两水相萃取蛋白质的相图制作实验
2-2双水相萃取
双节线位置 与形状与聚 合物的分子 量有关。 聚合物分子 量越高，相 分离所需浓 度越低； 两种聚合物 分子量相差 越大，双节 线形状越不 对称。
三、物质在两相中的分配
物质在两水相中的分配用分配系数K表示： K=CT/CB
式中： CT、CB—分别代表上下相中溶质的浓度 K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质 有关，相系统固定时，K为一常数，与溶质的浓 度无关。
在两水相中，水分占很大的比例，生物 大分子（蛋白质、细胞器等）不会引起 失活，但可以不同的比例分配于两相中。
双水相萃取技术定义
利用双水相的成相现象及待分离组分在 两相间分配系数的差异，进行组分分离 及提纯的技术。
第一节 双水相分离理论
一、双水相的形成
两种聚合物溶液相互混合，分层或 混合成一相取决于：
利用生物物质在两相中的不同分配可实现其分离。 生化工程中常用的双水相体系有：
聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dex）： 聚乙二醇（PEG）/无机盐（硫酸盐或磷酸盐）。 无毒性； 能使生物高分子稳定（多元醇或多糖结构）。
特点：
二、相 图
两水相形 成的条件 和定量关 系常用相 图表示。
P E G 含 量 %
双水相萃取技术
普通溶剂萃取不易用于蛋白质的分离：
许多蛋白质有极强的亲水性，不溶于有 机溶剂； 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
双水相萃取现象
1896年 Bei jerinck 上相：含大部分明胶 明胶＋琼脂 两相 明胶＋可溶性淀粉 下相：含大部分琼脂
（或可溶性淀粉）
双水相的形成
2.2%葡聚糖水 溶液与等体积的 0.72%甲基纤维 素钠水溶液混合 静置
双水相萃取实验
三. 选择正确的吸出上、下相操作方法：
1. 吸管小心插入下相，吸出下相
换吸管，吸出上相。
2. 吸管小心吸出上相
插入下相，吸出下相。
3. 吸管小心吸出上相 吸出下相。
将多余上相和少量下相弃去
换吸管，
11
生化物质分离纯化基础实验
四. 可调式移液器（枪）正确的操作方法（是非题）： 1. 要吸取0.4ml液体，可用1000 ~ 5000 μl 规格的枪。 2. 向顺时针方向旋，数值减小；逆时针方向旋，数值增
数g
ml
g
纯(NH4)2SO4 累计量 g
溶液累计 总量 g
PEG
%(g/g)
(NH4)2SO4
%(g/g)
1 0.5 2 0.3 3 0.3 4 0.3 5 0.5 6 0.5 7 0.5
5
生化物质分离纯化基础实验
两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一. 实验原理
1. 糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同程度地分配，分配 系数 K = C上/ C下。 相比R = V上/ V下
2. 考马斯亮兰（Coomassie Brilliant Blue G-250） 比色法测定两相中 蛋白质浓度：考马斯亮兰G－250是一种染料，酸性溶液中呈棕红 色。与蛋白质通过范德华键结合成兰色复合物，595nm波长有最大 吸收值。 低浓度时，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。
6
生化物质分离纯化基础实验
1 0.1
g / ml
10
生化物质分离纯化基础实验
● 思考和讨论:
一. 加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇，直至固体全部溶解，原因 是什么？
二. 1. 2.
选择正确的离心操作顺序: 将装有相等体积的两只离心试管(水和样品液)对称放在离心机中。 将两只装有液体的离心试管放入套管中一起称重平衡 对称放在离心机中。
双水相萃取牛血清蛋白
双水相萃取牛血清蛋白数据记录表1 PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的制作表实验现象记录图1 取的三个成相比例的成相试管图图2 分别拍照的试管其中之一近图图3 余下两支试管图4 一个成相比例的试管取上下相溶液各1ml后加入双缩脲试剂图实验结果处理由标准曲线得吸光度和蛋白质浓度关系为y=0.2321x+0.0089(其中y代表吸光度，x代表蛋白质浓度)由此可得下表：表2 样品吸光度和蛋白质含量根据实验所得数据，计算系统的相比，蛋白在不同双水相系统中的分配系数及收率。
计算公式如下：表观分配系数 K=Ct/Cb相比 R=Vt/Vb收率 P=下相蛋白含量/上下相蛋白总含量=Vt*Ct/(Vt*Ct+Vb*Cb)=R*K/(1+R*K) 式中 Ct、Cb分别为上下相蛋白浓度；Vt、Vb分别为上下相体积。
表3 样品蛋白在不同双水相系统中的分配系数及收率分析讨论一、相图制备中误差1、在滴定硫酸铵前，滴定管已经清洗干净，但是没有用蒸馏水试漏，也没有用滴定液润洗，这在一定程度上稀释了滴定液，在滴定过程中也没有办法较好地控制活塞，以控制滴定量。
而且用滴定液润洗还可以将气泡排除，这点也没有做好，这些都是可能的误差来源。
2、滴定过程中，接近滴定终点时没有一滴一滴地加，加入几滴之后才摇晃试管的，这样，可能出现浑浊的点已经过了终点，数据产生误差。
而且读数也有误差，只由一位同学读数，使误差增大。
二、分离过程中误差1、相图绘制出之后，需取三个成相比例。
因为相图绘制有误差，在取点时也是取的大概位置，这使得之后计算出的PEG2000和硫酸铵的质量也是大概数值，这对之后对蛋白质的萃取有影响。
2、在测上下相体积时，有的试管上下相体积相差比较大，下相体积很小，因此体积测量可能存在误差。
生物分离 双水相萃取试验指导
