HPLC_荧光检测法测定大鼠脑组织中的单胺类神经递质及相关物质

Article I D : 1006 - 0103 ( 2007 ) 05 - 0557 - 03
精神分裂症的多巴胺功能亢进学说和抑郁症的 5 - 羟色胺 ( 5 - HT)功能低下学说 ,揭示了脑内单胺 类神经递质水平与精神疾病有密切联系 。因此 , 建 立简便 、 快速和准确的单胺类神经递质及相关物质 的测定方法 ,对于神经精神障碍的发病机理及药物 开发与评价具有重要的意义 。目前使用 HPLC 法一 般能 同 时 测 定 2 ～ 6 种 单 胺 类 递 质 及 其 相 关 物 [ 1 ～4 ] 质 ,检测时间通常大于 20 m in。现通过方法学 改进 ,可同时测定 7 种单胺类递质及其相关物质 。
华西药学杂志 2007, 22 (5) : 557 ～559 W CJ ・PS
HPLC - 荧光检测法测定大鼠脑组织中的单胺类神经递质及
相关物质
林凌云 ,李 慧 ,许崇涛
(汕头大学精神卫生中心 , 广东 汕头 515063 )
摘要 : 目的 采用 HPLC - 荧光检测方法测定大鼠脑组织中的单胺类递质及相关物质 。方法 脑组织匀浆用提取液 (含 0. 1
甲肾上 腺 素 ( NE ) 、 酪 氨 酸 ( TRS ) 、 盐酸多巴胺 (DA ) 、 ( 3, 4 - 二 羟基 苯乙酸 DOPAC ) 、 高香草酸 ( HVA ) 、 盐酸 5 - 羟色胺 ( 5 - HT) 、 色氨酸 ( TRP ) (美国 Sigma 公司 ) ; 甲醇为色谱纯 ; 水为双蒸水 ; 其 - 1 余试剂均为分析纯 ; 提取液为含 0. 1 mol ・ L HC lO4 和 012 mmol ・ L EDTA - 2Na的混合溶液 。 112 方法与结果 11211 色谱条件 采用 W aters Nova - Pak C18色谱
m in 冷冻离心 10 m in, 取上清液过滤 , 滤液作为供
- 1 4
- 1
1. 10 ± 0. 03 0. 19 ± 0. 01 2. 10 ± 0. 10 0. 59 ± 0. 02 0. 49 ± 0. 01 0. 78 ± 0. 03 0. 13 ± 0. 01
2. 59 4. 73 4. 88 2. 54 2. 12 3. 20 4. 62
11212 溶液的制备 分别精密称取 NE、 TRS、wenku.baidu.comDA、 DOPAC、 HVA、 5 - HT、 TRP 对照品适量 ,用提取液溶
表 3 精密度试验结果
Table 3 Results of prec ision test
Comp. TRS NE DO PAC DA TRP HVA 5 - HT W ith a day ( n = 5)
RSD were low. CO NCL UT I O N This method is simp le, fast, sensitive and accurate and can be used to deter m ine si m ultaneously the
concentrations of monoam ine trans m itters and related compounds in rat brain tissue. Key words: Rat brain tissue; Monoam ine trans m itters; HPLC - fluorometric detection CLC num ber: R917 D ocum en t code: A
的标准曲线在一定浓度内线性关系良好 ,方法的加样回收完全 , 精密度好 。结论 所建方法简便 、 快速 、 准确 , 可用于脑组织 中单胺类神经递质及相关物质的测定 。 关键词 : 大鼠脑组织 ; 单胺类神经递质 ; 高效液相色谱 - 荧光检测 中图分类号 : R917 文献标识码 : A 文章编号 : 1006 - 0103 ( 2007 ) 05 - 0557 - 03
D eterm ina tion of m onoam in e tran sm itters and rela ted com pounds in ra t bra in tissues by HPLC w ith fluorom etr ic detection
LI N L ing - yun , L I Hui , XU Chong - tao
作者简介 : 林凌云 ,男 ,福建莆田 ,副主任药师 ,从事精神药理学的研究工作 。
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华 西 药 学 杂 志
第 22 卷
20 μ l,日内重复测定 5 次 。另将上述对照品溶液连
测 3 d,每日 3 次 。计算 ,结果见表 3。
表 2 回收率测定结果 ( m g ・ L - 1 , n = 5)
-1
column ( 150 mm × 319 mm , 4μm ) , mobile phase: methanol– buffer ( 14 ζ 86 ) ; flow rate: 110 m ・ l m in ; fluorometric detector wave2 length setting of excitation at 280 nm and em ission at 330 nm. RESUL TS The calibration curves of 7 monoam ines and related com 2 pounds were linear w ithin the lim ited concentration ranges . The methodology recovered fully, the w ithin day RSD and betw een days
RSD / %
2. 59 3. 49 8. 27 2. 54 2. 12 5. 57 5. 08
