel filtration chromatography, finally, the absorbance ratios, reflecting the purities of c-phycocyanin and allophycocyanin, reached 5.06 and 5.34 respectively.%为了从螺旋藻中分离和纯化藻蓝蛋白,研究了一种采用硫酸铵分步盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析的分离纯化方法.在硫酸铵分步盐析中,通过对沉淀物的吸收光谱扫描发现, 300g/L的硫酸铵溶液能很好除去杂蛋白,而500g/L和650g/L的硫酸铵溶液能较好分离c-藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白.经离子交换层析和凝胶过滤层析后,c-藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的反映纯度的吸收率分别达到5.06和5.34.【总页数】5页(P32-36)【作者】张义明;郭祀远;陈峰【作者单位】华南理工大学轻化工研究所,广州,510640;华南理工大学轻化工研究所,广州,510640;华南理工大学轻化工研究所,广州,510640【正文语种】中文【中图分类】Q949.221【相关文献】1.盐泽螺旋藻藻蓝蛋白的分离纯化 [J], 于光;马宇翔;张成武;李朝军2.螺旋藻藻蓝蛋白的分离纯化研究进展 [J], 徐长波;王巍杰3.多管藻中R-藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的分离纯化 [J], 王胜楠;刁海平;赵明日;孙力4.钝顶螺旋藻C—藻蓝蛋白和多管藻R—藻红蛋白的分离纯化及摩尔消光系数的… [J], 王广策;周百成5.螺旋藻直线型突变株(Sp-Dz)藻蓝蛋白的分离纯化及生物活性的研究 [J], 白凤霞;王飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
藻蓝蛋白的提取与纯化
螺旋藻粉提取藻蓝蛋白摘要：藻蓝蛋白是一种可用于配制化妆品及各种天然食品或荧光探针标记的多用途蛋白。
本实验旨在找出最适螺旋藻粉中提取藻蓝蛋白的工业提取工艺。
对藻蓝蛋白的提取，本课题组采用了反复冻融法、水提法、缓冲液法，以找出提取效率高，成本低的方法。
实验结果显示，反复冻融三次的藻蓝蛋白浓度A620/A280分别为：0.819/1.871、0.597/1.676、0.245/0.629;水提法三次的A620/280分别为：0.842/1.768、0.650/1.136、0.177/0.737;缓冲液提取三次的A620/A280分别为：1.040/2.102、0.260/0.630、0.052/0.247。
在蛋白质的分离时，采用两步盐析法，盐析前A620=1.143，A280=1.983；两步盐析后，A620=2.203，A280=1.492。
最后在纯化方法上选择了羟基磷灰石柱分离，得到蛋白样品A620=1.379，A280=0.528。
关键词：螺旋藻；藻蓝蛋白；二次盐析；柱分离介绍：藻蓝蛋白既是一种蛋白质，又是一种很好的天然食用色素，同时又是极好的保健食品。
藻蓝蛋白是自然界中少见的色素蛋白之一，不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。
藻蓝蛋白具有抗癌、促进血细胞再生、养护卵巢、促使人体内合成弹力蛋白等功效。
21世纪初，在欧美、日本等国，藻蓝蛋白广泛用作食品和化妆品的高级天然色素，并被制成生化药品。
因为藻蓝蛋白为胞内蛋白，所以细胞破碎技术是直接影响蛋白提取得率的关键因素之一。
藻蓝蛋白的提取一般有超声波、高压均质、反复冻融、水提法、缓冲液提法等【1】。
本实验通过反复冻融、水提法和缓冲液法对螺旋藻细胞进行破碎提取藻蓝蛋白，对各条件下得到的蛋白溶出率进行了比较分析，确定了各条件下蛋白提取的最佳条件。
在藻蓝蛋白的分离时，主要是把蛋白质与提取液中其他物质分离。
可利用蛋白质的盐析【2】，和调节PH使蛋白变性等，使蛋白质从提取液中分离出来；最后，再把藻蓝蛋白从杂蛋白中分离出来，常用的方法有柱分离法等【3】。
太湖蓝藻藻蓝蛋白的提取及纯化
太 湖 蓝 藻 藻 蓝 蛋 白 的 提 取 及 纯 化
韩士群 李辉 东 ， 严 少华 夏 明珠 ， ，
（ ．江苏省农业科学 院农 业资源与环境研究所 ， １ 江苏 南京 ２０ １ １０４；２ 南京理工 大学 工业 化学研究 所 ， ． 江苏 南京 ２ ０ １ ） １０ ４
摘要 ： 为利 用太湖打捞蓝藻 的蛋 白质 资源 ， 用冻融 破壁 、 采 絮凝 、 析 、 析 、 水相萃取 等方 法制备荧光 试 盐 透 双
ＨＡＮ ｉｑ ， ＬＩＨｕ — ｏ ｇ ’ Ｓｈ ． ｕｎ ｉｄ ｎ ， ＹＡＮ ｈ ｏ ｈ ， ＸＩ Ｍｉ ｇ ｚ Ｓ ａ — ｕａ Ａ ｎ —ｈｕ
（ ．ｎｔｕ ｇｉ ｌ ｒｌ ｅ ｕｃ ｎ ｎｉ ｎ ｅｔｌ ｃ ｎｅ， ｉｎ ｓ Ａ ａ ｅ ｙｏＡ ｒ ｕｔｒｌ ｃ ｎｅ， ａｊ ｇ２ ０ １ ， ｈｎ １ Ｉｓｔｔ ｏ ｒ ｕｔ ａ Ｒ ｓ ｒ ａ ｄＥ ｖ ｏｍ ｎａ ｉ ｃｓ Ｊａ ｇｕ ｃｄｍ ｆ ｇｉ ｌ ａ ｉ ｃｓ Ｎ ｎｉ １０ ４ Ｃ ｉ ｉ ｅ ｆＡ ｃ ｕ ｏ ｅ ｒ Ｓｅ ｃ ｕ Ｓｅ ｎ ａ；２ Ｉｓ ｔｔｏ Ｉｄｓ ．ｎｔｕｅ ｎ ｕ－ ｉ ｆ ｔａ ｈｍｉｒ，Ｎ ｎｎ ｎｖｒｔ Ｓｉ ｃ Ｔｃｎｌｇ ， ａ ｎ １０４，Ｃ ｉ ｒ ｌ ｅ ｓｙ ａｊ ｇ Ｕ ｉ ｓｙｏ ｃ ｎｅ＆ ｅｈ ｏ ｙ Ｎ ｇ２ ０ １ ｉ Ｃ ｔ ｉ ｅｉ ｆ ｅ ｏ ｈｎ ａ）
ａ ｊｓ ｄｔ ０ ９ ％ ．Ａ ｅ ｏ ｃ ｌ ｉ ｙ７ ５ ｇ Ｌ ｐ ｌ ｒ ｌｍ ｎ ｍ ｃ ｌｒ ｅ ｔｅ ｐ ｙ ｏ ｙ ｎｎ ｗ ｔ ｔｅ ｐ ｒ ｙ（ ６ ／ ｄｕｔ ． ５ ｅ ｏ ｔ ｆ ｆ ｒ ｃ ｕ ｔ ｎ ｂ ． ／ ｏ ｍｅｉ ａ ｉｕ ｈｏｉ ， ｈ ｈ ｃｃ ａ ｉ ｉ ｈ ｕｉ Ａ ２ ｌ ａｏ ｙ ｃ ｕ ｄ ｈ ｔ ０
鱼腥藻藻蓝蛋白的提取_分离纯化和抑菌研究