对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关，通系电1，力过根保管据护线生高0不产中仅工资2艺料22高试2可中卷以资配解料置决试技吊卷术顶要是层求指配，机置对组不电在规气进范设行高备继中进电资行保料空护试载高卷与中问带资题负料2荷试2，下卷而高总且中体可资配保料置障试时2卷，32调需3各控要类试在管验最路；大习对限题设度到备内位进来。行确在调保管整机路使组敷其高设在中过正资程常料1工试中况卷，下安要与全加过，强度并看工且25作尽52下可22都能护可地1关以缩于正小管常故路工障高作高中；中资对资料于料试继试卷电卷连保破接护坏管进范口行围处整，理核或高对者中定对资值某料，些试审异卷核常弯与高扁校中度对资固图料定纸试盒，卷位编工置写况.复进保杂行护设自层备动防与处腐装理跨置，接高尤地中其线资要弯料避曲试免半卷错径调误标试高方中等案资，，料要编试求5写、卷技重电保术要气护交设设装底备备置。4高调、动管中试电作线资高气，敷料中课并设3试资件且、技卷料中拒管术试试调绝路中验卷试动敷包方技作设含案术，技线以来术槽及避、系免管统不架启必等动要多方高项案中方；资式对料，整试为套卷解启突决动然高过停中程机语中。文高因电中此气资，课料电件试力中卷高管电中壁气资薄设料、备试接进卷口行保不调护严试装等工置问作调题并试，且技合进术理行，利过要用关求管运电线行力敷高保设中护技资装术料置。试做线卷到缆技准敷术确设指灵原导活则。。：对对在于于分调差线试动盒过保处程护，中装当高置不中高同资中电料资压试料回卷试路技卷交术调叉问试时题技，，术应作是采为指用调发金试电属人机隔员一板，变进需压行要器隔在组开事在处前发理掌生；握内同图部一纸故线资障槽料时内、，设需强备要电制进回造行路厂外须家部同出电时具源切高高断中中习资资题料料电试试源卷卷，试切线验除缆报从敷告而设与采完相用毕关高，技中要术资进资料行料试检，卷查并主和且要检了保测解护处现装理场置。设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。
实验二_两水相系统中蛋白质分配_
注意事项
7、分光光度计的使用： 选择波长→空白液推入光路 → T 模式下调100% → A
模式下调0 →进行样品测量 →测完拿出比色皿洗净 8、各组要做好仪器使用记录。
作业
❖ 1. 做标准曲线,并做线性回归 ❖ 2、求出上下相蛋白质浓度及分配系数，求出
相比R，并计算两相中PEG与硫酸铵的百分 含量。
二 实验器材与试剂
❖ 1、实验器材 ❖ 电子台秤、10ml刻度离心管、离心机、移液管或
可调式移液器、小滴管、50ml容量瓶或试管 ❖ 2、实验试剂 ❖ 糖化酶（10万u/g左右，使用前稀释100倍，稀释
到浓度为0.01g/ml），PEG，硫酸铵，考马斯亮蓝
二 实验器材与试剂
试剂配制
1. 考马斯亮兰G-250溶液配制（已配好）： 精确称取50mg考马斯亮兰，溶于10ml 95%乙醇中， 并加入50ml 85% 浓磷酸，用H2O稀释定容至500ml。
实验二 两水相系统中蛋白质
分配系数的测定
一、实验目的
❖ 了解蛋白质在两水相系统中分配系数的测定 方法及操作，进一步掌握两水相系统萃取的 理论基础。
一 实验原理
1. 在两水相系统中，生物物质与成相组分之间通过 疏水键、氢键和离子键等相互作用而不同程度地 分配在两相中。
2. 分配系数：当萃取达到平衡时，蛋白质在上、下 两相中的浓度之比称为分配系数， 分配系数 K = C上/ C下;
求相比 R =V上/V下
求蛋白质分 配系数
K = C上/ C下
三. 实验操作
• （二）考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 • 1 . 标准曲线制作方法：见下表 • 2. 两相中总蛋白的测定： • 上相液：吸取1ml，蒸馏水定容至50ml，按下表操作。 • 下相液：上相完全吸掉，并吸掉部分下相，再取样。
双水相萃取牛血清蛋白
双水相萃取牛血清蛋白一.实验目的1.了解双水相系统的成相原理和方法；2.了解制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识；3.掌握双水相溶液配制与双水相萃取的操作；4.掌握分配系数和萃取收率的计算方法。
二. 实验原理双水相系统是由两种互不相溶的聚合物（如聚乙二醇（PEG）与葡聚糖（DX））或者互不相溶的聚合物溶液和盐溶液（如PEG与（NH4）2SO4）组成。
双水相系统的制备一般是将两种溶质分别配制成一定浓度的水溶液，然后将两种溶液按照不同的比例混合，静止一段时间，当两种溶质的浓度超过某一浓度范围时，就会产生两相。
相图是研究双水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。
图1是典型的高聚物-高聚物双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。
曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。
结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。
组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。
即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。
又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。
图1 A-B双水相体系相图双水相萃取与有机溶剂萃取原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配原则。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水性、氢键、离子键等）的存在，使得待分离的物质在上、下相中的浓度不同。
对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化的目的。
本实验选择PEG-硫酸铵双水相系统萃取牛血清蛋白。
双缩脲反应是指蛋白质在碱性溶液中与二价铜离子结合生成紫色络合物的反应。
含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应，蛋白质含有多个肽键，因此有双缩脲反应，反应生成物颜色的深浅与蛋白质含量成正比，因此可以利用双缩脲反应进行蛋白质的定量测定。
双水相萃取相图制作实验
