大花蕙兰四倍体的离体诱导和鉴定
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Abstract :Investigatio ns were carried o ut o n t he effect s of colchicine t reat ment o n p roliferatio n ,differentia2 tio n and tet raploid inductio n of p rotoco rm2like bo dies ( PLBs) of Cy mbi di um‘sunrise’by using of tissue cult ure met hod. The result s showed t hat colchicine t reat ment had o bvio usly inhibitio n effect s o n t he growt h and differentiatio n of PLBs ,and increased t he browning and deat h rate of PLBs ;t he higher t he co n2 cent ratio n of colchicine and t he lo nger t he t reat ment time were , t he st ro nger t he inhibitio n effect s were. Tet raploids were p roduced in all colchicine t reat ment s ,but t he inductio n rate was not t he same in vario us t reat ment s ,t he highest inductio n rate ,23. 7 % ,was o btained by t reating PLBs in MS medium wit h 0. 05 % colchicine for 5 days. The lengt h of sto matal guard cell and t he densit y of sto matal cell bet ween diploid and it s tet raploid were bot h significantly different . The tet raploid plant wit h darker and harder leaves was more st urdy and co mpacted in appearance co mpared to diploid o ne. It is a p ractical way of creating polyploids in Cy mbi di um h y bri di um by t he use of tissue cult ure co mbined wit h colchicine t reat ment met ho d. Key words :Cy m bi di um h y bri di um ;p rotoco rm2like bo dy ;colchicine ;tet raploid ; sto mata
1 材料和方法
1. 1 材 料 以大花蕙兰‘日出’的茎尖为外植体诱导产生类
原球茎 , 继代培养后 , 将生长旺盛的类原球茎切 成0. 5 cm3 大小的类原球茎切块用于多倍体诱导 试验 。
试验所用的秋水仙素为 Sigma 公司原装进口 (产品批号 C29754) 。 1. 2 方 法 1. 2. 1 秋水仙素处理 将类原球茎切块浸入不同 浓度秋水仙素的液体培养基中 ,在转速为 90 r/ min 的摇床上处理一定时间 (表 1) ,处理时间短的材料
西北植物学报 ,2010 ,30 (1) :0056 - 0062 Act a Bot . Boreal. 2Occi dent . Si n.
3
文章编号 :100024025 (2010) 0120056207
大花蕙兰四倍体的离体诱导和鉴定
王木桂1 ,曾瑞珍1 ,谢 利1 ,黎扬辉2 ,曾飞燕2 ,杜宝贵2 ,张志胜1 3