图 1 对照品 ( A) 与大鼠脑组织提取液 ( B) 的色谱图
F ig 1 HPLC chroma togram s of con trol solution ( A) and extract of ra t bra in tissue ( B)
用提取液准确配制成系列浓度的溶液 。分别吸取 20 μ l对照品溶液和供试品溶液 , 进样分析 , 记录各 有关成分的峰面积 , 按外标法计算含量 。以峰面积 Y 对浓度 X 进行线性回归 (表 1 ) 。将各对照液稀释 后 ,取 20 μ l进样 ,以 S /N > 3 计算检测限 (表 1 ) 。
1. 13 ± 0. 03 0. 18 ± 0. 01 2. 08 ± 0. 08 0. 59 ± 0. 02 0. 50 ± 0. 01 0. 79 ± 0. 02 0. 13 ± 0. 01
2. 44 4. 77 3. 71 2. 51 2. 12 3. 03 3. 05
试品溶液 。
11213 线性关系 取各种对照品溶液适量 , 混合 ,
- 1
1 实验部分
111 仪器与试剂 2690 型高效液相色谱仪包括 474 荧光检测器 、 312 色谱工作站 (美国 W aters) 。对照品重酒石酸去
基金项目 : 广东省自然科学基金资助项目 (编号 : 04020238)
柱 ( 150 mm × 3. 9 mm , 4 μm ) ; 流动相为甲醇 - 缓冲 - 1 - 1 液 (含 40 mmol・ L 醋酸钠 、 30 mmol ・ L 柠檬酸 、 - 1 - 1 012 mmol ・ L EDTA - 2Na、 0. 4 mmol ・ L 辛烷磺酸 - 1 钠 , pH3. 8 ) ( 14 ζ 86 ) ,流速 1. 0 m ・ l m in ; 荧光检测 λ λ 波长 EX = 280 nm , EM = 330 nm; 柱温为室温 。在上 述条件下 ,各成分无干扰且实现完全分离 (图 1 ) 。
(M en ta l Hea lth Cen ter of S han tou U n iversity, S han tou 515063, Ch ina)
Abstract: O BJECT IVE To develop a method for determ ining monoam ine transm itters and related compounds in rat brain tissue by
-1 ion - pair HPLC w ith fluorometric detector . M ETHOD S The brain tissues were homogenized in HClO4 ( 0. 1 mol ・ L ) and EDTA -
2Na (012 mmol ・ L
-1
). And the supernatants were injected into the chromatographic system. The HPLC condition was Nova - pak C18
Table 2 Result of sam ple recovery test( m g ・ L - 1 , n = 5)
Comp. TRS NE DO PAC DA TRP HVA 5 - HT O riginal 0. 214 0. 122 0. 127 0. 505 0. 058 Added 0. 500 0. 500 1. 000 0. 500 0. 250 4. 000 0. 100 D etected 0. 715 0. 575 1. 011 0. 627 0. 753 3. 466 0. 146 Recovery / % 100. 2 90. 6 101. 1 100. 0 99. 2 86. 7 88. 0
C /m g ・ L-1 RSD / %
Bet w een days ( n = 3)
C /m g ・ L-1 RSD / %
解 ,并稀释成含量为 1 mg ・ L 的标准贮备液 ,置 4 ℃ 冰箱内保存 。分别将大鼠迅速断头处死 , 冰盘上分 离纹状体 ,准确称重 , 置 - 60 ℃ 冰箱保存 。测定时 , 室温下解冻 ,置 1 m l组织匀浆器中 , 加入其重量 10 倍体积 、 4℃ 的提取液 ,冰浴下匀浆 , 4 ℃、 1. 2 × 10 r ・
11217 应用 应用上述方法 ,对 9 只正常 SD 大鼠
和 10 只抑 郁样 行为 SD 大鼠 纹状 体中 TRS、 NE、 DOPAC、 DA、 TRP、 HVA、 5 - HT 的含量进行了测定 (抑郁样行为大鼠造模采用 21 d 不可预见应激法 ) , 结果见表 4。
表 4 大鼠纹状体中神经递质及相关化合物含量的测定结果 ( x ± s,
mol ・ L
-1
HClO4 和 0. 2 mmol ・ L
-1
EDTA )提取后进样 。色谱柱用 W aters Nova - Pak C18 ( 150 mm × 3. 9 mm , 4 μm ) ; 流动相为甲
-1 醇 - 缓冲液 ( 14 ζ 86 ) ; 流速 1. 0 m ・ l m in ; 荧光检测波长 λEX = 280 nm ,λEM = 330 nm。结果 7 种单胺类神经递质及相关物质
表 1 各成分的线性与范围及检测限
Table 1 Regression equa tion s and detection li m it
Comp. TRS NE DA TRP HVA 5 - HT Regression equation
Y = 819 × 104X + 313 × 103 Y = 1171 Y = 2135 Y = 7188 Y = 1191 r
ng ・ mg - 1 ) Table 4 L evels of m onoam in es and rela ted com pounds in str ia tum of SD ra ts( x ± s, ng ・ mg- 1 )