实验一：双水相萃取的相图制作一、试验目的1了解双水相萃取的原理和发展历史、趋势2 掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法。
二、试验原理某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。
常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。
双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。
相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比在曲线上，混合后，溶液恰好由澄清变为浑浊。
连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定,即M(初始混合物组成情况)、T(上相组成情况)、B(下相组成情况)，其中T/B互为共扼相。
系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差别消失。
系线上系统的总浓度不同，但均分成组成相同体积不同的两相，两相体积服从杠杆规则：ＶＴ／ＶＢ＝ＢＭ／ＭＴ三、主要仪器设备漩涡振荡器、微量滴管装置、电子天平四、试验步骤1 双水相系统的制作精确配制43%（g/ml）的(NH4)2SO4溶液，并测定其密度。
另精确称取PEG400液体0.7g 于试管中，按表格中所列第一号数据，用吸管加入0.5毫升水，缓慢滴加已配制好的(NH4)2SO4溶液，并在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录(NH4)2SO4的加入量，根据密度求出重量。
然后按下表列出的第2号数据加入水，使其澄清，继续向试管中滴加(NH4)2SO4溶液，使其再次达到浑浊。
如此反复操作，计算每次达到浑浊时PEG400和(NH4)2SO4在系统总量中的百分含量。
2 相图的绘制以PEG400的重量百分比浓度为纵坐标，(NH4)2SO4的重量百分比浓度为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。
五、注意事项1、微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。
实验一 两水相系统相图的制作
表格中，以 PEG400 的百分浓度线相图。
相图制作表
序号 H2O (NH4)2SO4 溶 纯(NH4)2SO4
PEG400=
克
温度 T ＝
℃
溶液累计 PEG400/％ (NH4)2SO4/％
加量/g 液加量/mL 起始 终了
累加量/g
总量/g
刻度 刻度
1 0.5 2 1.0
3 1.5 4 2.0 5 2.5
学 大
四、思考题
技
科 （一）实验过程回顾 1．根据实验步骤，列出本实验所需得药品和仪器，（包括规格和数量、用途）。 古 2．说明实验数据得每步计算方法。
蒙 （二）实验结果和讨论 1．将实验结果列入表格，作出相图。
内 2．实验操作中应注意那些问题？
至试管内的溶液开始出现浑浊为止。记录(NH4)2SO4 的加量（mL），根据密度值求
出重量（g）。然后，按表格所列第 2 号数据向第二支试管中加入 H2O，使其澄清，
继续向试管中滴加(NH4)2SO4 溶液，使其达到浑浊，以此类推。计算每支试管达到
浑浊时，PEG400 和(NH4)2SO4 在系统总量中的重量百分含量（％），实验数据填入
实验一 PEG400\(NH4)2SO4 两水相系统相图的制作
一、实验目的和要求
了解用浊点法制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识。
二、实验原理
两种亲水性高聚物或高聚物与无机盐在水中会形成两个相，这是由于高聚物
的不相溶性或盐析作用而引起的，但是，他们只是有达到一定的浓度时才能形成
两相。两水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是一根双节线，当成相
学 组分的配比取在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，成为
双水相萃取相图制作实验
实验一：双水相萃取的相图制作一、试验目的1了解双水相萃取的原理和发展历史、趋势2 掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法。
二、试验原理某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。
常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。
双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。
相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比在曲线上，混合后，溶液恰好由澄清变为浑浊。
连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定,即M(初始混合物组成情况)、T(上相组成情况)、B(下相组成情况)，其中T/B互为共扼相。
系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差别消失。
系线上系统的总浓度不同，但均分成组成相同体积不同的两相，两相体积服从杠杆规则：ＶＴ／ＶＢ＝ＢＭ／ＭＴ三、主要仪器设备漩涡振荡器、微量滴管装置、电子天平四、试验步骤1 双水相系统的制作精确配制43%（g/ml）的(NH4)2SO4溶液，并测定其密度。
另精确称取PEG400液体0.7g 于试管中，按表格中所列第一号数据，用吸管加入0.5毫升水，缓慢滴加已配制好的(NH4)2SO4溶液，并在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录(NH4)2SO4的加入量，根据密度求出重量。
然后按下表列出的第2号数据加入水，使其澄清，继续向试管中滴加(NH4)2SO4溶液，使其再次达到浑浊。