秋水仙素处理和组织培养相结合是诱导观赏植 物产生多倍体的有效方法 ,运用该方法已经在虞美 人[3 ] 、矮牵牛[4 ] 、齿瓣石斛[5 ] 、红掌[6 ] 、杜鹃[7 ] 、非洲 紫罗兰[8 ] 、A l ocasi a[9 ] 、R os a ru gos a[10 ] 、Phl ox s ubu2 l at a[11] 等取得了成功 。在大花蕙兰的多倍体诱导 上 ,张志胜等[12 ] 以墨兰 ×大花蕙兰的杂种 F1 类原 球茎为材料 ,不同浓度的秋水仙素处理均诱导出疑 为多倍体的变异植株 ,但未对变异植株进行染色体 鉴定 。杨丽娟等[13] 对大花蕙兰‘红宝石’进行了秋 水仙素处理 ,也获得了大量变异植株 。邓樱等[14] 对 秋水仙素诱导兰属‘素心黄’的方法进行了研究 ,获 得一定比例的四倍体植株 ,但关于秋水仙素处理对 大花蕙兰的诱导效应缺乏系统的研究 ,也未涉及二 倍体与四倍体植株气孔性状的比较 。
紧凑 ,叶片颜色浓绿 、质地变硬 。秋水仙素处理和组织培养相结合是创建大花蕙兰多倍体的有效方法 。
关键词 :大花蕙兰 ;类原球茎 ;秋水仙素 ;四倍体 ;气孔
中图分类号 :Q813. 5
文献标识码 :A
I n vit r o Induction and Its Identif ication of Tetraploid Cymbi di um hybri di um
本实验室通过墨兰和大花蕙兰杂交于 2004 年 培育出大花蕙兰新品种‘日出’[15] ,该品种具有花朵 数多 、适应性好 、不用上山催花等优点 ,但其株型较 分散 、花朵偏小 。本研究以‘日出’类原球茎为材料 , 系统地研究秋水仙素处理对兰花类原球茎生长 、分 化和四倍体诱导效率的影响 ,旨在建立高效的多倍 体诱导和鉴定技术体系 ,为有效开展大花蕙兰多倍 体育种奠定基础 ,同时期望通过染色体加倍改良‘日 出’的缺陷 ,获得观赏性状优良的新资源 。
(1 华南农业大学 广东省植物分子育种重点实验室 ,广州 510642 ;2 广州花卉研究中心 ,广州 510360)
摘 要 :采用组织培养方法研究了秋水仙素处理对大花蕙兰类原球茎增殖 、分化和四倍体诱导的效应 。结果表明 ,
秋水仙素处理明显抑制类原球茎的增殖和分化 ,提高类原球茎褐变率和死亡率 ;在试验浓度和时间范围内 ,秋水仙
大花蕙兰 ( Cy m bi di um hy bri di um ) 花大色艳 、 前景 。培育观赏性状优良 、适应性好 、具浓郁香气和 花期长 ,既可做盆栽 ,也可做切花 ,具有广阔的市场 易进行花期调控的大花蕙兰新品种对推动中国兰花
3收稿日期 :2009208221 ;修改稿收到日期 :2009212216 基金项目 :广东省科技攻关项目 (2006A20201002) ;广东省重大专项 (2009B20201009) 项目资助 作者简介 :王木桂 (1984 - ) ,男 (汉族) ,在读硕士研究生 ,主要从事花卉遗传育种及组织培养研究 。E2mail :chlise1 @163. co m 3 通讯作者 :张志胜 ,博士 ,教授 ,主要从事花卉遗传育种及细胞工程研究 。E2mail :zszhang @scau. edu. cn
素浓度越高 ,处理时间越长 ,抑制作用越强 ,解除抑制作用所需的继代次数越多 。所有秋水仙素处理均能诱导出四
倍体 ,但不同处理的四倍体诱导率不同 ,当处理浓度为 0. 05 %、时间为 5 d 时 ,四倍体诱导率最高 ,为 23. 7 %。二倍
体及其四倍体的气孔保卫细胞长度和气孔密度均存在极显著的差异 。四倍体植株比二倍体矮 ,茎部较粗壮 ,株型
1 期 王木桂 ,等 :大花蕙兰四倍体的离体诱导和鉴定
Байду номын сангаас
57
产业的发展 ,提高中国兰花产业的竞争力和效益具 有重要意义 。
多倍体育种是兰花育种的重要方法之一[1] 。朱 根发等[2] 对引进的 33 个大花蕙兰品种进行了染色 体分析及倍性鉴定 。结果表明 ,大花蕙兰栽培品种 中有二倍体 、三倍体 、四倍体 ,也有非整倍体 ,以三倍 体和四倍体居多 。因此创造大花蕙兰多倍体资源 , 对推动兰花倍性育种工作的开展具有重要作用 。