藻蓝蛋白是一种深蓝色粉末，色泽美观。它既是一种蛋 白质，又是一种极好的天然食用色素，同时又是良好的保健 食品。科学研究表明，藻蓝蛋白具有刺激红细胞集落生成， 类似红细胞生成素的作用； Schwartz 等［1］发现，螺旋藻藻蓝蛋 白对癌细胞有抑制作用； 蔡心涵等［2］研究了藻蓝蛋白对激光 疗法的增敏作用； 张成武等［3］报道了螺旋藻藻蓝蛋白对小鼠 急性放射病的防护作用； 李冰等［4］研究发现，藻蓝蛋白在抗 肿瘤和提高机体免疫力方面有明显疗效。目前藻蓝蛋白的 产品绝大部分来自螺旋藻，由于螺旋藻需在碱性环境（ pH 11） 下生产，在培养过程中需添加大量 NaHCO3 ，不仅增加成 本，同时产品中残留的 NaHCO3 不易去除干净，不适合作食 品添加剂及药物等使用。同时，生产中螺旋藻藻体要清洗 3 遍才能用于提取，因此培养基和清洗液的排放也会对环境造 成污染［5］。
OD620 nm / OD280 nm 0． 387 6 0． 293 6 0． 268 5 0． 194 0
2． 3 不同冷冻时间对鱼腥藻藻蓝蛋白提取的影响 由表 2 可知，冷冻时间的长短对藻蓝蛋白的提取有一定的影响，冷 冻 60 min 时提取的藻蓝蛋白颜色较深，比活力较好。
表 2 不同冷冻时间对鱼腥藻藻蓝蛋白吸光度的影响
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
冷冻时间∥min 30 60 90 120
OD280 nm 1． 084 1． 130 1． 201 1． 207
OD620 nm 0． 325 0． 354 0． 342 0． 328
摘要 ［目的］对鱼腥藻藻蓝蛋白的提取进行优化，并对藻蓝蛋白粗品进行分离纯化、凝胶电泳以及抑菌作用研究。［方法］采用反复冻 融法提取藻蓝蛋白，液相色谱分离纯化藻蓝蛋白，SDS-PAGE 电泳分析蛋白质成分，并利用 96 孔板法培养、酶标仪浓度检测，进行抑菌作 用研究。［结果］藻蓝蛋白提取的最佳条件为固液比 1∶ 1 g / ml，冷冻时间 60 min，硫酸铵饱和度为 60% 。藻蓝蛋白的最大吸收光是 620 nm。高效液相色谱分离得到 3 种蛋白质，标记为 PC-1、PC-2、PC-3。SDS-PAGE 电泳可知，PC-1 和 PC-2 的分子量在 14 ～ 18 kD。PC-2 对 苏云金芽孢杆菌和藤黄叠球菌有较弱的抑菌作用。［结论］为鱼腥藻藻蓝蛋白的提取、纯化和性质研究提供了试验依据。 关键词 鱼腥藻； 藻蓝蛋白； 液相色谱； SDS-PAGE 电泳； 抑菌 中图分类号 S 986 文献标识码 A 文章编号 0517 － 6611（ 2012） 08 － 04866 － 02
螺旋藻藻蓝蛋白的提取实验报告
螺旋藻藻蓝蛋白的提取实验报告嘿，大家好，今天我来跟你们聊聊螺旋藻和它的藻蓝蛋白，听起来有点复杂，其实不然！螺旋藻，这个名字一听就像是外星来的植物，其实它是一种超级食物，充满了营养，特别是它的藻蓝蛋白，简直是宝贝中的宝贝。
你知道吗？这玩意儿对我们的身体可是有大大的好处，像是增强免疫力、抗氧化、提高能量等等，简直是个“万金油”。
所以今天的任务就是提取这个神奇的藻蓝蛋白，准备好了吗？我们得准备好材料和工具，像是新鲜的螺旋藻、一些化学试剂和各种器具，光是想想就觉得兴奋。
把螺旋藻弄到手了，先得清洗干净，把那些杂质和污垢统统甩掉。
你想啊，谁想在实验中弄得一团糟呢？洗干净之后，我们就可以开始提取了。
这个过程可有意思了，像是做魔术一样，得用一些化学试剂。
我们要把螺旋藻和这些试剂混合，像是搅拌一锅美味的汤，看看能否从中提取出藻蓝蛋白。
在这个过程中，可不能马虎，一定要注意比例，太多或太少都会影响结果。
咕噜咕噜，搅拌得差不多的时候，就得让它静置一会儿。
你知道，这个时候就像是让面团醒发，静静等待它的变化。
这时候我们可以喝杯水，或者聊聊天，顺便期待一下最终的成果。
接下来就是过滤的环节，把混合物过筛，分离出固体和液体。
嘿，过滤的过程就像是在筛选宝藏，液体部分就是我们要的藻蓝蛋白啦！这时候得小心翼翼，不然可就把好东西给漏掉了。
过滤完了，我们得到了一些漂亮的液体，颜色鲜艳得像阳光下的蓝天，真是赏心悦目。
再来就是浓缩了，得把液体加热，去掉一些多余的水分。
这一步就像是在熬汤，慢慢浓缩，直到它的味道和色泽都变得更为浓厚。
浓缩完成后，我们得把它冷却，冷却的过程就像是在给它“降温”，让它更加稳定。
哇，真的是越看越有成就感，想想自己亲手提取的蛋白质，心里美滋滋的。
最后一步，就是检测一下这个藻蓝蛋白的质量。
我们得做些实验，看看它的浓度和活性，确保它真的是好东西。
哦，这时候就像是为自己的作品打分，心里小鹿乱撞。
结果出来后，哇，果然不负我所望，藻蓝蛋白的质量超赞，简直就像是发现了新大陆，心里那个高兴啊！整个提取过程，虽然有些繁琐，但每一步都充满乐趣。
蓝隐藻藻蓝蛋白的分离、纯化及性质研究
２１ 年 １ ０１ Ｏ月
烟 台大 学 学报 （ 自然 科学 与工 程版 ）
Ｊｕｎｌ ｆ ａｔｉ ｎｖｒ ｔ Ｎ ｔｒ ｃ ｎｅａｄＥ ｇｎｅｉ ｄｔ ｎ ｏｒａ ｏ ｎａ Ｕ ｉ ｓｙ（ ａ ａ Ｓｉ ｃ ｎ ｎｉｅｒ ｇＥ ｉｏ ） Ｙ ｅｉ ｕｌ ｅ ｎ ｉ
中藻 胆蛋 白比较 特殊 ： 种 隐 藻 只含 有 一 种 藻胆 一 蛋 白 ， Ｐ ， Ｐ 不含 Ａ Ｃ； 或 Ｃ 或 Ｅ， Ｐ 隐藻 藻 胆蛋 白不像 红 、 藻藻 胆蛋 白那 样组 装 成 藻 胆 体 并 伸 展 在类 蓝
敏治疗等方面 ， 更具有广泛的应用前景 ［ ． ６ ］
目前发 现 的 隐 藻藻 胆 蛋 白有 大约 ６种 ， 括 包
三聚体或六聚体形式 ， 更易作为荧光探针进入细 胞内， 在分子标记 、 示踪 、 临床检测 、 分析及肿瘤光
收稿 日期 ： ０ ０ １—２ ２ １—０ １
基金项 目：国家 自然科学基金资助项 目（０ ７ ０ ３ ． ４ ９６ ８ ） 作者简介 ：张允允（ ９ ３ ） 女 ， １８ 一 ， 山东济 宁人 ， 硕士研究生 ， 研究方 向： 海洋 生物学 ； 通信作者 ： 陈敏 （ｈｎ ｃ ｃｅ ｍ ｌ ｍ＠１３ ６ ｃｍ） 教授 ， ｏ ， 博士．
Ｐ １ ， ３ Ｃ６ ２ ６ ０和 ６ ５ 以及 Ｐ ５ ５ ５ ５和 ５ ６ 文 ４， Ｅ４ ， ５ ６，
中选用 的蓝隐 藻 （ ｈｏｍ ｎｓ ｌｃｉｅ 中的 Ｐ Ｃ ｒ ｏａ ｐａｏ ） ｏ ｄ Ｃ属
于 Ｐ ６５型． ｃ一 ４ 以往纯化藻胆蛋 白多采用羟基磷 灰石柱的层析法 ， 本研究设计 了硫铵分级沉淀和 二次 分子筛 层析 分离 流程 ， 到 了纯化 的隐藻 得 Ｐ， Ｃ 并对其性 质作 了初 步的分析． 中性 Ｐ Ｇ 经 ＡＥ