如此反复操作，计算每次达到浑浊时PEG400和(NH4)2SO4在系统总量中的百分含量。
2 相图的绘制以PEG400的重量百分比浓度为纵坐标，(NH4)2SO4的重量百分比浓度为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。
五、注意事项1、微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。
两水相萃取蛋白质的相图制作实验
吉林化工学院生物分离工程专业实验报告课程类型：生物分离工程实验实验类型：设计型实验学年学期：2015-2016学年第一学期试验时间： 2015.10.8-2015.11.20 班级：学号：实验者：合作者：指导教师：提交日期：2015年11月29日吉林化工学院Jilin Institute of Chemical Technology两水相萃取蛋白质的相图制作实验摘要：目前在生化工业中常用的分离生物活性物质的方法,如有机溶剂萃取法等存在着一定的缺陷,例如由于有相的变化或有机溶剂的变性作用使得生物活性物质易于失活;在水—有机溶剂萃取中,界面上具有很强的界面张力,可破坏生物大分子的结构。
双水相萃取技术的发展趋势还体现在与其他生物分离技术的结合以及萃取机理和热力学模型的优化上。
关键词：双水相萃取，蛋白质，分离纯化分离纯化出高纯度有生物活性的蛋白质一直是项艰巨的工作。
由于蛋白质的市场价格昂贵，提高回收率能带来巨大的经济效益，所以有关蛋白质在分离纯化中的失活及其对策在近年来受到很大的关注。
双水相萃取是通过溶质在两水相之间分配系数的差异而进行萃取的技术，其应用于蛋白质的分离纯化具有以下优势：体系含水量高．可达80％以上。
萃取环境和操作条件温和，蛋白质在其中不易失活；界面张力远远低于水一有机溶剂两相体系的界面张力，有助于强化相际闸的质量传递；易于按比例放大和进行连续性操作等⋯。
正是由于双水相萃取技术的诸多优势，现已被广泛用于蛋白质的分离纯化，取得了很好的成效。
近年来，双水相萃取技术的分离对象进一步扩大，已包括了多肽、氨基酸、植物有效成分、重金属离子和抗生素等。
1 双水相萃取技术在生物分离工程中的应用1956年，瑞典Lund大学学者A1bertson首次利用双水相萃取技术分离生物分子，开始对A邛s进行比较系统的研究，测定了许多ATPs的相图，考察了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在ATPS中的分配行为，为发展双水相萃取技术奠定了坚实的基础。
实验双水相萃取(LDY)
0.8 0.6 0.4 0.2
/
1ml
/
0.9ml
加考马斯亮兰5.00ml，混匀，25℃±1℃保温 分钟，冷却 ，混匀， ℃ 分钟， 加考马斯亮兰 ℃保温10分钟 OD(595nm) 蛋白量µ 蛋白量µg
二. 操 作 方 法
蛋白质在两相中的分配： （一）蛋白质在两相中的分配：
(NH4)2SO4 固体1.30克 固体 克 PEG400 2.00克 克 糖化酶 2.00ml 水 10ml刻度 刻度 离心试管 振摇混和 (固体溶解 固体溶解) 固体溶解
台称
求相比 R =V上/V下 求蛋白质分 配系数 K = C上/ C下
两水相系统的优点: 两水相系统的优点: 生物大分子活性物质（蛋白）不易受到破坏； 生物大分子活性物质（蛋白）不易受到破坏； 两相中水分占很大比例； 两水相的相间张力小,相分离过程温和。 两水相之间的传质过程和平衡过程快速， 两水相之间的传质过程和平衡过程快速，可以 实现快速分离； 实现快速分离； 易于放大
分配系数的计算
标准曲线图： 标准曲线图： OD = K · X（µg ）＋ b （ 求斜率K和截距 求斜率 和截距b 和截距 µg
OD
分配系数 K = C上 / C下
注意事项
1. 台称上称重时，应先显示零点，再将空重去皮； 台称上称重时， 先显示零点，再将空重去皮； 分配系数实验称重时，必须按顺序加入物料， 分配系数实验称重时，必须按顺序加入物料，中间不要 再去皮，最终控制总重8.00g 再去皮，最终控制总重 2. 可调式移液枪正确的操作方法 3. 正确的离心操作顺序 4. 分光光度计的使用：选择波长 分光光度计的使用： 空白液推入光路 T 模式下调0 模式下调 调100% A 模式下进行样品测量 测完拿出比色皿洗净,并用少量乙醇润洗 测完拿出比色皿洗净 并用少量乙醇润洗
双水相萃取
AOT反胶团直径 常用于制备反胶束的S是二-(2AOT反胶团直径dAOT: 常用于制备反胶束的S是二-(2-已 基已基)琥珀酸酯磺酸钠,商品名为Aerosol AOT。 基已基)琥珀酸酯磺酸钠,商品名为Aerosol OT, 即AOT。 其在异辛烷中形成反胶团dAOT:
为二倍AOT 第1项为水核直径，第二项(2*1.2 nm)为二倍AOT分子长 项为水核直径，第二项(2*1.2 nm)为二倍AOT分子长 一般反胶团的W0不超过40. 因此, 依据上式, W0不超过 度. 一般反胶团的W0不超过40. 因此, 依据上式, 利用 ATO形成的水核直径一般不超过 形成的水核直径一般不超过12nm, ATO形成的水核直径一般不超过12nm, 大致可容纳一个 直径为5 10nm的pro分子 分子. pro分子比与反胶团直径相 直径为5-10nm的pro分子. 当pro分子比与反胶团直径相 比大得多时( 100-200kD),难于溶解到反胶团 比大得多时(如,当M > 100-200kD),难于溶解到反胶团 中.
基本公式： 根据目标pro和共存杂质的HFS\M\pI\Z等的差 别, 综合利用静电、疏水和添加适当种类和 浓度的盐，可选择性萃取目标产物。 若目标产物与杂蛋白的表面疏水性HFS相差 较大，充分发挥盐析作用；提高成相系统 的浓度(系线长度)，增大ATPS的HF，也是 选择性萃取的重要手段。
改变系线长度还可以使细胞碎片选择性分配与于 PEG/盐系统的下相；采用M较大的PEG可降低 pro的m，使萃取到PEG相的pro总量减少，从而 提高目标蛋白质的选择性。例如，采用 6.3%PEG6000/10%Kpi系统,可从细胞匀浆液中将 半乳酸糖苷提纯12倍,而使用低分子量PEG时,萃 取的选择性降低[17].此外,在磷酸盐存在下于pH7的 范围内调节pH也可提高目标产物的萃取选择性.
