荧光分光光度法
荧光分光光度法的名词解释
荧光分光光度法的名词解释荧光分光光度法是一种常用于分析化学领域的光谱分析技术。
它主要利用物质在受到紫外光激发后吸收能量并发射出可见光的特性进行定量和定性分析。
一、荧光现象解析1. 光激发与光发射在荧光分光光度法中，样品通常处于低能量状态，并能吸收特定波长的紫外光。
当样品受到紫外光激发后，部分激发态的分子会跃迁至高能量的激发态。
而在分子返回低能量态的过程中，会发射出比激发态能级较低的可见光，形成荧光现象。
这可用于分析样品的组成、浓度、结构及化学性质等。
2. 荧光寿命荧光寿命是指物质从受到激发到光发射结束所经过的时间。
荧光分光光度法可通过测量样品中发射的荧光光强随时间的变化，计算出荧光寿命。
荧光寿命与物质的环境、浓度、分子结构等因素有关，因此可以用来定量分析。
二、荧光分光光度法的原理1. 荧光光谱分析荧光分光光度法通过测量样品的荧光光谱来分析物质的成分和性质。
利用荧光光谱可以确定荧光发射的波长范围，并对不同波长处的发射强度进行测量。
这些荧光光谱图可以用来确定物质的定性和定量分析。
2. 荧光光度法荧光光度法利用荧光光度计测量样品的荧光强度和荧光寿命。
荧光光度计通常包含紫外-可见光源、光栅或单色仪、荧光探测器等。
样品受到激发后发射的荧光光通过光栅或单色仪进行分光，然后荧光探测器测量各个波长处的荧光强度。
这种光度计可提供高灵敏度和准确的荧光测量结果。
三、荧光分光光度法的应用1. 化学分析荧光分光光度法广泛应用于化学分析领域。
它可以通过测量荧光光谱和荧光强度，实现对物质浓度的定量测定，如荧光显微分析、荧光光谱分析、化学发光等。
此外，荧光分光光度法还可用于监测环境中的有毒物质和污染物。
2. 生物医学研究荧光分光光度法在生物医学研究中也具有重要应用。
例如，可以利用荧光探针与特定的生物分子结合，实现对DNA、RNA、蛋白质等生物分子的定性和定量分析。
此外，荧光分光光度法在药物研究、生物标记物探测、细胞成像等方面也发挥重要作用。
荧光分光光度法
在生物、医药、环境和石油工业等诸多 领域，荧光分析法都有广泛的应用。不仅能 直接或间接地分析众多的有机化合物，而且 还能利用与有机试剂间的反应进行许多无机 元素的测定。
整理课件
随着科技的发展进步，荧光这种光致发 光（photoluminescence）的本质被进一步揭 开。
❖ 物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外 和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不 同波长光的照射之后，同样也有发光现象。 例如：X-荧光、红外荧光等。
整理课件
a. 直接比较法
设CX、CS分别为试样和标样溶液的浓度， FX、FS和FX0、FS0分别为试样、标样的荧光 值和试样、标样的本底荧光值，因为
FX - FX0=KCX、 FS - FS0=KCS, 所以： Cx/Cs=( FX - FX0)/( FS - FS0) 或
Cx =Cs( FX - FX0)/( FS - FS0) 直接比较法简单快速，它要求被测样品 浓度与其相应的荧光值必须处于线性范围内。
光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶 液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧 光。
但是，在某些情况下，金属螯合物却能 产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的 测定。
整理课件
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
整理课件
3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱
荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
整理课件
a. 激发光谱：选择并固定发射波长EM和狭 缝宽度S，让激发单色器进行波长扫描，记 录荧光强度（F）随激发波长的变化而变化 的关系曲线，叫激发光谱。
6. 荧光分光光度法
芴 φ= 1.0 C H 2
3,4-苯并芘
( 强荧光物质)
刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶
剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素
和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚 酞却没有。
取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和 刚性会加强荧光:
COOH COOH
水杨酸
O C OH OH
OH OH
荧光灵敏 度（最大 吸收波长） 0.066
喹啉硫酸氢盐 (0.05mol· L-1H2SO4) 罗丹明B （酒精） 荧光素 （0.1mol· L-1NaOH 四 溴 荧 光 素 （0.1mol· L-1NaOH
544
571
0.17
0.88
490
515
0.20
1.0
518
540
0.18
0.19
硫堇 (0.05mol· L-1H2SO4)
芳香族化合物。共轭双键结构有利于发光。 共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大.
