单核细胞增生性李斯特菌研究进展_郭宏华

基金项目：吉林省科技项目资助（２０１００７４２）吉林省卫生厅项目资

（３Ｄ５１１ＢＣ４３４３０

）＊通讯作者

文章编号：１００７－４２８７（２０１３）０１－０１９７－０３

单核细胞增生性李斯特菌研究进展

郭宏华１，贾芙蓉２，韩晓英３，何成彦１＊

（１．吉林大学中日联谊医院，吉林长春１３００３３；２．解放军第２０８医院；３．

长春八一医院） 单核细胞增生性李斯特菌是一种短小的革兰氏

阳性无芽胞杆菌，

是一种人畜共患病的致病菌，可使人和动物患李斯特菌病。李斯特菌属（１ｉｓｔｅｒｉａ）现在有２个群７个种，分别是单核细胞增生性李斯特菌（Ｌ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，ＬＭ）（亦称产单核细胞李斯特菌）、伊氏李斯特（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）（亦称绵羊李斯特菌）、英诺克李斯特菌（Ｌ　ｉｎｎｏｃｕａ）（亦称无害李斯特菌）、韦氏李斯特菌（Ｌ　ｗｅｌｓｈｉｍｅｉ）、塞氏李斯特菌（Ｌｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、格氏李斯特菌（Ｌ．ｇｒａｙ

ｉ）和莫氏李斯特菌（Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ）。１　生物学特性

ＬＭ的幼龄菌（取１６ｈ－２４ｈ的培养物进行革兰染色），呈革兰阳性小杆菌，长０．５μｍ－２μｍ，宽０．４

μ

ｍ－０．６μｍ，直或稍弯，常呈Ｖ字形，成对排列。在营养肉汤中２Ｏ℃－２５℃培养２４ｈ可形成４根小鞭毛，有动力；３６℃培养时无鞭毛，动力消失。此菌营养要求不高，在普通营养琼脂平板上３６℃培养２４ｈ呈细小、半透明、微带珠光的露水样菌落，直径约０．２ｍｍ－

０．４ｍｍ，在斜射光下，菌落呈典型的蓝绿色光泽。在血平板上３６℃培养２４ｈ－

９６ｈ，菌落呈β溶血［

１］

。２　流行病学

ＬＭ是一种人畜共患的致病菌，也是重要的食源性致病菌之一。ＬＭ感染家畜后可引起脑膜炎、脑炎以及自发性流产等，可暴发流行。ＬＭ引起人类的疾病统称为李斯特菌病（１ｉｓｔ—ｅｒｉｏｓｉｓ

），人感染后主要表现为脑膜炎、

败血症和单核细胞增多。婴幼儿、怀孕妇女和免疫耐受病人的感染死亡率可高

达２０％－３０％［２］

。

３　毒力基因

３．１　李斯特菌溶解素（ＬＬＯ）是由ｈｌｙ基因编码的蛋白，是一种孔形成毒素，是主要的毒力因子，可破

坏吞噬体，使细菌进入胞液并在其中繁殖，失去后导致细菌毒力的丧失。不产生ＬＬＯ的ＬＭ可在非吞噬细胞的胞液中生存一段时间，

但却不能繁殖，可被吞噬细胞杀灭［３］

。近年的研究表明ＬＬＯ是一个多

功能的毒力因子，能引起宿主细胞很多反应，如细胞增殖、

黏膜细胞外渗作用、巨噬细胞中细胞因子的表达树突状细胞的凋亡、磷脂代谢及引起机体产生免

疫反应等［

４］

。３．２　Ｐ６０蛋白是一种胞壁质水解酶，由ｉａｐ基因编

码，它是单核细胞增生性李斯特菌重要毒力因子［５］

。通常Ｐ６０蛋白于细胞表面产生，并大量分泌到生长介质中，对于细胞的分裂是必不可少的。分析Ｐ６０蛋白编码基因的突变体显示，对于ＬＭ的吞噬细胞溶解作用以及对机体的感染过程，Ｐ６０蛋白是一个