两水相萃取
混均
浑浊 澄清 记录(NH4)2SO4 记录 ml数 数
PEG400%
按表格重复操作… 按表格重复操作
(NH4)2SO4%
两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一. 实验原理
1. 糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同程度地分 糖化酶为生物大分子蛋白， 配，分配系数 K = C上/ C下。 相比R 相比 = V上/ V下
系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组 成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服 从杠杆规则。
如点M为整个系统的组成，该系统实际上由T、 B所代表的两相组成，vT表示上相体积，vB表 示下相体积，则：
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系 线越长，两相间的性质差别越大。当点M 线越长，两相间的性质差别越大。当点M向下 移动时，系线长度缩短，两相差别减小，到达 K点时，系线长度为0，两相间差别消失而成 点时，系线长度为0 为一相，因此K点为系统临界点(critical point) 为一相，因此K点为系统临界点(critical point)。 双节线的位置和形状与聚合物的相对分子质量 有关。聚合物Dex的相对分子质量越高， 有关。聚合物Dex的相对分子质量越高，相分 离所需的浓度越低；两种聚合物相对分子质量 相差越大，双节线的形状越不对称，见图。 相差越大，双节线的形状越不对称，见图。
11.4 影响分配的因素
(1) 聚合物组成的影响 Dextran 分子量（粘度高，价格）。 PEG分子量 PEG分子量 (2) 聚合物浓度影响 密度，密度差，粘度，粘度差，表面张力。 上述参数随聚合物浓度变化。 （3）盐与缓冲液 A 盐离子的不均匀分配改变两相间电位差 B 高盐浓度引起盐析效应 （4） pH lgKi*=lgKi+γZi , 等电点测定 （5） 温度的影响(离开临界点远，不太敏感，粘度) 温度的影响(离开临界点远，不太敏感，粘度两水相萃取
双水相萃取分离蛋白酶
2、相 图
4、分配系数：
生物大分子在双水相上相和下相的浓度比被定义为分配 系数。
K=Ct/Cb
5、萃取因素与理论收得率
6、影响K的因素
影响分配系数的因素： 系统本身的因素：系统组成、聚合物分子量、聚
合物浓度、盐和离子强度、pH等。 目标产物的性质：疏水作用、电荷、分子量等。
（1）、PEG分子量 蛋白酶的分配系数随PEG分子量的增加而降低，在低
（一） 相图的绘制
1、两相物质的准备 上相：不同分子量的PEG（600，4000，6000，20000），
配制成原液或直接采用固体试剂； 下相：无机盐制成一定浓度原液，或采用固体试剂。 A、磷酸钾 B、硫酸铵 C、硫酸钠
2、操作
（1）取大试管一支，称重（W0）. （2） 准确称量一定重量的PEG原液，加入试管中，计 算出加入的PEG 的量（g）。
（4）、离子强度
例如：在相组成为PEG4000（15%w/w）磷酸盐 （10%w/w）时， 在较低NaCl浓度时，蛋白酶的分配系数随 NaCl浓度增加而减小，在1% w/w NaCl时达到最低，继续增 加NaCl浓度，蛋白酶的分配系数随NaCl浓度增加而增加，在 7.8% w/w时达到最大。继续增加NaCl浓度，蛋白酶的分配系 数又趋下降。这是由于Na+ 和Cl-在两相分配情况不同，从而 引起两相电位差的变化所致。
（三）扩展实验（选作）
如果你感兴趣，你还可以采用单因素实验或PB实验， 研究PEG分子量，pH值、酶液浓度、离子强度对K与收率 1-φ的影响，然后采用正交试验或响应面实验进行工艺优化。
4、从浑浊变澄清时，要注意“刚刚澄清”。
作业：
1、采用Excel 软件，在同一个图中绘出不同相系统 的双节线（相图）。
离子液体双水相体系萃取分离牛血清白蛋白
离子液体双水相体系萃取分离牛血清白蛋白邓凡政*郭东方(淮北煤炭师范学院化学系,淮北235000)本文系安徽省教育厅自然科学研究项目(No. 2004kj319)资助摘要建立了由亲水性离子液体四氟硼酸1-甲基-3-丁基咪唑([Bmim]BF4)和KH2PO4形成的双水相体系萃取分离牛血清白蛋白(BSA)的新方法。
研究了不同盐及盐的浓度、离子液体浓度以及蛋白质用量、溶液酸度、其它共存物质对双水相成相及BSA萃取率的影响,结果表明,磷酸二氢钾盐浓度为80 g/L,离子液体浓度在160~240 mL/L,BSA的浓度为30~50 mg/L,溶液酸度在pH 4~8范围,离子液体双水相体系对BSA有较高的萃取率。
用加入不同类型表面活性剂探讨了离子液体与蛋白质之间的作用。
关键词离子液体,双水相,牛血清白蛋白,萃取分离1引言离子液体是在室温或室温附近由离子构成呈液态的物质,具有优异的化学热力学稳定性,其液态温度区间大、溶解范围广、没有显著的蒸气压以及极性较强且酸性可调等优点。
因此,它是一种极具吸引力的绿色溶剂,被称为环境友好液体、“可设计性”溶剂,是传统挥发性有机溶剂的理想替代品[1]。
近年来,离子液体也被用于萃取分离领域, Jonathan等[2]以甲基咪唑类离子液体作为萃取剂对多种有机物进行了萃取,离子液体还用于生物技术中的分离提取,如从生物燃料ABE的发酵液中回收丁醇[3];顾彦龙等[4]利用室温离子液体浸取分离牛磺酸与硫酸钠固体混合物;刘庆芬等[5]利用离子液体双水相体系对青霉素进行分离。
而利用该体系对于蛋白质萃取分离的报道还较少见。
为了扩大该领域应用范围,本研究用亲水性离子液体[Bmim]BF4和磷酸二氢钾,形成上相富集离子液体和下相富集磷酸盐的双水相体系对牛血清白蛋白进行萃取研究。
结果表明,该离子液体双水相体系,对牛血清白蛋白有较高的萃取率,为提纯分离蛋白质,提供一种新的方法。
2实验部分2.1仪器与试剂TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司); 721型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司); pHs-3型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。
双水相萃取.doc
实训1 双水相萃取相图的制作一、实训目的1. 学习双水相分离萃取的原理和方法2. 学习双水相萃取相图的制作二、实训原理双水相萃取法是利用物质在互不相容的两个水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。
两水相的形成：高聚物与无机盐在水中由于盐析的作用会形成两个相，如PEG 与硫酸盐或碱性磷酸盐。
两种亲水性高聚物在水中由于聚合物的不相容性也会形成两个相。