─(CH=CH)2─
φ=0.28
─(CH=CH)3─
φ=0.68
（3） 刚性平面结构
-O O -O O C O
C
COO-
COO-
酚酞(无荧光)
荧光素
O
N Mg N O
N O-
8－羟基喹啉(弱荧光)
红色荧光
联二苯 φ= 0.2
仪 器 光 路 图
15:41:25
• 激发光源 要求发射强度大,波长范围宽,而且在整个 波长范围内强度一致.常用高压汞灯和氙弧 灯. • 滤光片和分光器 干涉滤光片;分光器多采用光栅 • 样品室 样品室由样品池及样品转换器组成.其中 样品池用石英或低荧光的玻璃材料.
第八章 荧光分光光度法与检测技术
第八章 荧光分析法检测技术与应用
2. 用荧光分析法测定食品中维生素B2的含量：称取2.00g食品，用 10.0ml氯仿萃取（萃取率100%），取上清液2.00ml，再用氯仿稀释 为10.0ml。维生素B2氯仿标准溶液浓度为0.100µg/ml。测得空白溶液、 标准溶液和样品溶液的荧光强度分别为：F0=1.5，Fs=69.5，Fx=61.5， 求该食品中维生素B2的含量（μg/g）。
32
第八章 荧光分析法检测技术与应用
5. 下列叙述中，错误的是（ ）。 A、荧光分析的待测物应含有大π键 B、紫外分光光度法待测物应含有π键 C、质谱法待测物应含离子 D、气象色谱分析物的沸点应较低 6. 下列因素会导致荧光效率下降的有（ ）。 A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子
能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验证明，
在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这 是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。
19
第二节 荧光定量分析
一、荧光强度与物质浓度的关系
当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收 池内径）L时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸
收光的强度：F∝（I0 – I），用线性方程表示为：
➢ 最强荧光波长λem和最强激发波长λex是物质的定性 依据，也是定量测定时的最适宜波长。
➢强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构， 如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。
➢ 影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。
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第二节 荧光定量分析
第二节 荧光定量分析
由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同， 发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对
荧光分光光度法
∴随T变大碰撞变多，无辐射去激活 的几率增大。Kc增大。 大量实验证实：大多数分子，随T升 高。Ф f会变小。
2）信息多: 激发分光光谱（信 息同于 UV）、发射光光谱的发 光强度、发光寿命、量子效率、 荧光偏振等多种信息 ,定性更好;
3）工作曲线的线性范围宽（定量 更准） 应用范围也广微量元素的 分析、医药、环境,石油工业等能 直接或间接分析众多的有机物
4）专一性强：许多物质的测定采 用间接法.
伯乐公司的Labeled DNA 的荧光标 记物 Labeling kits.
? 一般来说系内交换的几率愈 大小取决于：
? 最低能量受激单一态与三重 态的能量间隔愈小;
? 最低能量受激单一态的寿命 愈长 ,(即发射光子愈慢 ) 几 率愈大。
7）磷光 phosphorescence 受激三重态上的粒子回到单一态 基态的形式是被禁戒的 .但还是可 发生的 原因：寿命很长(10-3S)及Δ E小.
