小鼠间充质干细胞分离培养与纯化

小鼠间充质干细胞

一、细胞复苏和接种

1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。

2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。

3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。

4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。

5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。

6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。

7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。

8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。

9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。

10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。

二、细胞换液和培养

注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。

1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。

2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。

3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。

三、消化细胞

1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，

用前按1：1混合。

将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。

2．具体操作如下：

（1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。

（2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。

（3）25℃消化2分钟，在显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部分细胞脱落。（4）向每个培养瓶中加3-5 ml 含10% FBS的基础培养液中和胰酶的消化作用。

（5）用移液管轻轻吹打培养瓶表面使细胞完全脱落后，吸至15 ml无菌离心管内。

（6）20℃，1 500 rpm 离心5分钟，弃上清。

（7）加入一定量的完全培养液，调整细胞数量后，抽样加入胎盘蓝计数，得到细胞数和活性后，按细胞数传代或冻存。

四、细胞传代

1．消化细胞（详见第三步）。

2．按10000-15000个细胞/cm2接种细胞于T25的培养瓶中。

3．每个培养瓶中加完全培养液3-5ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。

五、小鼠骨髓MSCs的体外分离、培养及扩增

断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，并在骨干中部剪断，无血清DMEM-LG培养基冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15％FBS的DMEM-LG培养基重悬离心管中的MSCs，镜下细胞计数，使细胞密度达到1X106个/ml，CO2培养箱培养，换液，将MSCs不断纯化。当细胞生长融合达80%-90% 时，用1:1 的0.25% 胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散细胞，在显微镜

下控制消化时间,计数细胞，以1:3密度扩增培养。此时标记为P1代，以后每３-４ｄ换液１次；当细胞生长融合达80%-90%时，继续以1:3的密度传代扩增培养，传代培养并记为P2代。倒置相差显微镜逐日观察细胞形态和生长情况。