但是它们只有达到一定的浓度时，才能形成两相，双水相形成的定量关系可用相图来表示。
相图是一根双节线, 把均匀区和两相区分隔开来。
当成相组分的配比取在：线的下方时，为均相区； 曲线的上方时，为两相区；在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为浑浊。
相图中TMB 称为系线；T 代表上相组成；B 代表下相组成；同一条系线上各点分成的两相具有相同的组成，但体积比不同。
V T / V B = BM / MT三、实训器材、试剂、材料1.器材：试管，离心机，天平，离心管，三角瓶，滴定管。
2.试剂：聚乙二醇2000（PEG2000），硫酸铵。
四、实训操作步骤1.PEG2000（NH 4)2SO 4双水相体系相图的测定（1）取10%（g/ mL ）PEG2000溶液10mL 于三角瓶中。
（2）用40%（g/mL ）（NH 4)2SO 4溶液装入滴定管中滴定至三角并中溶液出现浑浊，记录）NH4)2SO 4溶液消耗的体积。
加入1mL 水使溶液澄清，继续用（NH 4)2SO 4溶液滴定至浑浊，重复7～8次，记录每次（NH 4)2SO 4溶液消耗的体积，计算每次出现浑浊时体系中PEG2000和（NH 4)2SO 4的浓度（g/mL ）。
（3） 以（NH 4)2SO 4的浓度（g/mL ）为横坐标，PEG2000的浓度（g/mL ）为纵坐标，绘制PEG2000- （NH 4)2SO 4双水相体系相图。
2. 相图制作表10%PEG2000 10mL 温度T=20℃次H 2O 加量(NH 4)2SO 4纯(NH 4)2SO 4溶液累PEG2000(NH 4)2SO 4PEG2000 %(NH 4)2SO 4 %两相 均相数(mL) 溶液加量累计量（g）计总量(mL)(%) (%)(mL) （g）1 12 13 14 15 16 17 18 1五、结果与讨论1.如何正确绘制相图。
生物分离-双水相萃取实验指导
双水相萃取相图的绘制1．实验目的⑴掌握绘制双水相相图的方法⑵理解双水相形成条件和定量关系2．实验原理双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。
双水相形成条件和定量关系常用相图来表示（见图1）。
成相物质都能与水无限混合，当它们的组成位于曲线的上方时（用M点表示）体系就会分成两相，分别有不同的组成密度，轻相（或称上相）组成用T点表示，重相（或称下相）组成用B点表示，T、B点称为节点。
直线TMB称为系线，是相图的重要特征，关系到相的平衡组成。
所有组成在系线上的点，分成两相后，其上下相组成均分别为T、B，但是其体积比（V T/V B）不同。
相体积比可由相图上线段比（BM/MT）估算，即服从杠杆规则。
本实验绘制PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。
图1 双水相体系相图3．实验材料及仪器PEG1000原液（0.6g/mL，w/w=56.926%，密度1.054）；PEG2000原液（0.4g/mL，密度1.02）；硫酸铵原液（0.43g/mL，密度1.2）。
4．实验方法准确称取2.0mLPEG原液，加入25 mL具塞刻度试管中，然后逐滴加入硫酸铵原液，混合，直至试管中开始出现混浊为止，记录加入硫酸铵量，算出PEG和硫酸铵在系统中的质量百分浓度，再向试管中加入适量水（0.2~0.5~1.0 mL），使体系变澄清，记录加入水的量，并继续加入硫酸铵，使体系再次变混浊，如此反复操作二十几次，计算达到混浊时PEG 和硫酸铵在系统中的质量百分含量，得出不同相对分子量的PEG和硫酸铵的双节线相图节点。
以上述试验所得结点绘制出不同相对分子量的PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。
5．数据处理表1 相图节点数据序号PEG质量（g）体系中盐溶液（mL）盐质量（g）体系加水量（g）体系总质量（g）PEG质量分数（w/w）盐质量分数（w/w）1 02 0.33 0.5……………………n 1.5双水相萃取牛血清白蛋白1．实验目的⑴掌握PEG/无机盐体系双水相萃取蛋白质的方法⑵了解影响蛋白质在双水相体系中分配行为的主要参数2．实验原理双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。
实验一 两水相系统相图的制作
总量/g
刻度 刻度
1 0.5 2 1.0
3 1.5 4 2.0 5 2.5
学 大
四、思考题
技
科 （一）实验过程回顾 1．根据实验步骤，列出本实验所需得药品和仪器，（包括规格和数量、用途）。 古 2．说明实验数据得每步计算方法。
蒙 （二）实验结果和讨论 1．将实验结果列入表格，作出相图。
内 2．实验操作中应注意那些问题？
古 少量溶解后稀释到 1000ml，并用密度计测定其密度（约为 1.20g/mL）。
蒙 2．相图的制作 分别精确称取 PEG400 液体 0.700g 左右于五支干燥的试管中，按下表中所列
内 第 1 号数据，向第一支试管中加入 0.5mLH2O(H2O 的密度以 1g/mL 计)，用滴定管
缓慢加以配好的(NH4)2SO4 溶液，并不断在混合器上混合，观察溶液的澄清度，直
学 组分的配比取在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，成为
均相区；在曲线上方时，能自动分成两相，称为两相区，若配比取在曲线上，则
混合后，溶液恰好从澄清变为浑浊。 相图是研究双水相萃取的基础。
三、操作方法
大 技
科 1．溶液配制 配制 43.00％（g /ml）的(NH4)2SO4 溶液：精确称取(NH4)2SO4 固体 430.0g 用
实验一 PEG400\(NH4)2SO4 两水相系统相图的制作
一、实验目的和要求
了解用浊点法制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识。
二、实验原理
两种亲水性高聚物或高聚物与无机盐在水中会形成两个相，这是由于高聚物
的不相溶性或盐析作用而引起的，但是，他们只是有达到一定的浓度时才能形成
两相。两水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是一根双节线，当成相
双水相萃取详细资料(ppt 44页)
方盼 赵梅
目录
（一）两水相的形成 （二）相图 （三）分配理论 （四）影响分配的参数 （五）应用
Question
• 常用的溶液萃取法能用来提 取生物大分子如蛋白质吗？
Reason
➢大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相 ➢蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活 ➢有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。