2.荧光分析法主要应用范围
1）生物技术的分析 ,免疫技术的分 析,如DNA、抗体、抗原等; 2）痕量元素的分析，如 70多种无 机元素； 3）间接测定众多的有机物，包括 药物。
荧光分析一般分为三种：
1.X射线荧光分析（X射线） 2.原子荧光分析（激光） 3.分子荧光分析（汞弧灯）
3.优势
1）灵敏度高：比 UV高2~~3个 数量级.
荧光分光光度法
Flourescence 一. 简介 :
二.荧光发光的原理 : 三.量子效率 :
四. 荧光发光光谱仪的构造： 五. 荧光的定量分析：
六. 荧光光度计的发展
简介
1.和UV异同点 2.荧光分析法主要
荧光分光光度法
荧光分光光度法荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
荧光分光光度法
荧光效率（φf）=
2、分子结构与荧光的关系 A 长的共轭结构 例 激发光 荧光 205nm 278nm 286nm 321nm 0.29 356nm 404nm 0.36
荧光效率 0.11
B 分子的刚性和共平面性
荧光效率：0.2
1.0
C 取代基：给电子基团使荧光效率增大，如 -OH、-OCH3、-NH2等。
表面吸 光物质
F
问题（1）不同强度的光照射物质所产生 的荧光光谱形状是否相同？ （2）不同波长的光照射物质所产生的荧 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度? 单色器
I0
λex
I
表面吸 光物质
λem 单色器
检测器
3、激发光谱：荧光λex不变时，记录荧光 强度F与激发波长之间的关系。
单色器 F荧光的产生
（1）振动弛豫：同一电子能级电子从高的 振动能级到最低的振动能级。
电子能级
原因：分子碰撞 结果：热能，无辐射
振动能级
（2）内部能量的转移
产生原因：受激分子常由高电子能级以无辐射 （热）跃迁方式转移至低电子能级。
电子能级 振动能级
（3）荧光发射 无论分子处于哪一个激发单线态，通过内转换 及振动弛豫，均可返回到第一激发单线态最低 能级，然后以辐射的形式发射光量子而返回到 基态的任一能级。 第二激发态 第一激发态
散射光波长与荧光接近，对荧光强度测定 有干扰，使其读数增大。
荧 光 光 谱
散 射 光 谱
不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长 溶剂 水 248 271 313 350 365 416 405 469 436 511
乙醇
环已烷 四氯化 碳 氯仿
267
267 — —
344
荧光分光光度法测定荧光素的含量
荧光分光光度法测定荧光素的含量一、实验目的1.学习荧光分光光度法测定荧光素的分析原理。
2.掌握荧光分光光度计的操作技术和测定荧光素的方法。
二、实验原理荧光分析法，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。
在稀溶液中，荧光强度I F 与物质的浓度c 有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。
三、仪器及试剂1．仪器RF-5301PC 荧光分光光度计；2．试剂荧光素（分析纯）；四、操作步骤1.标准溶液配制准确称取0.0125g 荧光素标样，配制成500ml 溶液，则此溶液浓度为0.025g/L.移取此溶液10.0ml ，于50ml 容量瓶中用蒸馏水稀释bcI I F εφ0303.2=KcI F =至刻度。
分别移取此溶液 1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，于50ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后，待测定各标准溶液的荧光强度。
2.光谱的绘制(1)荧光光度计操作打开主机电源开关，预热大约30分钟。
开启氙灯。
(2)荧光素激发光谱的绘制，参数设置如下：①设定纵坐标②设定灵敏度；③设定扫描速度；④发射波长EMISSION Wavelength；⑤激发波长范围；⑥将某一浓度的荧光素标液置于试样池中；⑦扫描得到激发光谱。