R-藻蓝蛋白的分离纯化及抗食物过敏活性研究
R-藻蓝蛋白的分离纯化及抗食物过敏活性研究王有朝;曹敏杰;苏文金;张凌晶;毛海燕;时超岚;刘光明【摘要】为探究R-藻蓝蛋白抗过敏功效,以坛紫菜为原料,通过25％～ 35％硫酸铵盐析和DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 HR两步柱层析获得了高纯度的目的蛋白(A620/A280＞6.0).SDS-PAGE显示,该蛋白质由分子质量为17.7 ku和20.5 ku的两个亚基组成,紫外可见分光光度法测得其在620nm、555 nm有两个特征吸收峰,可确认其为R-藻蓝蛋白.热稳定性和pH值稳定性实验结果显示,R-藻蓝蛋白在低于35℃、pH=4.0～9.0条件下光谱性质相对稳定.动物实验结果表明,100 μg/mL高纯度R-藻蓝蛋白能够显著降低小鼠血清中IgE水平；细胞实验结果表明,40 μg/mL R-藻蓝蛋白能够降低细胞因子IL-4、IL-13的蛋白质分泌量；基因表达量分析结果显示,R-藻蓝蛋白能够降低IL-4在淋巴细胞中的表达量.可见,坛紫菜R-藻蓝蛋白通过促使CD4+T cell向TH1型转化发挥抗食物过敏活性.【期刊名称】《集美大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(018)004【总页数】8页(P253-260)【关键词】坛紫菜;R-藻蓝蛋白;抗过敏活性;食物过敏;原肌球蛋白【作者】王有朝;曹敏杰;苏文金;张凌晶;毛海燕;时超岚;刘光明【作者单位】集美大学生物工程学院,福建厦门361021;福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】R392.80 引言食物过敏大多是由IgE介导的I型超敏反应，常伴随有皮疹、腹泻和呕吐等症状，严重影响过敏人群的生活质量.在国内，水产品过敏患者数量占食物过敏人群总数的49.0%［1］，是食物过敏反应的主要诱因.从动植物中提取天然抗过敏活性物质，研究其对过敏患者免疫系统的调节作用，对水产食物过敏性疾病的预防与控制具有重要意义.目前，天然活性物质的抗过敏功效主要通过被动皮肤过敏反应、透明质酸酶抑制试验和组胺致小鼠足肿胀试验等方法［2-4］来进行评价，抗过敏活性物质对机体免疫系统调节作用研究较少.藻蓝蛋白是存在于红藻中的一种水溶性色素蛋白质，它不仅在光合作用中发挥重要的作用［5］，还能够抑制大鼠腹腔肥大细胞释放组胺［6］.坛紫菜(Porphyra haitanensis)是中国特有的可人工栽培的海藻，在福建沿海有大量种植.2010年，福建省坛紫菜产量约5×104t，在全国紫菜产量中占有较大比例［7］.坛紫菜因其味道鲜美、营养成分丰富深受消费者喜爱，目前主要用做汤料，而针对其活性成分的研究及相关产品的开发却较少.最近，有人报道，从红毛藻中提取到的R-藻蓝蛋白 (R-phycocyanin，RPC)具有调节免疫系统发挥抗过敏性哮喘的功效［8］.但是，坛紫菜中R-藻蓝蛋白对免疫系统的调节作用及抗水产食物过敏活性未见报道.根据之前预实验结果可知，R-藻蓝蛋白含量占坛紫菜干重的2.0%～3.0%，与红毛藻中R-藻蓝蛋白含量相近.而且，坛紫菜价格相对低廉并且产量远远高于红毛藻，故本文选用坛紫菜作为提取R-藻蓝蛋白的原材料，采用硫酸铵盐析结合柱层析技术，从坛紫菜中纯化得到高纯度R-藻蓝蛋白，并对其光谱稳定性做了初步分析，并利用甲壳类水产品中主要过敏原原肌球蛋白建立食物过敏动物实验模型，通过动物实验和细胞实验分析R-藻蓝蛋白的抗食物过敏功效.1 材料与方法1.1 材料与试剂坛紫菜购自厦门市集美菜市场;雌性BALB/c小鼠SPF级18只购自上海斯莱克实验动物有限公司;拟穴青蟹(Scylla paramamosian)原肌球蛋白由本实验室制备;弗氏佐剂购自德国Sigma公司;HRP标记的羊抗鼠IgE抗体购自美国Southern Biotech公司;小鼠淋巴细胞分离液购自深圳达科为生物技术有限公司;Trizol试剂购自德国Sigma公司;荧光定量PCR试剂盒购自天根生化科技有限公司;细胞因子检测试剂盒购自美国Pepro Tech公司;其他试剂均为国产化学纯或分析纯.1.2 仪器与设备高速冷冻离心机 (Beckman，美国);组织捣碎机 (Kinematica，瑞士);恒温水浴锅(Memmert，德国);凝胶成像仪 (Vilber lourmat，法国);荧光定量PCR仪 (ABI，美国);倒置紫外荧光显微镜(Olympus，日本);紫外可见吸收仪 (Perkin Elmer，美国);生物安全柜 (Baker，美国);酶标仪(Bio-Rad，美国);CO2培养箱 (Memmert，德国).1.3 目的蛋白的纯化与鉴定20 g坛紫菜剪成小块后经组织粉碎机粉碎，与400 mL磷酸缓冲液(PBS)(pH=7.0，20 mmol/L)混合，用组织捣碎机捣碎后反复冻融3～4次，绢布过滤获得上清液.所得上清液经20%～35%(体积分数)硫酸铵盐析后，4℃、8073 r/min离心20 min.沉淀溶于少量PBS中.溶解后样品上样于已用PBS(含0.15 mol/L NaCl)平衡过的Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱(1.5 cm×98 cm)，收集目的蛋白.将收集得到的样品于PBS中透析过夜.样品上样于已用PBS平衡过的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(1.5 cm×10 cm).经PBS(含50 mmol/L NaCl)流洗，20 mmol/L PBS(pH=5.6，含50 mmol/L NaCl)到150 mmol/L NaH2PO3(含200 mmol/L NaCl)梯度洗脱，收集目的蛋白进行分析.SDS-PAGE电泳分析:参照Laemmli的方法［9］，质量分数为12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE).银染色法分析纯化的目的蛋白.利用紫外可见吸收光谱检测法对目的蛋白进行鉴定.1.4 R-藻蓝蛋白的性质分析1.4.1 热稳定性的测定在30～60℃确定最适温度.不改变其他条件，测定不同温度下的光谱性质.在临界温度下，测定不同时间下的光谱性质.1.4.2 pH值稳定性的测定在pH=2.0～11.0测定pH值稳定性.