植物细胞融合的研究进展_综述_郭学民

河北科技师范学院学报　第19卷第1期,2005年3月

Jo ur nal o f Hebei N or mal U niver sity of Science&T echnolog y Co llege V o l.19　No1.1M arch2005

植物细胞融合的研究进展(综述)

郭学民1,2,徐兴友1,2,王同坤1,王华芳2,尹伟伦2

(1河北科技师范学院生命科学系,河北秦皇岛,066600;2北京林业大学生物科学与技术学院)摘要:概述了原生质体分离和培养的影响因素,介绍了近年来国内外原生质体培养与融合及杂种细胞、筛选和鉴定的动态。

关键词:细胞融合;原生质体;筛选与鉴定

中图分类号:Q321+.2 文献标识码:A 文章编号:1672-7983(2005)01-0065-05

细胞融合(cy to mixis),亦称细胞杂交(cell fusio n),是指亲本的两个细胞在特定的物理和化学因子处理下合并为一个杂种细胞的过程[1]。植物细胞融合可分为体细胞杂交(somatic hybridizatio n)和配子-体细胞杂交(gameto-somatic hy br idizatio n),前者是指不经过有性过程,而直接由体细胞原生质体融合产生杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[2],后者是指性细胞(如小孢子四分体、精子、精细胞、幼嫩花粉、成熟花粉、卵细胞、助细胞和中央细胞等)原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[3]。植物细胞融合是植物细胞工程的一个重要分支,是一种突破物种生殖隔离、创造远缘杂种的新途径,原生质体技术还可用于细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入。

自1960年Cocking[4]用酶法分离出番茄根原生质体后,Natag a和T akebe[5]1970年首次利用烟草叶分离原生质体,经培养获得再生植株;1975年以色列的Vardi等[6]首次从木本植物Sham onti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织,并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株;在禾本科植物中,除在珍珠谷、紫狼尾草用悬浮细胞为材料,较早获得原生质体再生植株外,直到1985年Fujim ur a[7]等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株,才出现了重大突破。现已从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进,植物细胞融合获得了巨大成功。植物细胞融合包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养,以及植株的再生和鉴定等环节。

1　原生质体的分离和培养

1.1　起始材料

起始材料及其生理状态对原生质体的制备及其活力有很大的影响。在以往的双子叶植物培养中,大多以叶片为分离原生质体的材料,近年来,起始材料的适用范围有了较大扩展。目前,以愈伤组织、悬浮细胞和体细胞胚为材料制备原生质体是最主要的方式;禾本科植物原生质体培养获得成功的试验,几乎都是用从幼胚或成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织或胚性细胞系来游离原生质体。采用这些材料制备原生质体方法简便、产量高、不污染、不易破碎。

1.2　基因型

同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不同,所以在相同条件下,不同品种的再生能力不同。王光远和夏镇澳[8]在水稻原生质体培养中曾用26个品种进行组织培养,其中仅有3个品种(粳稻农虎6号、国香1号和上农香糯)能成功地用于原生质体培养,获得再生植株。据统计,小麦获得原生质体再生植株的基因型只有大约10个[9]。基因型的选择在植物原生质体培养中起着重要作用,它不仅影响原生质体的产量和活力,而且还影响植株的再生。Cheng和Veillenux证明芙薯(Solanum phureja)从原生质体培养到愈伤组织形成受2个独立位点的显性基因的调控[10]。因此,现有

收稿日期:2004-03-09;修改稿收到日期:2004-12-12

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条件下,并不是所有植物种都能获得原生质体再生植株。为了提高原生质体培养的成功率,要采用多品种和适当品种作为原生质体培养的起始材料。