重要的因素［

６，７］

。３．３　单增李斯特菌能产生两种磷脂酶ｃ：ＰＩ－

ＰＬＣ和ＰＣ－ＰＬＣ。ｐｌｃＡ基因编码一个特异的作用于磷脂酰肌（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏ１）的磷脂酶ｃ（ＰＩ－ＰＬＣ）。ｐ

ｌｃＢ基因编码磷脂酶Ｃ（ＰＣ－ＰＬＣ）。ＰＩ－ＰＬＣ毒性相对较小，对细菌在细胞间扩散作用不大，主要是协同ＰＣ—ＰＬＣ发挥作用。ＰＣ－ＰＬＣ使细菌从吞噬泡中逃逸出来，能破坏宿主细胞的信号通路，能调节细胞因子和化学因子的合成，还能通过二酰基甘油、神经酰胺、肌醇磷酸盐等调节细胞的生长、分化、凋亡

等［４，８－

１２］。ＰＩ－ＰＬＣ系以活化的形式合成，而ＰＣ－

ＰＬＣ则先以非活化的前肽被分泌出来，然后在胞外由ｍｐｌ的基因产物Ｍｐ

ｌ蛋白酶加工。ＰＩ－ＰＬＣ可辅助细菌逸出初级吞噬体，而细菌在细胞与细胞之间的

扩散过程中，ＰＣ－

ＰＬＣ则表现出一定的活性作用［１３］

。Ａｎｇｅｌｉｋａ　Ｇｒｕｎｄ１ｉｎｇ等通过利用诱导Ｐ

Ｃ－ＰＬＣ表达系统证明，缺乏ＬＬＯ的ＬＭ，ＰＣ－ＰＬＣ的活性不仅对在人类上皮细胞中初级吞噬体的溶解是必需的，

而且对细胞与细胞之间的扩散也是必需的［

１４］

。３．４　Ｐｒｆ　

Ａ编码ＰｒｆＡ蛋白，是单增李斯特茵毒力基因簇上各种毒力基因的调节蛋白，直接检测ＰｒｆＡ可以减少其他毒力基因突变或缺失所造成假阴性

—

７９１—中国实验诊断学　２０１３年１月　第１７卷　第１期

结果的概率。ＰｒｆＡ蛋白是一种转录因子，是李斯特菌所有基因簇（包括ＰｒｆＡ本身）转录激活所必需，是迄今鉴定出的李斯特菌的唯一毒力调节蛋白［１５］；在感染宿主细胞的过程中，对于许多毒力因子的等位表达起到了关键调控因子的作用［１６］。

３．５　ＡｃｔＡ蛋白是由ＡｃｔＡ基因编码的表面蛋白，通过诱导细胞肌动蛋白分子的聚合作用促使细菌在细胞与细胞之间的传递，同时也与细菌被宿主细胞内化有关［１７］。

３．６　内化素（Ｉｎｔｅｍａｌｉｓ）有ＩｎｌＡ，ＩｎｌＢ，ｉｎｌＣ　３种，与ＬＭ被非吞噬细胞内化有关。另外一种表面蛋白Ｐ１０４与肠道细胞的粘附有关［１４］。

４　检测

４．１　用ＬＢ１增菌液３０℃培养２４ｈ，后转种于ＬＢ２增菌液３０℃培养２４ｈ，取ＬＢ２增菌液划线接种科玛嘉李斯特菌显色培养基和ＰＡＬＣＡＭ琼脂３６℃培养２４ｈ－４８ｈ，然后挑取可疑菌落进行生化、溶血和协同溶血试验，并用生化鉴定系统进行鉴定［１８］

４．２　焦新安研制出李斯特氏菌酶标单抗试剂，具有高度特异性，为该菌属检验提供了优良试剂，建成了单抗夹心ＥＬＩＳＡ试验，经实际样品的检测表明，该方法敏感、特异且安全与经典分离鉴定方法相比，ＥＬＩＳＡ法需２－４天可完成检验［１９］。

４．３　胶体金免疫层析技术　胶体金免疫层析技术是２０世纪９０年代发展起来的将层析法与免疫胶体金相结合的诊断技术，具有快速、操作简便、与酶联免疫法相似的特异性及灵敏度的优点，广泛用于样品的检测［２０］。