所用缓冲液:100 mmol/L NaAc-HCl(pH=2.0)、100 mmol/L NaAc-HAc(pH=3.0～5.0)、100 mmol/LPBS(pH=6.0～7.0)、100 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0～9.0)、100 mmol/LNa2CO3-NaHCO3(pH=10.0～11.0).1.5 食物过敏小鼠模型的建立及血清IgE水平检测食物过敏小鼠模型建立方法参照Knight等［10］的方法，稍作修改.以BALB/c近交系雌性小鼠作为研究对象，利用甲壳类水产品主要过敏原原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)敏化小鼠，建立过敏动物模型.实验分为PBS阴性对照组、TM致敏组和TM+RPC实验组，每组6只.在0、24 d分别注射PBS、TM(20μg/只)和TM+RPC(100 μg/只)，小鼠经二次免疫后于第25 d处死，眼球采血，采集后的血液静置3 h后4000 r/min离心，吸取上层血清.小鼠血清IgE测定方法参考Dearman等［11］的方法，并作适当修改.纯化得到的TM用包被稀释液(50 mmol/L Na2CO3，130 mmol/L NaHCO3，3 mmol/L NaN3，pH=9.6)稀释到100 μg/mL，加入 96孔酶标板中4℃包被过夜.酶标板用TBST(20 mmol/L Tris-HCl buffer，pH=7.5，包含145 mmol/L NaCl)清洗5次后用5%(体积分数)脱脂奶37℃封闭2 h.再次用TBST清洗3次后，血清样品用1%(体积分数)脱脂奶1∶10稀释后加入到酶标板中，4℃孵育过夜.TBST洗板之后加入100 μL HRP标记的羊抗鼠IgE抗体，在37℃孵育2 h.洗板后加入TMB常温下显色15 min，之后加入2 mol/L H2SO4终止反应，酶标板中检测450 nm处的吸光度值.1.6 免疫细胞因子的蛋白质及基因水平检测PBS组、TM组和TM+RPC组小鼠在第二次腹腔注射3 d后处死，分别分离纯化脾脏淋巴细胞.将从不同组小鼠获得的淋巴细胞密度调成一致，利用相同浓度的TM(20 μg/mL)刺激培养48 h，离心取上清液，检测各组过敏相关细胞因子IL-4、IL-13蛋白质水平分泌量.收集细胞沉淀，用Trizol试剂分离提取RNA，反转录后获得cDNA.以cDNA为模板，以管家基因HPRT为内参，利用荧光定量PCR检测TH2型细胞因子IL-4的基因表达量，所用引物序列及反应条件参考Capobianco等［12］的方法.PCR 产物采用质量分数3%琼脂糖凝胶电泳检测.1.7 数理统计所有数据采用SPSS 16.0软件分析，用ANOVA进行方差分析，显著性检验方法为邓肯多重检验，检验限为0.05.有关数据为3次以上平均值.2 结果2.1 目的蛋白的纯化与鉴定新鲜坛紫菜经前处理和体积分数为25%～35%的硫酸铵盐析后，样品因混合藻红蛋白及别藻蓝蛋白呈紫色，纯度达到2.0以上.将盐析后的样品上样于SephacrylS-200 HR凝胶过滤柱，其结果如图1所示.由图1可见，分子质量较大的杂蛋白质先于藻胆蛋白被洗下来，收集A620/A280＞2.5部分，便于下一步纯化.样品透析后上样于DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱.从图2可知，通过两步柱层析获得高纯度的目的蛋白(A620/A280＞6.0).对获得的目的蛋白进行SDS-PAGE 电泳分析，得到的两个条带 (见图3)即为目的蛋白的α、β亚基，分子质量约17.7 ku和20.5 ku.紫外可见分光光度计检测发现，该目的蛋白有两个特征吸收峰分别在620 nm和555 nm(见图4)，证明其为R-藻蓝蛋白.2.2 R-藻蓝蛋白的稳定性分析热稳定性实验结果显示，温度由30℃升高到50℃过程中，R-藻蓝蛋白纯品特征吸收峰值逐渐变低，同时在特征吸收峰以外的波段 (400～500 nm及650～700 nm)范围内吸光度值变大，即发生红移和蓝移现象.并且，在50℃处理30 min后，R-藻蓝蛋白特征吸收峰被完全破坏，溶液蓝色褪去，有沉淀可见 (见图5a).40℃处理不同时间对R-藻蓝蛋白吸收峰的影响结果显示，随着时间的延长，R-藻蓝蛋白吸收峰逐渐降低，特征吸收峰以外波段发生红移和蓝移现象，溶液蓝色逐渐变浅(见图5b).pH稳定性实验结果显示，R-藻蓝蛋白的光谱特征随着pH值的降低和升高会逐渐消失，但未见明显的红移和蓝移现象，在pH＞10.0或者pH＜3.0条件下，R-藻蓝蛋白的光谱特征完全消失 (见图6).图1 Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析Fig.1 Sephacryl S-200 HR gel filtration chromatography图2 DEAE-Sepharose离子交换层析Fig.2 DEAE-Sepharose ion-exchange图3 纯化的目的蛋白SDS-PAGE图谱Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified R-phycocyanin说明：M—标准蛋白；1—纯化蛋白.Notes：M—standard protein;1—R-phycocyanin.图4 纯化的R-藻蓝蛋白紫外-可见吸收图谱Fig.4 Ultraviolet-visible absorption spectrum of the purified R-phycocyanin图5 R-藻蓝蛋白的热稳定性分析Fig.5 The thermal stability of R-phycocyanin 图6 R-藻蓝蛋白pH值稳定性分析Fig.6 The pH stability of R-phycocyanin2.3 R-藻蓝蛋白对过敏小鼠血清IgE及IL-13、IL-4蛋白质水平的抑制作用小鼠在二次免疫后采血，检测血清中特异性IgE水平.结果显示，TM致敏小鼠血清IgE水平比PBS对照组有显著上升，血清中IgE抗体滴度是对照组的3倍，说明成功建立食物过敏小鼠模型.热处理组血清IgE水平比TM致敏组有所降低，相对而言TM+RPC处理组血清IgE水平下降更为显著 (见图7)，证明R-藻蓝蛋白降低食物过敏小鼠血清中IgE水平的作用强于热处理.IL-13、IL-4作为TH2型细胞因子，在食物过敏反应中发挥着重要的调节作用.