在处理完成后转入不含秋水仙素的液体培养基中培 养 ,保证不同处理的类原球茎切块在液体中培养的 时间与对照一致 。处理温度为 (26 ±1) ℃。 1. 2. 2 处理材料的继代 处理后的材料接种到1/ 2 MS (大量元素减半) + 62BA1. 0 mg ·L - 1 + NAA 0. 2 mg ·L - 1 + 活性炭 0. 5 g ·L - 1 + 椰子汁 100 mL ·L - 1 + 卡拉粉 7. 5 g ·L - 1 + 蔗糖 20 g ·L - 1 的 固体继代培养基中 ,每瓶接入 10 块左右 ,每一处理 设 2 个重复 ,每一重复最小样本容量为 30 块 。接种 后把材料放在 (26 ±1) ℃、持续光照的培养室中进行 培养 ,1 个月继代一次 ,不同处理下的材料均继代到 恢复正常增殖与分化 。培养过程中观察类原球茎的 生长情况 ,每继代一次均统计死亡类原球茎块数 、褐 变类原球茎块数 、分化出的芽数和苗数 ,用感量为 0. 01 g 的 Sartorius 天平称重 。在继代过程中死亡 和褐化严重的类原球茎不转入下一代 ,分化出的苗 另转壮苗培养基培养并移栽 。按下列公式计算褐变 率 、死亡率 、绝对生长速度 、芽分化率 、苗分化率 :
WAN G Mu2gui1 ,ZEN G Rui2zhen1 ,XIE Li1 ,L I Yang2hui2 ,ZEN G Fei2yan2 , DU Bao2gui2 ,ZHAN G Zhi2sheng1 3
(1 Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding ,Sout h China Agricult ural U niversit y , Guangzhou 510642 , China ;2 Guangzhou Flower Research Center , Guangzhou 510360 ,China)
褐变率 ( %) = (褐变块数/ 接种总块数) ×100 % 死亡率 ( %) = (死亡块数/ 接种总块数) ×100 % 绝对生长速度 ( %) = ( 培养后重量 - 接种重 量) / 接种重量 ×100 % 芽分化率 ( %) = (分化出的芽数/ 接种类原球茎 块数) ×100 % 苗分化率 ( %) = (分化出的苗数/ 接种类原球茎 块数) ×100 % 1. 2. 3 再生植株的染色体鉴定 在再生植株群体 中 ,每一处理随机抽取 30 株以上的植株 ,进行染色 体数目鉴定 。参考张志胜等[6] 的压片法 ,根据大花 蕙兰根尖的特点进行了改进 。具体步骤如下 :切取 大花蕙兰 植株幼 嫩的 根尖 2 ～ 3 mm , 洗 净后 , 于 15 ℃黑暗条件下 ,在 0. 002 mol ·L - 1 的 82羟基喹啉 中浸泡 7～9 h ;清水洗净后 ,加入新配制的卡诺氏 液于 4 ℃冰箱固定 12 ～ 24 h ; 然后用 1 mol ·L - 1 HCl 先在室温下酸解 3 min ,然后转到 60 ℃的恒温 水浴锅中酸解 9 min ,蒸馏水洗净 ;切取根尖的分生 组织放在预先滴一滴卡诺氏液的载波片上 ,用镊子 压碎 ,弃去残渣 ,快速经过酒精灯的火焰 2～3 次 ;滴 一滴石炭酸品红进行染色 ,染料快干时盖上盖玻片 , 用镊子轻压几下 ,快速经过火焰 6～7 次 。每被测植 株统计 20 个以上细胞 ,85 %以上具有恒定一致的染 色体数作为该植株的染色体数目 ,在 Olymp us2IX71 倒置显微镜下观察 ,选取染色体分散好的细胞拍照 , 并按下述公式计算四倍体诱导率 :
1 材料和方法
1. 1 材 料 以大花蕙兰‘日出’的茎尖为外植体诱导产生类
原球茎 , 继代培养后 , 将生长旺盛的类原球茎切 成0. 5 cm3 大小的类原球茎切块用于多倍体诱导 试验 。
试验所用的秋水仙素为 Sigma 公司原装进口 (产品批号 C29754) 。 1. 2 方 法 1. 2. 1 秋水仙素处理 将类原球茎切块浸入不同 浓度秋水仙素的液体培养基中 ,在转速为 90 r/ min 的摇床上处理一定时间 (表 1) ,处理时间短的材料
西北植物学报 ,2010 ,30 (1) :0056 - 0062 Act a Bot . Boreal. 2Occi dent . Si n.