1.3　培养基

培养基对原生质体培养影响很大。为了使原生质体能持续生长、分化,最重要的条件之一是选择合适的培养基。在木本植物原生质体培养中,常用的培养基有M S,M T,WPM,KM8p等。Crosser等用MT 改进后建立的BH3培养基已成为柑橘原生质体培养中较为通用的培养基[11];利用KM8p经多次改进得到的培养基V-KM已成功地培养了200多种原生质体,是目前适用范围较广的原生质体培养基[12]。在禾本科植物原生质体培养成功的例证中,常用的培养基是以M S,LS,Du,N6,KM等为基础改进而来的。

无机盐是培养基的主要成分,其浓度要比细胞培养时低。其中氮源研究较多,马锋旺和罗建平等在原生质体培养中发现高浓度NH+4抑制原生质体分裂[13,14]。

培养基中的碳源和渗透剂在原生质体培养中起重要作用。渗透压过高,原生质体会发生皱缩直至失去活力;渗透压过低,原生质体吸水膨胀而破碎,故在酶解和初培养时,由于原生质体无细胞壁,培养基保持较高的渗透势状态是必要的。随着原生体培养时间的延长,可逐步降低渗透势以提高细胞的耐受力[15]。常用的碳源、渗透剂以葡萄糖较好,可获得较高的植板率,且对细胞毒害也小[16],但有些植物用葡萄糖+山梨醇、蔗糖+葡萄糖、麦芽糖、甘露糖等效果较好[17～19]。

原生质体培养中的激素以生长素和细胞分裂素为主。不同植物的原生质体培养,对激素的浓度要求差异很大,需要生长素和细胞分裂素的适当搭配[20,21]。但也有学者证明添加NAA可提高原生质体的分裂率[16]。在禾本科植物原生质体培养中,培养基中2,4-D的作用十分重要。

1.4　培养方法

原生质体的培养方法分为液体培养、琼脂糖包埋和看护培养几种方式。有些植物适于采用液体浅层培养[22～24],另外,固液双层培养法也被应用于原生质体再生[25]。

1.5　培养密度

原生质体的接种密度对培养效果影响很大。密度过小,原生质体内含物外渗而引起褐变或进行一次分裂后即死亡;密度过高,造成营养不良,再生细胞团很小,而且很快停止生长。在一定范围内,原生质体具有较强的恢复分裂能力,一般密度以104～105mL-1为宜[26]。

1.6　酶制剂

在木本植物中,原生质体的分离常用的酶为纤维素酶(Cellulase Onzuka R-10)、果胶酶(Pectinase)、离析酶(M acerozy me r-10)和半纤维素酶(Hemicellulase)。但不同植物所用酶的种类有较大的差别。在苹果和山桃的原生质体分离中只需纤维素酶和果胶酶即可[27],枣树则用纤维素酶和离析酶[20]。禾本科植物原生质体的分离普遍使用了Y-23果胶酶来消除细胞壁,保证了原生质体的质量。

1.7　材料的预处理

许多研究者报道,酶解之前对材料进行预处理有利于原生质体的分离。在正常培养基中生长的草莓试管苗幼叶,直接酶解仅能产生少量原生质体,如果在分离前将试管苗转入降低了蔗糖浓度的培养基中预处理2～3周,或暗处理1周,原生质体的产量将大为提高[28,29]。在悬铃木叶片酶解前,将其放在CPW-12M(含质量分数为0.12的甘露醇)中1.5～2h,使细胞质壁分离,缩短了酶解时间[16]。在实验中,材料是否需要预处理要根据不同的情况而定。

2　原生质体融合

2.1　应用原生质体融合技术产生杂种植株

自Car lson等[30]在1972年获得第一株烟草体细胞杂种植株以来,原生质体融合技术在植物中已广泛应用。据不完全统计,到2003年初,已获得木本植物近100个组合的体细胞杂种植株[26];T erada R.等[31]最早在1987年,将稗草与水稻的原生质体融合,获得了杂种水稻植株,至1999年底,已获得17例水稻体细胞杂交组合的杂种植株[32];现已有10多种植物性细胞的20多个不同组合的配子-体细胞杂交实验,有的已获得再生植株。