小鼠在二次免疫后处死，取脾脏淋巴细胞进行淋巴细胞抗原刺激培养实验.小鼠脾脏淋巴细胞在TM刺激培养48 h后离心取上清液，利用ELISA法检测其中的IL-13、IL-4含量.图8显示，经过过敏原TM敏化后的小鼠淋巴细胞再次经过TM刺激后能够产生大量IL-13(600 pg/mL)、IL-4(400 pg/mL)，相对于PBS组有显著性差异.过敏原TM与RPC混合共同刺激处理后的小鼠只能产生少量的 IL-13(100pg/mL)、IL-4(300 pg/mL).图7 R-藻蓝蛋白对血清中TM特异性IgE水平的影响Fig.7 The influence of RPC on the levels of serum说明：hTM—加热处理后 TM;TM+RPC—天然 TM混合RPC；*—P＜0.05；**—P＜0.01.Notes:hTM—heated TM;TM+RPC—the mixture of TM and RPC；*—P＜0.05；**—P＜0.01.图8 R-藻蓝蛋白对TH2型细胞因子（IL-13和IL-4）分泌量影响Fig.8 The influence of RPC on the secretion of IL-13 and IL-4说明 Notes：*—p＜0.05,**—p＜0.01.2.4 R-藻蓝蛋白对IL-4基因水平的抑制作用小鼠脾脏淋巴细胞在TM刺激培养48 h后离心取沉淀，提取淋巴细胞中 RNA，结果显示A260/A280约为1.85，适合反转录及实时荧光定量PCR.实时荧光定量PCR结果显示，内参基因HPRT及目的基因IL-4在各组淋巴细胞中均有表达，其中TM组IL-4与HPRT基因扩增曲线相差4.5个循环数;PBS组IL-4与HPRT基因扩增曲线相差5.5个循环数;TM+RPC组IL-4与HPRT基因扩增曲线相差7个循环数 (见图9)，熔解曲线显示引物特异性良好，扩增产物显示单峰 (见图10)，结果分析表明，致敏组小鼠淋巴细胞在TM刺激下TH2型淋巴细胞因子IL-4表达量明显上升，是对照组表达量的1.5倍，具有显著性差异;TM+RPC处理组小鼠淋巴细胞在TM刺激下IL-4表达量与对照组无显著性差异 (见图11a).荧光定量PCR 后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到结果与扩增曲线分析一致 (见图11b).图9 IL-4/HPRT扩增曲线Fig.9 The amplification curve of IL-4/HPRT图10 引物溶解曲线Fig.10 The dissolve curve of primers图11 PBS,TM,TM+RPC刺激培养细胞的IL-4 mRNA表达水平Fig.11 mRNA expression level of IL-4 mRNA in cultured cell stimulated by PBS,TM,and TM+RPC3 讨论本文采用原肌球蛋白作为过敏原注射小鼠，建立水产食物过敏动物模型，结果显示，原肌球蛋白能够显著提高小鼠血清抗原特异性IgE水平，并且促进IL-4、IL-13的蛋白质分泌量及IL-4的基因表达量.原肌球蛋白是细肌丝中与肌动蛋白相结合的蛋白质，由两条平行的多肽链组成双螺旋结构.研究结果显示，原肌球蛋白是甲壳类水产品的主要过敏原，能够导致一系列严重的食物过敏症状［13-14］.体内实验结果显示，原肌球蛋白能够显著提高小鼠血清中蛋白质特异性IgE水平［12］;体外实验结果显示，原肌球蛋白能够促进TH2型免疫细胞因子的蛋白质分泌及基因表达［12，15］.本实验结果证实，从拟穴青蟹中提取得到的原肌球蛋白能够促使TH细胞向TH2型极化，促进血清高水平IgE的产生，最终导致过敏反应的发生，是典型的I型超敏反应.本实验从坛紫菜中提取得到的藻蓝蛋白由两个不同的亚基组成，其分子质量分别为17.7 ku和20.5 ku，并且有两个特征吸收峰在620 nm和555 nm.藻蓝蛋白的主要功能是协同藻红蛋白和别藻蓝蛋白参与红藻细胞内光合作用能量的传递.根据其亚基组成、特征吸收峰及存在于藻类的不同，藻蓝蛋白可分为C-藻蓝蛋白和R-藻蓝蛋白，其中，R-藻蓝蛋白的主要特征是由两个不同的亚基组成，并且有两个特征吸收峰;C-藻蓝蛋白的主要特征是由两个相同的亚基组成，并且只有一个特征吸收峰［5，16］.郑江等人［17］从红毛藻中提取得到R-藻蓝蛋白，发现其有两个不同的吸收峰组成，分别是615 nm和553 nm，但并未通过SDS-PAGE确定两个亚基的分子质量大小.林书吟通过饱和硫酸铵盐析及羟基磷灰石柱层析从头发菜中提取得到纯度为4.11的R-藻蓝蛋白组分，发现其同样有两个特征吸收峰，分别在618 nm和553 nm处，SDS-PAGE显示，其由分子质量为17.40 ku和21.72 ku的两个不同的亚基组成［18］.蔡春尔等人从条斑紫菜提取得到C-藻蓝蛋白，发现其只有一个在615 nm处的吸收峰，纯度为4.42，SDS-PAGE显示其分子质量在20 ku左右［19］.本文纯化得到的目的蛋白的颜色、亚基组成及特征吸收峰都符合之前文献报道，证明其为R-藻蓝蛋白.另外，藻蓝蛋白的纯度常用A620/A280的比值衡量，本实验得到的R-藻蓝蛋白的纯度A620/A280＞6.0，与之前的结果相比纯度较高.热稳定性和pH值稳定性实验结果显示，R-藻蓝蛋白是一种热不稳定性蛋白质，在40℃下长时间存放会导致其蓝色褪去，特征吸收峰消失;pH值过低或者过高也会对R-藻蓝蛋白的光谱稳定性产生影响.IgE免疫球蛋白是诱导食物过敏发生的重要因子，食物过敏反应的发生常伴有高水平IgE的产生.本实验以IgE为指标，通过建立食物过敏小鼠初步分析R-藻蓝蛋白的抗食物过敏功效，结果显示，加热处理对过敏原致敏性的消除有一定作用，相比较而言，R-藻蓝蛋白的抗过敏活性更为显著.之前，台湾大学学者发现红毛藻中R-藻蓝蛋白能够显著降低哮喘模型小鼠血清中的IgE水平［7］.红毛藻与坛紫菜中R-藻蓝蛋白生物活性相似，都具有降低抗原特异性IgE的功效，更为重要的是坛紫菜产量比红毛藻高，并且价格相对较低，更适合用于以后抗过敏试剂的开发与应用.基于R-藻蓝蛋白能够显著降低小鼠血清中过敏原特异性IgE水平，本文又进一步调查了R-藻蓝蛋白对IgE相关细胞因子蛋白水平及基因水平上的调节作用.本实验中，致敏小鼠的脾脏淋巴细胞在原肌球蛋白刺激下能够分泌大量IL-4、IL-13，与对照组有显著差异.