3
文章编号 :100024025 (2010) 0120056207
大花蕙兰四倍体的离体诱导和鉴定
王木桂1 ,曾瑞珍1 ,谢 利1 ,黎扬辉2 ,曾飞燕2 ,杜宝贵2 ,张志胜1 3
秋水仙素处理和组织培养相结合是诱导观赏植 物产生多倍体的有效方法 ,运用该方法已经在虞美 人[3 ] 、矮牵牛[4 ] 、齿瓣石斛[5 ] 、红掌[6 ] 、杜鹃[7 ] 、非洲 紫罗兰[8 ] 、A l ocasi a[9 ] 、R os a ru gos a[10 ] 、Phl ox s ubu2 l at a[11] 等取得了成功 。在大花蕙兰的多倍体诱导 上 ,张志胜等[12 ] 以墨兰 ×大花蕙兰的杂种 F1 类原 球茎为材料 ,不同浓度的秋水仙素处理均诱导出疑 为多倍体的变异植株 ,但未对变异植株进行染色体 鉴定 。杨丽娟等[13] 对大花蕙兰‘红宝石’进行了秋 水仙素处理 ,也获得了大量变异植株 。邓樱等[14] 对 秋水仙素诱导兰属‘素心黄’的方法进行了研究 ,获 得一定比例的四倍体植株 ,但关于秋水仙素处理对 大花蕙兰的诱导效应缺乏系统的研究 ,也未涉及二 倍体与四倍体植株气孔性状的比较 。
紧凑 ,叶片颜色浓绿 、质地变硬 。秋水仙素处理和组织培养相结合是创建大花蕙兰多倍体的有效方法 。
关键词 :大花蕙兰 ;类原球茎 ;秋水仙素 ;四倍体 ;气孔
中图分类号 :Q813. 5
文献标识码 :A
I n vit r o Induction and Its Identif ication of Tetraploid Cymbi di um hybri di um
本实验室通过墨兰和大花蕙兰杂交于 2004 年 培育出大花蕙兰新品种‘日出’[15] ,该品种具有花朵 数多 、适应性好 、不用上山催花等优点 ,但其株型较 分散 、花朵偏小 。本研究以‘日出’类原球茎为材料 , 系统地研究秋水仙素处理对兰花类原球茎生长 、分 化和四倍体诱导效率的影响 ,旨在建立高效的多倍 体诱导和鉴定技术体系 ,为有效开展大花蕙兰多倍 体育种奠定基础 ,同时期望通过染色体加倍改良‘日 出’的缺陷 ,获得观赏性状优良的新资源 。
(1 华南农业大学 广东省植物分子育种重点实验室 ,广州 510642 ;2 广州花卉研究中心 ,广州 510360)
摘 要 :采用组织培养方法研究了秋水仙素处理对大花蕙兰类原球茎增殖 、分化和四倍体诱导的效应 。结果表明 ,
秋水仙素处理明显抑制类原球茎的增殖和分化 ,提高类原球茎褐变率和死亡率 ;在试验浓度和时间范围内 ,秋水仙
大花蕙兰 ( Cy m bi di um hy bri di um ) 花大色艳 、 前景 。培育观赏性状优良 、适应性好 、具浓郁香气和 花期长 ,既可做盆栽 ,也可做切花 ,具有广阔的市场 易进行花期调控的大花蕙兰新品种对推动中国兰花
3收稿日期 :2009208221 ;修改稿收到日期 :2009212216 基金项目 :广东省科技攻关项目 (2006A20201002) ;广东省重大专项 (2009B20201009) 项目资助 作者简介 :王木桂 (1984 - ) ,男 (汉族) ,在读硕士研究生 ,主要从事花卉遗传育种及组织培养研究 。E2mail :chlise1 @163. co m 3 通讯作者 :张志胜 ,博士 ,教授 ,主要从事花卉遗传育种及细胞工程研究 。E2mail :zszhang @scau. edu. cn
素浓度越高 ,处理时间越长 ,抑制作用越强 ,解除抑制作用所需的继代次数越多 。所有秋水仙素处理均能诱导出四
倍体 ,但不同处理的四倍体诱导率不同 ,当处理浓度为 0. 05 %、时间为 5 d 时 ,四倍体诱导率最高 ,为 23. 7 %。二倍
体及其四倍体的气孔保卫细胞长度和气孔密度均存在极显著的差异 。四倍体植株比二倍体矮 ,茎部较粗壮 ,株型
1 期 王木桂 ,等 :大花蕙兰四倍体的离体诱导和鉴定
Байду номын сангаас
57
产业的发展 ,提高中国兰花产业的竞争力和效益具 有重要意义 。