(3)标准溶液及样品的测定，参数设置如下：①设定纵坐标②设定灵敏度；③设定扫描速度；④设定激发波长EXCITION Wavelength (从激发光谱曲线中)得到；⑤发射波长范围EMISSION Wavelength；⑥将1号标准溶液放入试样池中；⑦扫描得到荧光光谱。
仪器开始扫描，得到1号标准溶液的荧光强度。
荧光分光光度法
问题（ ） 问题（1）不同强度的光照射物质所产生 的荧光光谱形状是否相同？ 的荧光光谱形状是否相同？ （2）不同波长的光照射物质所产生的荧 ） 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度? 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度 单色器 I0 λex λem 单色器 检测器 I
表面吸 光物质
3、激发光谱：荧光λex不变时，记录荧光 、激发光谱：荧光 不变时， 强度F与激发波长之间的关系 与激发波长之间的关系。 强度 与激发波长之间的关系。
定性、 ③TLC定性、定量 定性
§2 原理 一、分子荧光产生 1、分子的电子能级： 、分子的电子能级：
C = C −C = C
ψ4 π*
π*
ψ3 ψ2 ψ1
π
π
三线态与单线态比较： 三线态与单线态比较： UV 基态单线态 ① 单线态 ②三线态
激发态 E2<E1 ，ε2<ε1， ② 的寿命可达 秒，而①的 的寿命可达1秒 寿命为10 跃迁几率① 寿命为 -8，跃迁几率①是②的106倍。
三、荧光与分子结构的关系 荧光物质发生荧光的过程： 荧光物质发生荧光的过程： A 荧光物质对光的吸收 B通过无辐射跃迁，跃迁到第一电子激发态 通过无辐射跃迁， 通过无辐射跃迁 的最低振动能级。 的最低振动能级。 C 跃迁至基态各振动能级 D 各振动能级分子，通过无辐射跃迁回基 各振动能级分子， 态的最低振动能级。 态的最低振动能级。
引起荧光熄灭的形式： 引起荧光熄灭的形式： 碰撞熄灭： 碰撞熄灭：由于碰撞而损失能量 化学淬灭：荧光物与加入的物质发生反应， 化学淬灭：荧光物与加入的物质发生反应， 生成新的化合物。 生成新的化合物。 体系间跨越：单线态变成三线态。 体系间跨越：单线态变成三线态。 自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生。 自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生。
荧光分光光度法
第二节 分子荧光强度的影响因素
一、荧光与有机化合物的结构
1. 跃迁的类型 对于有机荧光物质: 对于有机荧光物质: n →π* εmax＜ 100 平均寿命10 平均寿命10-5~10-7sec π→π* εmax≥104 平均寿命10 平均寿命10-7~10-9sec kS → T小 π*→π 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。 强荧光的有机化合物具备下特征: 强荧光的有机化合物具备下特征 具有大的共轭π键结构 键结构； ①具有大的共轭 键结构； 具有刚性的平面结构； ②具有刚性的平面结构； ③具有最低的单重电子激发态为S1为π * →π型； 具有最低的单重电子激发态为 型 取代基团为给电子取代基。 ④取代基团为给电子取代基。
4 3 2 1
S0
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
λex =290nm (MAX)
λ
λem= 620nm(MAX) 620nm(MAX)
2. 三维荧光光谱 I F ∝f (λex 、λem) 固定发射波长、扫描激发波长 固定发射波长、
1−
It = 1 −T = 1 − e−2.303εbC I0
I0 − It = I0 ( 1− e−2.303εbC )
荧光强度（ 与相应的吸光分数成正比： 荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：