用R-藻蓝蛋白混合原肌球蛋白刺激培养后IL-4、IL-13分泌量显著降低，证明R-藻蓝蛋白具有抑制TH2型淋巴细胞因子分泌的作用.基因表达量分析结果显示，原肌球蛋白刺激淋巴细胞后IL-4表达量显著上升，R-藻蓝蛋白有显著降低IL-4表达量的作用.IL-4、IL-13是TH2型淋巴细胞特异性分泌的淋巴细胞因子，能够诱导B细胞抗体类别向IgE转换，从而促进食物过敏反应的发生.Leung等［20］利用原肌球蛋白灌胃小鼠建立食物过敏动物模型，过敏原淋巴细胞刺激实验显示，原肌球蛋白能够显著刺激淋巴细胞分泌TH2型细胞因子 (IL-4、IL-13).Capobianco等［12］利用荧光定量PCR技术检测原肌球蛋白刺激淋巴细胞后IL-4、IL-13等细胞因子的表达量有上升趋势.Yanase等人［21］发现，褐藻糖能够显著降低致敏淋巴细胞IL-4的分泌量.本实验以原肌球蛋白作为过敏原刺激淋巴细胞后IL-4分泌量较Leung等人［15］报道的多，这可能是由于过敏原、淋巴细胞浓度或培养时间不同导致.另外，R-藻蓝蛋白是否能够降低其他过敏原 (如卵清蛋白、小清蛋白、酪蛋白等)诱导的淋巴细胞IL-4分泌水平还有待进一步研究. ［参考文献］［1］吕相征，刘秀梅，杨晓光.健康人群食物过敏状况的初步调查［J］.中国食品卫生杂志，2005，17(2):119-121.［2］刘建萍，由宝昌，黎星辉，等.地肤子皂苷抗过敏活性部位及量效关系的研究［J］.山东农业科学，2009(8):49-52.［3］王钦富，王永奇，于超，等.炒紫苏子醇提取物对过敏模型小鼠的抗过敏作用及机制［J］.中草药，2006，37(10):1532-1535.［4］滕建文，聂奇森，黄丽，等.桂枝抗过敏和抗氧化活性的对比研究［J］.食品科技，2008(7):259-262.［5］ GLAZER A N.Light harvesting by phycobilisomes ［J］.Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry，1985，14:47-77.［6］ REMIREZ D，LEDON N，GONZALEZ R.Role of histamine in the inhibitory effects of phycocyanin in experimental models of allergic inflammatory response［J］.Mediators of Inflammation，2002，11(2):81-85.［7］中华人民共和国农业部渔业局.中国渔业年鉴［M］.北京:中国农业出版社，2011.［8］ CHANG C J，YANG Y H，LIANG Y C，et al.A novel phycobiliprotein alleviates allergic airway inflammation by modulating immune responses ［J］.American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，2011，183(1):15-25.［9］ LAEMMLI U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 ［J］.Nature，1970，227(5259):680-685.［10］ KNIGHT A K，ZQUEZ A B，ZHANG S，et al.CD4 T cells activated in the mesenteric lymph node mediate gastrointestinal food allergy in mice ［J］.American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology，2007，293(6):1234-1243.［11］ DEARMAN R J，SKINNER R A，HEROUET C，et al.Induction of IgE antibody responses by protein allergens:interlaboratory comparisons ［J］.Food and Chemical Toxicology，2003，41(11):1509-1516.［12］ CAPOBIANCO F，BUTTERONI C，BARLETTA B，et al.Oral sensitization with shrimp tropomyosin induces in mice allergen-specific IgE，T cell response and systemic anaphylactic reactions［J］.International Immunology，2008，20(8):1077-1086.［13］ LEUNG P S C，CHOW W K，DUFFEY S，et al.IgE reactivity against a cross-reactive allergen in crustacea and mollusca:evidence for tropomyosin as the common allergen ［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，1996，98(5):954-961.［14］ SHANTI K N，MARTIN B M，NAGPAL S，et al.Identification of tropomyosin as the major shrimp allergen and characterization of its IgE-binding epitopes［J］.Journal of Immunology，1993，151(10):5354-5363. ［15］ LEUNG P S C，LEE Y S，TANG C Y，et al.Induction of shrimp tropomyosin-specific hypersensitivity in mice ［J］.International Archivesof Allergy and Immunology，2008，147(4):305-314.［16］ KIKUCHI R，ASHIDA K，HIRAO S.Phycobilins in different color types of Porphyra yezoensis［J］.Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries，1979，45(11):1461-1464.［17］郑江，高亚辉，王文星，等.红毛藻多组分藻胆蛋白及其亚基的分离［J］.中国水产科学，2003，10(4):277-281.［18］林书吟.头发菜丝状体R型藻蓝蛋白之提纯与性质分析及光质对其生长与色素含量的影响［D］.台北:台湾大学生命科学院，2010.［19］蔡春尔，周铭，李春霞，等.条斑紫菜藻胆蛋白提纯方法优化探索［J］.生物技术通报，2009(2):98-102.［20］ LIU G M，LI B，YU H L，et al.Induction of mud crab(Scylla parmamosain)tropomusin and arginine kinase specific hypersensitivity in BALB/c mice ［J］.Journal of the Science of Food Agriculture，2012，92(2):232-238.［21］ YANASE Y，HIRAGUN T，UCHIDA K，et al.Peritoneal injection of fucoidan suppresses the increase of plasma IgE induced by OVA-sensitization ［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，387(3):435-439.。
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藻蓝蛋白的分离与纯化实验报告食品与生物工程学院一、实验目的和要求1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白一般的提取和纯化的方法；2、掌握蛋白含量测定方法；3、掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的实验技术。
二、实验原理藻蓝蛋白（PC）是一类普通存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，也是一种天然色素蛋白，具有水溶性，可用作食品着色剂。
此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。
藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体细胞的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。
另外，它还具有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。
利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子ＮＨ可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。
由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同研究表明可用25%(NH4)2SO4 饱和度沉淀除去杂质，55%(NH4)2SO4沉淀藻蓝蛋白。
盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。
最常用的脱盐方法是透析。
蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，而小分子物质可以自由透过半透膜，顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。
蛋白含量的测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等），本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm变为595nm，在一定范围内，蛋白质的含量与595nm处吸光值成正比。
离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。
蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。
因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变PH或离子强度来实现，与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。
本实验以蓝藻为材料，采用反复冻融、分步盐析法对藻蓝蛋白进行提取和初步纯化，采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，然后使用DEAE-纤维素柱层析对提取的藻蓝蛋白进一步纯化（由于来源不同和种类的差别，目前研究报道的藻蓝蛋白等电点尚无一致结论，但都在3.4-4.8之间，其中钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的等电点为 4.3，在PH6.5磷酸盐缓冲液中带负电，所以选择DEAE-纤维素阴离子交换柱）。
预期得到纯度较高的藻蓝蛋白。
三、试剂与仪器1、试剂螺旋藻藻粉0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PH6.5）、标准蛋白（0.1mg/L）、考马斯亮蓝G-250、0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、NaCl、0.5mol/LHCl、NaCl、硫酸铵、透析袋、DEAE纤维素、奈氏试剂四、实验步骤（一）、藻蓝蛋白的提取及初步纯化1、藻蓝蛋白抽提：采用反复冻融法破碎细胞，磷酸盐缓冲液浸提蛋白。
具体操作：取螺旋藻粉1g，加入0.01mol/LPH6.5的磷酸盐缓冲液10mL，充分搅拌混匀。
室温浸泡30min-1h后，在-20℃和38℃之间反复冻融数次（3-5次）。