多倍体育种是兰花育种的重要方法之一[1] 。朱 根发等[2] 对引进的 33 个大花蕙兰品种进行了染色 体分析及倍性鉴定 。结果表明 ,大花蕙兰栽培品种 中有二倍体 、三倍体 、四倍体 ,也有非整倍体 ,以三倍 体和四倍体居多 。因此创造大花蕙兰多倍体资源 , 对推动兰花倍性育种工作的开展具有重要作用 。
在处理完成后转入不含秋水仙素的液体培养基中培 养 ,保证不同处理的类原球茎切块在液体中培养的 时间与对照一致 。处理温度为 (26 ±1) ℃。 1. 2. 2 处理材料的继代 处理后的材料接种到1/ 2 MS (大量元素减半) + 62BA1. 0 mg ·L - 1 + NAA 0. 2 mg ·L - 1 + 活性炭 0. 5 g ·L - 1 + 椰子汁 100 mL ·L - 1 + 卡拉粉 7. 5 g ·L - 1 + 蔗糖 20 g ·L - 1 的 固体继代培养基中 ,每瓶接入 10 块左右 ,每一处理 设 2 个重复 ,每一重复最小样本容量为 30 块 。接种 后把材料放在 (26 ±1) ℃、持续光照的培养室中进行 培养 ,1 个月继代一次 ,不同处理下的材料均继代到 恢复正常增殖与分化 。培养过程中观察类原球茎的 生长情况 ,每继代一次均统计死亡类原球茎块数 、褐 变类原球茎块数 、分化出的芽数和苗数 ,用感量为 0. 01 g 的 Sartorius 天平称重 。在继代过程中死亡 和褐化严重的类原球茎不转入下一代 ,分化出的苗 另转壮苗培养基培养并移栽 。按下列公式计算褐变 率 、死亡率 、绝对生长速度 、芽分化率 、苗分化率 :
WAN G Mu2gui1 ,ZEN G Rui2zhen1 ,XIE Li1 ,L I Yang2hui2 ,ZEN G Fei2yan2 , DU Bao2gui2 ,ZHAN G Zhi2sheng1 3
(1 Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding ,Sout h China Agricult ural U niversit y , Guangzhou 510642 , China ;2 Guangzhou Flower Research Center , Guangzhou 510360 ,China)
褐变率 ( %) = (褐变块数/ 接种总块数) ×100 % 死亡率 ( %) = (死亡块数/ 接种总块数) ×100 % 绝对生长速度 ( %) = ( 培养后重量 - 接种重 量) / 接种重量 ×100 % 芽分化率 ( %) = (分化出的芽数/ 接种类原球茎 块数) ×100 % 苗分化率 ( %) = (分化出的苗数/ 接种类原球茎 块数) ×100 % 1. 2. 3 再生植株的染色体鉴定 在再生植株群体 中 ,每一处理随机抽取 30 株以上的植株 ,进行染色 体数目鉴定 。参考张志胜等[6] 的压片法 ,根据大花 蕙兰根尖的特点进行了改进 。具体步骤如下 :切取 大花蕙兰 植株幼 嫩的 根尖 2 ～ 3 mm , 洗 净后 , 于 15 ℃黑暗条件下 ,在 0. 002 mol ·L - 1 的 82羟基喹啉 中浸泡 7～9 h ;清水洗净后 ,加入新配制的卡诺氏 液于 4 ℃冰箱固定 12 ～ 24 h ; 然后用 1 mol ·L - 1 HCl 先在室温下酸解 3 min ,然后转到 60 ℃的恒温 水浴锅中酸解 9 min ,蒸馏水洗净 ;切取根尖的分生 组织放在预先滴一滴卡诺氏液的载波片上 ,用镊子 压碎 ,弃去残渣 ,快速经过酒精灯的火焰 2～3 次 ;滴 一滴石炭酸品红进行染色 ,染料快干时盖上盖玻片 , 用镊子轻压几下 ,快速经过火焰 6～7 次 。每被测植 株统计 20 个以上细胞 ,85 %以上具有恒定一致的染 色体数作为该植株的染色体数目 ,在 Olymp us2IX71 倒置显微镜下观察 ,选取染色体分散好的细胞拍照 , 并按下述公式计算四倍体诱导率 :