使蛋白质易分配于富含该PEG的相中，使分配系数 增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降 低，这是一条普遍规律
这是因为成相聚合物的疏水性对酶等亲 水性物质的分配产生较大的影响。
同一聚合物的疏水性随分子量的增大而 增大，当PEG的分子量增加是，在质量浓 度不变的情况下，其两端羟基数减少，疏 水性增加，亲水性的蛋白质不再向富含 PEG相中聚集，而转向另一相。 那么，分子量降低时，蛋白质就易分配 于富含PEG的相了
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
双水相系统
PEG = 聚已二醇 Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖
双水相萃取:
利用生物大分子在两种水相之间的分配比 例不同而达到分离纯化生物大分子的目的。
（二）相图
两种高聚物的水溶液，当它们以不同的比例 混合时，可形成均相或两相，这种水性两相 的形成条件和定量关系，常用相图来表示， 它是一条双节线。
K=C1/C2 C1代表上相浓度，C2代表下相浓度。当相
(生化工程课件)两水相萃取
在两水相系统中进行转化翻译功能，如 酶促反应，可以把产物移入另一相中， 消除产物抑制，因而提高了产率。这实 际上是一种反应和分离耦合的过程，有 时也称为萃取生物转化；如果发生的是 一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因 而此时也可以把两水相系统称为两水相 反应器。
相 图
相图
双结线， 上相（T，轻相） 下相（B，重相） 结点 临界点 系线
杠杆定律
19.3 双水相萃取过程的理论基础
表面自由能的影响 表面电荷的影响
表面积
电荷
3、物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数 K表示。
CT K= ——
CB Ct、CB——分别代表上相、下相中溶质的浓度 K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。 1）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对K影响很大) 2）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐,对K影响较大) 3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验） 4）影响分配平衡的参数 (1)聚合物的影响； (2)体系中无机盐离子的影响； (3)体系PH的影响； (4)体系温度的影响； (5)体系中微生物的影响。
四、双水相萃取的应用
1. 双水相萃取法常用于胞内酶提取。 目前已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。 原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞 破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞 碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离 的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以 及酶的进一步精制。
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吉林化工学院生物与食品工程学院专业实验
两水相萃取蛋白质的相图制作实验
摘要：目前在生化工业中常用的分离生物活性物质的方法,如有机溶剂萃取法等
存在着一定的缺陷,例如由于有相的变化或有机溶剂的变性作用使得生物活性物 质易于失活;在水—有机溶剂萃取中,界面上具有很强的界面张力,可破坏生物大 分子的结构。双水相萃取技术的发展趋势还体现在与其他生物分离技术的结合以 及萃取机理和热力学模型的优化上。 关键词：双水相萃取，蛋白质，分离纯化
(NH4)2SO4 （%）
20.00 37.50 48.57 57.14 61.19 64.77 67.86 70.29
微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。洗涤时，不 用去污粉，可用铬酸洗液或洗涤液先浸泡一段时间后，用一根细长的刻度移液管刷刷洗刻度 处，最后用蒸馏水反复冲洗数次。清洗干净的微量滴定管必须先用蒸馏水试漏，如有漏液， 可涂少量凡士林（过量的凡士林会堵塞滴定管）。试漏成功的滴定管要润洗两次，即注液杯、 支管、刻度管和出液尖嘴用滴定液洗涤两遍。3、由于支管拐弯处易藏气泡，一般待滴定液 放满刻度管后打开支管旋塞用洗耳球将溶液中气泡刚好吹入贮液杯中即可，也可缓慢倾斜滴 定管使气泡从口部溢出。滴定过程要注意爱护仪器，轻拿轻放。用(NH4)2SO4 滴定时，在接 近滴定终点左右时一定要每滴一滴，便彻底混匀后方可滴定下一滴。
1956年，瑞典Lund大学学者A1bertson首次利用双水相萃取技术分离生物分 子，开始对A邛s进行比较系统的研究，测定了许多ATPs的相图，考察了蛋白质、 核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在ATPS中的分配行为，为发展双水相萃取技术奠定 了坚实的基础。20世纪70年代以后，Hustedt、Kula和Johanson等人将双水相萃 取技术应用于生物产品分离，他们从工艺流程、操作参数、成本分析等方面对双 水相萃取技术的工业应用进行了分析和尝试”。自20世纪80年代初期起，双水相 莘取技术开始应用于工业生产，国内也开展了相关研究”。 2双水相萃取技术的发展趋势 2．1 新型双水相成相材料的开发
extraction[J]．Journal of Chromatography A，2004(1025)：297—301． [5]Zea D V L Mayerhoff．In es C Roerto．Telma T Franeo．Purification of xylose reductase
from Candida mngii in aqueous two—ph“e systems[J]．Biochemical Engineering Journal．2004，18：217—223． [6]Smote Nitsawang，Rajni Hatti Kaul，Pawinee Kanasawud．Purification of papain from Cariea papaya latex：Aqueous two·—phase extraction VersUS two——step salt precipitation[J]．Enzyme and Microbial Technology，2006，39：1103-1107．