细胞破碎后，将悬浮液移入离心管，加入10mL0.01moL/L PH6.5的磷酸盐缓冲液，混匀，静止30min，4000r/min 离心20min，上清液即为抽提得到的藻蓝蛋白混合液。
2、分步盐析：采用不同浓度的硫酸铵分步盐析初步纯化出藻蓝蛋白。
具体操作：取上清液，用25%饱和度的硫酸铵4℃盐析30min ，然后4000r/min离心20min，所得上清液用55%饱和度的硫酸铵放入冰箱盐析30min，4000r/min离心20min，弃去上清液，离心收集得到沉淀即为藻蓝蛋白。
3、透析去盐得到的沉淀用10mL0.01moL/Mlph6.5的磷酸盐缓冲液溶解，然后将藻蓝蛋白粗提液置于透析袋（截留分子质量为10Kd）中在蒸馏水中透析以去除盐离子。
每隔1h换一次透析液，换3-4次。
(二)藻蓝蛋白含量测定1、制作标准曲线；2、样品含量测定；3、计算结果。
具体操作步骤如下：取洁净干燥的试管若干，按表1-1比例配置标准蛋白溶液。
原本标准蛋白的浓度为0.1mg/mL。
表1-1标准溶液配置混匀此6组试管中的标准蛋白溶液，分别加入4mL考马斯亮蓝G-250，摇匀(充分混匀)，室温放置5min后在595nm波长处别色，以1号试管调零点，得到5组标准蛋白溶液在595nm处的吸光值A595。
以标准蛋白浓度（mg/mL）为横坐标，以A595值为纵坐标作图，得到的趋势线即标准曲线。
将提取的藻蓝蛋白溶液1mL适当稀释（6-10倍左右），再取0.2mL，补充水到1mL，同上进行比色操作，得到其595nm处的吸光值，通过标准曲线推算其含量。
（三）藻蓝蛋白纯度的测定测定A620和A280值，纯度可用A620/A280来表示。
将上述稀释后的样品，用可见分光光度计，测定其在620nm波长处的吸光值A620；再将样品转出，装入石英比色皿，放入紫外分光光度计，测定其在280nm波长处的吸光值A280。
由于藻蓝蛋白在620nm 波长处有特征吸收峰，其纯度可以用A620/A280来表示。
因此，根据在可见和紫外分光光度计中得到的数据就可以推算出提取的藻蓝蛋白样品的纯度。
（四）藻蓝蛋白的进一步纯化1、DEAE-纤维素处理、装柱和平衡2、上样、洗脱3、测定纯化的蛋白浓度和纯度，并分别计算回收率和纯化倍数。
具体操作：3.测定纯化的蛋白浓度和纯度，并分别计算回收率和纯化倍数。
具体操作：用三倍柱床体积的0.01mol／LpH6.5磷酸盐缓冲液平衡。
将初步纯化得到的藻蓝蛋白液上DEAE-纤维素柱，采用0.01mol／LpH6.5磷酸缓冲液洗脱（含0.4mol／LNaCI）进行洗脱，柱上层的深蓝色部分大多被迅速洗脱下来，只残留少量蓝色。
流速控制在10d／min，用小试管收集洗脱液，每管收集2mL（或30滴），收集10-12管（呈现蓝色的液体内含有目的蛋白）。
测定每管样品的A620，横横坐标洗脱体积、纵坐标A620值，绘制洗脱曲线。
合并所有管中的样品，A620和A280值，计算纯度。
然后用0.01mol／LpH6.5磷酸缓冲液（含0.6mol／LNaCI）洗脱，洗脱下的是藻蓝蛋白。
柱料的再生：用0.5ml ／LHCl 溶液处理柱料，洗2-3倍柱床体积，用水洗至pH6.0,0,01mol ／LpH6.5磷酸缓冲液平衡。
四、 数据处理及实验结果表一 标准蛋白曲线表二 标准曲线0.20.40.60.811.200.20.40.60.81ca提取的藻蓝蛋白溶液A595:0.176A620:1.022A280:1.017紫外可见光谱仪测藻蓝蛋白纯度表四根据数据制作藻蓝蛋白的洗脱曲线0.10.20.30.40.50.6123456789101112六、思考题1、蛋白含量测定方法有哪些？各有什么特点？（1）、微量凯氏定氮法，（2）、Folin-酚法，（3）、紫外吸收法，特点：操作简便迅速，且不消耗样品（可以回收），低浓度的盐类不干扰测定。
（4）、考马斯亮蓝染色法，2、盐析分离蛋白的原理是什么？盐在水溶液中电离所形成的正负离子ＮＨ可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。
由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同研究表明可用25%(NH 4)2SO 4 饱和度沉淀除去杂质，55%(NH 4)2SO 4沉淀藻蓝蛋白。
盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。
最常用的脱盐方法是透析。
蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，而小分子物质可以自由透过半透膜，顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。
3、离子交换层析纯化蛋白的原理？离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。
蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。
因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变PH或离子强度来实现，与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。
4、藻蓝蛋白的功能有哪些？广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。
藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光标记物藻蓝蛋白具有刺激红细胞集落生成，类似红细胞生成素(epo)的作用；藻蓝蛋白具有补血、调整白血球和提高淋巴细胞活性的作用；增加体能、促进红血球增长，能增进机体免疫功能，促进生长发育；藻蓝蛋白还具有抑制某些癌细胞的作用；具有很高的营养价值和医疗价值。
藻蓝蛋白作为天然食用色素，它可以改善食品的色泽，不仅能提高食品的档次，而且能增加食品中的功能成份。
藻蓝蛋白是少见的色素蛋白之一。
它不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。
藻蓝蛋白是水溶性色素，清亮鲜艳，外观悦目可爱，可作为食品、化妆品的添加剂。
七、注意事项1、标准曲线制作规范、准确，样品含量测定准确；2、藻体细胞要反复冻融3次以上，确保细胞全部破碎；3、注意离心机使用；4、DEAE-纤维素柱层析，洗脱液的离子浓度严格控制。