IF =φ( I0 − It ) = φI0 ( 1− e−2.303εbC )
按照级数展开式： 按照级数展开式：
C. 激发光谱与发射 光谱的镜像关系
4 3 2 1
IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
荧光分光光度法特点
荧光分光光度法特点
1. 荧光分光光度法的特点之一就是超灵敏啊！就好比在一堆沙子里能精准找到那一粒特别的金沙。
比如说检测痕量物质，其他方法可能发现不了，但它就能敏锐地捕捉到，这多厉害呀！
2. 它的选择性也是杠杠的哟！就像一把精准的钥匙，只能打开与之匹配的锁。
比如在复杂的混合物中，能够专门针对我们想要检测的物质起反应，能做到这一点是不是很牛？
3. 荧光分光光度法的线性范围还很宽呢！这就像一条大路，可以容纳各种不同程度的车流。
例如在不同浓度的样品检测中都能很好地适用，多么了不起啊！
4. 哇塞，它的重复性也很好呀！就如同每次投篮都能投中同一个位置。
做多次实验都能得到相近的结果，这稳定性真让人惊叹！
5. 这个方法还简单快捷嘞！仿佛是按下快门就能瞬间捕捉到美好的瞬间。
不需要繁琐的步骤，快速就能给出结果，太方便啦！
6. 再者，荧光分光光度法能实现多组分同时测定呢！好像是一双慧眼，可以同时看清多种景象。
对于有多种成分的样品，能够同时分析出来，这可真是太妙啦！
我的观点结论就是：荧光分光光度法真的是一种非常出色且有着独特优势的分析方法呀！。
荧光分光光度法
荧光分光光度计的结构与操作
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荧光分光光度计的结构
荧光分光光度计由光源、单色器、样品池、检测 器等部分组成，各部分协同工作完成荧光光谱的 测量。
荧光分光光度计的操作步骤
操作步骤包括样品准备、仪器调试、参数设置、 数据采集与分析等，操作时应严格按照仪器说明 书进行。
荧光分光光度计的维护与保养
为了保持仪器的性能和延长使用寿命，应定期对 仪器进行维护和保养，如清洁光学元件、检查电 路连接等。
荧光分光光度法
目录
CONTENTS
• 荧光分光光度法简介 • 荧光分光光度法的基本原理 • 荧光分光光度法的实验技术 • 荧光分光光度法的应用实例 • 荧光分光光度法的挑战与展望
01 荧光分光光度法简介
CHAPTER
定义与原理
定义
荧光分光光度法是一种基于荧光物质与激发光的相互作用， 通过测量荧光光谱来研究荧光物质性质的分析方法。
利用荧光染料标记DNA或RNA，通过 荧光光谱法检测基因表达和突变，以 及DNA和RNA的定量分析。
在环境监测领域的应用
污染物检测
荧光分光光度法可用于检测水体、土壤和空气中的有 害物质，如重金属、农药、酚类化合物等。
饮用水安全
通过荧光光谱法检测饮用水中的消毒副产物，确保饮 用水安全。
生态毒理学研究
荧光光谱的定量分析方法
荧光光谱的定量分析原理
荧光光谱的定量分析基于荧光物质浓度与荧 光强度之间的线性关系，通过测量荧光强度 可以推算出荧光物质的浓度。
荧光光谱的定量分析方法
定量分析方法包括标准曲线法、内标法、外标法等 ，应根据实验需求选择合适的分析方法。
荧光光谱的定量分析误差 来源
误差来源包括仪器误差、样品不均匀性、操 作误差等，应采取相应措施减小误差，提高 分析精度。
荧光分光光度法 (Fluorescence Spectrophotometry)
荧光分光光度法(Fluorescence Spectrophotometry)前言：•1852年，斯托克斯（Stokes）发现萤石在暗处受到光的照射会发出一种蓝白色的光，他把这种光命名为“荧光”。
•1868年Goppelstroeder发表了利用Al-桑色素绿色荧光来分析微量Al的分析方法，可见荧光分析是一种历史悠久的分析方法。
时至今日，荧光分析在方法上取得了极大的进展。
促进了诸如：时间分辨、相分辨、荧光偏振、荧光免疫、同步荧光等荧光分析新方法的发展，同时促使各种各样新型荧光分析仪器的出现。
