可见光分光光度计的操作方法

可见光分光光度计的操作方法

学时：2学时

一、实验原理

利用可见光等测定物质的吸收光谱，利用此光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法，使用的仪器是分光光度计。分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，是生物化学研究中必不可少的基本手段之一。

可见光光谱：光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。λ=C/V 其中，λ-波长；C-光速；V-频率；单位时间要通过一个定点的波数。可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息。可以用标准光图谱再结合其它手段进行定性分析。

根据朗伯-比尔（Lambert- Beer）定律：A=εbc，（A为吸光度，ε为摩尔吸光系数，b为液池厚度，c为溶液浓度）可以对溶液进行定量分析。ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光光度法测定的灵敏度就越高。ε值越大，说明电子跃迁的几率越大，通常ε=10～105：一般认为ε>104为强吸收；ε=103～104为较强吸收；ε<102为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。通常使用分光光度计可检测出的最小吸收度A=0.001，所以b=1cm，ε=105时，可检测的溶液最小浓度是C=10-8mol/L。

二、分光光度计的基本参数和组成与构造

1. 722S可见光分光光度计的基本参数

波长范围：340-1000nm

波长精度：±2nm（360-600nm）

表面刻度：（T）0-100%（A）0-2

2. 组成与结构

各种型号的分光光度计不论是何种型式，基本上都是由五部分组成：（1）

光源；（2）单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；（3）样品室；（4）接受检测放大系统；（5）显示或记录器。

三、实验试剂

NaCl : 1mol/lL 、5mol/L ；NaOH: 1mol/lL 、10mol/L ；其他溶液。

四、实验步骤

1. 将波长调至550nm ，打开样品池盖；

2. 开启电源开关，预热20 min ；

测定透明材料的透射比 测定透明溶液的吸光度

预热

设定波长 设置空白

置标尺为“吸光度” 调0%τ

置入样品

读出数据

光源

单色器

样品室

检测放大系统

显示器

预热

设定波长

设置空白

置标尺为“透射比”

调100%τ

置入样品

读出数据

用标准曲线法对物质定量

取已知含量的标准样品

按样品各自的分析规定制备样品溶液及背景溶液

设波长，置空白，条；调零，置“吸光度”，读出样品吸光度

重复上述读出各标准溶液的吸光度

绘制已知含量及读得吸光度绘制坐标图并画出最佳曲线

读未知样品的吸光度，在曲线表上找出对应的浓度

直接使用浓度直读功能

直接使用浓度因子功能

五、注意事项：

1、仪器在运行中禁止将样品池盖长时间盖上，以防光电管疲劳；

2、使用时必须把比色皿外面的液体用滤纸吸干，方可放入样品池架内；

3 、仪器使用完后，必须关闭电源，并将比色皿用高纯水冲洗干净，将外部的水用滤纸吸干后放入样品池架内待用。

六、实验结果与分析

1. 已知溶液的吸光度和透射比的测定（波长为：550nm）

溶液名程浓度透射比吸光度

NaCl 1mol/lL

5mol/L

2. 绘制NaOH的标准曲线（浓度梯度：10mol/lL，5mol/lL，1mol/lL，0.1mol/lL，

0.01mol/lL）

七、说明

NaCl：

分子量：58.44

性质：密度2.165g/ml；熔点801 °C；沸点1461 °C；水溶性360 g/L (20°C)。

纯净的氯化钠晶体是无色透明的立方晶体，由于杂质的存在使一般情况下的氯化钠为白色立方晶体或细小的晶体粉末，密度为 2.165（25/4℃），熔点801℃，沸点1442℃，味咸，PH值呈中性，易融于水和甘油，难融于乙醇。

常温下，100克水中溶解36克氯化钠固体。

NaOH：

固体溶于水放热；又称烧碱、火碱、苛性钠，是常见的、重要的碱，英文名称sodiun hydroxide（别名Caustic soda）。

化学式：NaOH

分子量：40.01。密度2.130克/厘米3，熔点318.4℃，沸点1390℃。纯的无水氢氧化钠为白色半透明，结晶状固体。氢氧化钠极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大，溶解时能放出大量的热。它的水溶液有涩味和滑腻感，溶液呈强碱性，具备碱的一切通性。常温下，100克水中溶解53克氢氧化钠固体。