４．４　聚合酶免疫检测方法（ａｓｓｕｒａｎｃｅ　ｐｏｌｙ　ｃｌｏｎａｌｅ－ｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＥＩＡ）是将样品增菌液和阳性对照加到酶标板的微孔内，微孔的内壁上固定有对李斯特氏菌抗原有高度特异性的抗体。李斯特氏菌抗原在微孔内形成抗体－抗原复合物。一般操作方法是在样品板内加入抗李斯特氏菌特异抗体，进孵育、冲洗程序，然后加入碱性磷酸酶结合剂，使酶与抗原结合，冲洗后加入底物显色，用４０５－４１０ｎｍ的光度计读数，计算临界值。当样品测量值大于临界值时为阳性结果，可疑阳性结果还需经传统方法检测［２１－２３］。

４．５　应用ＰＣＲ检测、荧光定量ＰＣＲ、多重一巢式ＰＣＲ、改良分子信标一实时荧光ＰＣＲ法、ＤＮＡ微矩阵法、竞争ＰＣＲ［２３－２５］等方法测定单增李斯特菌。Ｎｏｇｖａ等［２３］运用５′－核酸酶ＰＣＲ对单增李斯特氏菌定量；Ｃｈｏｉａ［４］ｃＰＣＲ李进行定量；Ｌｏｎｇ等［２５］以ｈｌｙ为靶基因，采用ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ联合检测技术。

４．６　核酸探针杂交方法

Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ等根据１６ＳｒＲＮＡ和２３ＳｒＲＮＡ基因间的间隔区序列设计ＰＣＲ引物，将ＰＣＲ产物和单增李斯特菌的特定寡核苷酸探针进行杂交，通过比色法测定杂交体，结果表明，每２５ｍＬ样品中能检测出１－１０ｃｆｕ［２６］。Ｒｏｇｅｒ　Ｓｔｅｐｈａｎ等报告３ｈ内可得到结果，效果良好［２７］。

５　防治

单核细胞增生李斯特菌在自然界广泛分布，主要是通过食源性传播，污染食品的来源和途径很多，所以预防此菌的感染要从多个环节进行，如食品的生产加工、包装、储存和销售的过程及部门、家庭个人的饮食卫生、牲畜的养殖等，减少细菌的污染，切断细菌的传播途径并杀灭细菌。

参考文献：

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［８］Ｋａｒｖｅｎ　Ｊ，Ｃｏｏｒａｙ，Ｔａｋｅａｋｉ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｖｉｒｕ－ｌｅｎｃｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｉｎ　ａｒｔｉ－ｆｉｃｉａｌｌｙ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ　ｍｉｌｋ　ｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９４，８：３０２３．

［９］Ｒｕｄｎｉｃｋ　ａ　Ｗ．Ｔｈｅ　ｈｏｓｔ　ｒｅｐｏｎｓｅ　ｔｏ　Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ　ｍｕ－ｔａｎｔｓ　ｄｅｆｅｎｓｉｖｅ　ｉｎ　ｇｅｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅｓＣ（ｐｌｃＡ，ｐｌｃＢ）ａｎｄ　ａｃｔｉｎ　ａｓｓｅｍｂｌｙ（ａｃｔ）［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７：４１（１１）：８４７．

［１０］Ｚｅｎｅ　ｗｉｃｚ　ＬＡ，Ｓｋｉｎｎｅｒ　ＪＡ，Ｇｏｌｄｆｉｎｆ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏ－ｇｅｎｅｓ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎｄｕｃｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｆａｓ　ｌｉｇａｎｄｏｎ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２ＯＯ４，５１（５）：１４８３　１４９２．［１１］Ｊａｖｉｅｒ　Ａ，Ｃａｒｒｅｒｏ，Ｂｏｒｉｓ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ　０ｆｒｏｍ　Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ　ｉｓ　ａ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ａｐｏｐｔｏｇｅｎｉｃ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ［Ｊ］．Ｔｈｅ

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—Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇｎ，Ｊａｎｕａｒｙ，２０１３，Ｖｏｌ　１７，Ｎｏ．１