在仪器化方面，微机控制的全自动荧光分析仪具有灵敏度高（比紫外-可见分光光度法高2~3个数量级）、选择性好、工作曲线线性范围宽，且能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、偏振和各向异性诸多信息等优点，已成为一种重要的痕量分析技术。
在生物、医学、医药、环境和石油工业等诸多领域，荧光分析法都有广泛的应用。
不仅能直接和间接地分析众多的有机化合物，而且利用与有机试剂间的反应还能进行许多无机元素的测定。
随着科技的发展进步，荧光这种光致发光（photoluminescence）的本质进一步被揭开：•物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不同波长光的照射后，同样也有发光现象。
例如：X-荧光、红外荧光等。
•除了吸收光能使分子激发而发光，根据起始激发形成的方式，可以将荧光同其它的发光类型（例如：生物发光、热发光、化学发光和摩擦发光）区别开来。
•通过化学反应使分子受激而发光称为“化学发光”。
利用化学发光进行分析工作叫“化学发光分析”。
•化学发光分析、荧光分析和磷光分析统称为“分子发光分析(molecular luminescence)”。
•荧光和磷光同属光致发光。
通过测定发光的强度可以定量测定许多痕量的无机物和有机物。
•相对于磷光和化学发光而言，目前荧光法的应用较多。
本章主要讨论荧光分析。
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荧光分光光度法
2015年版《药典》四部通则0405
某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。
物质的激发光谱和荧光发射光谱，可用于该物质的定性分析。
当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用于该物质的含量测定。
荧光分光光度法的灵敏度一般较紫外-可见分光光度法高，但浓度太高的溶液会发生“自熄灭”现象，而且在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，故荧光分光光度法应在低浓度溶液中进行。
测定法
所用的仪器为荧光计或荧光分光光度计，按各品种项下的规定，选定激发光波长和发射光波长，并制备对照品溶液和供试品溶液。
通常荧光分光光度法是在一定条件下，测定对照品溶液荧光强度与其浓度的线性关系。
当线性关系良好时，可在每次测定前，用一定浓度的对照品溶液校正仪器的灵敏度；然后在相同的条件下，分别读取对照品溶液及其试剂空白的荧光强度与供试品溶液及其试剂空白的荧光强度，用下式计算供试品浓度：
为供试品溶液的浓度；
式中 c
X
为对照品溶液的浓度；
c
r
为供试品溶液的荧光强度；
R
x
为供试品溶液试剂空白的荧光强度；
R
Xb
为对照品溶液的荧光强度；
R
r
R
rb
为对照品溶液试剂空白的荧光强度。
因荧光分光光度法中的浓度与荧光强度的线性较窄，故（R
x -R
Xb
）/
（R
r-R
rb
）应控制在0.5～2之间为宜，如若超过，应在调节溶液浓度后再
进行测定。
当浓度与荧光强度明显偏离线性时，应改用标准曲线法进行含量测定。
对易被光分解或弛豫时间较长的品种，为使仪器灵敏度定标准确，避免因激发光多次照射而影响荧光强度，可选择一种激发光和发射光波长与供试品近似而对光稳定的物质配成适当浓度的溶液，作为基准溶液。
例如蓝色荧光可用硫酸奎宁的稀硫酸溶液，黄绿色荧光可用荧光素钠水溶液，红色荧光可用罗丹明B水溶液等。
在测定供试品溶液时选择适当的基准溶液代替对照品溶液校正仪器的灵敏度。
【附注】荧光分光光度法因灵敏度高，故应注意以下干扰因素。
（1）溶剂不纯会带入较大误差，应先做空白检查，必要时，应用玻璃磨口蒸馏器蒸馏后再用。
（2）溶液中的悬浮物对光有散射作用，必要时，应用垂熔玻璃滤器滤过或用离心法除去。
（3）所用的玻璃仪器与测定池等也必须保持高度洁净。
（4）温度对荧光强度有较大的影响，测定时应控制温度一致。
（5）溶液中的溶氧有降低荧光作用，必要时可在测定前通入惰性气体除氧。
（6）测定时需注意溶液的pH值和试剂的纯度等对荧光强度的影响。