实验内容
I PEG／(NH4)2SO4两水相系统相图的制作。
一．实验目的和要求
了解用浊点法(Cloud Point Method)制作双水相系统相图的方法，加深对 相图的认识。
二．实验原理
两种亲水性高聚物或高聚物与无机盐在水中会形成两个相，这是由于高 聚物的不相溶性或盐析作用而引起的，但是，它们只有达到一定的浓度时，才能 形成两相。两水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是一根双节线 (binodal)当成相组分的配比取在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后，溶 液澄清透明，称为均相区；在曲线的上方时，能自动分为两相，称为两相区，若 配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为浑浊。相图是研究双水相萃取 的基础。
三．操作方法
1、溶液配制
配制 43.0 ％(g／ml)的(NH4)2SO4,溶液：精确称取(NH4)2SO4 固体 430.0 g,用 少量水溶解后稀释到 1000 ml，并用密度计测定其密度。
2、相图的制作
精确称取 PEG400 液体 0．700 g 左右于试管中，按表(5－1)中所列第 1 号数 据，加入 0．5 ml H2O( H2O 的密度以 1 g／ml 计 )，用滴定管缓慢滴加已配好的 (NH4)2SO4,溶液，并不断在混和器上混和，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶 液开始出现浑浊为止。记录(NH4)2SO4 的加量(ml)，根据密度值求出重量(g)。然 后，按表格所列第 2 号数据加入 H2O，使其澄清(加 H2O 量根据点子的密集程度 控制)，继续向试管中滴加(NH4)2SO4 溶液，使其再次达到浑浊，如此反复操作。 计算每次达到浑浊时，PEG 和(NH4)2SO4 在系统总量中的重量百分含量(％)，实 验数据填入表格中，以 PEG 的百分浓度为纵坐标，(NH4)2SO4 百分浓度为横坐 标作图，即得到一条双节线的相图。
在生物分离工程中常用的A口s有两类：非离子型聚合物／非离子型聚合物／ 水系统和非离子型聚合物／无机盐／水系统。在实际应用中，这两类A什s各有优 缺点：前者体系对生物活性物质变性作用低、界面吸附少，但是所用的聚合物(如 葡聚糖)成本较高，而且体系黏度大，在工业化大规模生产时从经济角度丧失了 该系统的优势；后者成本相对低，黏度小，但是由于高浓度的盐废水不能直接排 人生物氧化池，使其可行性受到环保限制，且有些对盐敏感的生物物质会在这类 体系中失活。因此，研究成相材料、建立新型ATPs成为双水相萃取技术的主要发 展方向之一。 2．2双水相萃取技术与其他生物分离技术的集成
双水相萃取技术与其他相关的生物分离技术进行有效组合，实现了不同技术 间的相互渗透、相互融合，充分体现了集成化的优势，进一步提高分离效率或解 决各自存在的难点问题。双水相萃取与相关技术的集成可以归纳成为以下3个方 面：a．与温度诱导相分离、磁场作用、超声波作用、气溶胶技术等常规技术实 现集成化，改善了双水相萃取技术中诸如成相聚合物同收困难、相分离时间较长、
分离纯化出高纯度有生物活性的蛋白质一直是项艰巨的工作。由于蛋白质的 市场价格昂贵，提高回收率能带来巨大的经济效益，所以有关蛋白质在分离纯化 中的失活及其对策在近年来受到很大的关注。双水相萃取是通过溶质在两水相之 间分配系数的差异而进行萃取的技术，其应用于蛋白质的分离纯化具有以下优势： 体系含水量高．可达80％以上。萃取环境和操作条件温和，蛋白质在其中不易失 活；界面张力远远低于水一有机溶剂两相体系的界面张力，有助于强化相际闸的 质量传递；易于按比例放大和进行连续性操作等⋯。正是由于双水相萃取技术的 诸多优势，现已被广泛用于蛋白质的分离纯化，取得了很好的成效。近年来，双 水相萃取技术的分离对象进一步扩大，已包括了多肽、氨基酸、植物有效成分、 重金属离子和抗生素等。 1 双水相萃取技术在生物分离工程中的应用
1
吉林化工学院生物与食品工程学院专业实验
易乳化等问题，为双水相苹取技术的进一步成熟、完善奠定了基础_b．与色谱技
术等新型生化分离技术实现过程集成，充分融合了双方的优势，既提高了分离效
率，又简化了分离流程Ic．将生物转化、化学渗透释放和电泳等技术引入双水相
分配，给已有的技术赋予了新的内涵，为新分离过程的诞生提供了新的思路”。
吉林化工学院生物与食品工程学院专业实验
吉林化工学院 生物分离工程专业实验报告
课程类型： 生物分离工程实验
实验类型：
设计型实验
学年学期：2015-2016 学年第一学期
试验时间： 2015.10.8-2015.11.20
班 级：
学 号：
实 验 者：
合 作 者：
指导教师：
提交日期：2015 年 11 月 29 日 吉林化工学院
[7]Chang W J，Keo Y M．Recovery of 13-galactosidase from Ecoil double lysogen using aqueous two—phase system[J] Biotcehnol Tech．1998．12：455—457．
4
参考文献 [1]孙彦．生物分离工程[M]．北京：化学工业出版社．1998．64． [2]Albertsson PA chmmatography and panitjon of cells柚d cells and cell fragments
3
吉林化工学院生物与食品工程学院专业实验
[J]Nature，1956，177：77l～774， [3]谭大伟，沈忠耀．双水相萃取分离技术的评价和展望[J]．微生物学通报，1996，23(6)． [4]S Teotia，M N Gupta Purification of phospholipase D by two-phase affinity
Hale Waihona Puke 四、结果与分析表（5－1）相图制作表
2
PEG 400= 0.7 克
吉林化工学院生物与食品工程学院专业实验
次数
1 2 3 4 5 6 7 8
H2O 加量 （g）
0.5 0.3 0.3 0.3 0.5 0.5 0.5 0.5
(NH4)2SO4 溶 液加量 （g）
0.3 0.6 0.8 1.1 1.3 1.6 1.9 2.1
纯(NH4)2SO4 累计量（g）
0.3 0.9 1.7 2.8 4.1 5.7 7.6 9.7
溶液累计
总量（g）
1.5 2.4 3.5 4.9 6.7 8.8 11.2 13.8
温度 T＝
PEG400 （%）
46.67 29.17 20.00 14.29 10.45 7.95 6.25 5.07
20 ℃