第二章：细胞生物学研究方法 考研细胞生物学辅导讲义
细胞生物学 第二章细胞生物学研究方法
§1 细胞形态结构的观察方法
三、扫描隧道显微镜 （Scanning tunneling microscope，STM）
• 于1981年发明，发明者获 1986年度诺贝尔物理学奖。
• 特点： ①具有原子尺度的高分辨力，
侧（横）分辨率为0.1-0.2nm， 纵分辨率0.001nm； ②除在真空外，还可在空气、 液体等条件下观察； ③非破坏性测量：不受电子 束的轰击、破坏。
• 因此，可用已知的抗体检测未知的抗原。
• 但多数抗原-抗体结合后不出现可见反应，即不能检测 到二者的这种特异性结合。如何检测抗原-抗体发生了 结合反应？
• 用一种可见的标记物标记抗体，通过检测标记物的存
在与否判断抗原-抗体是否发生了结合反应——免疫标
记技术。
抗原
标记物
抗体
二、特异蛋白抗原的定位与定性
s 将二次电子收集并经一系列 的处理在荧光屏上成像。
s 这样，可以得到样品表面的 立体图像。
二、电子显微镜
• 扫描电镜的样品制备：
s 取材； s 固定； s 脱水； s 临界点干燥； s 喷镀； s 电镜观察。
• 分辨本领：较低，一般 在3nm。
• 放大倍数：几万倍。
二、电子显微镜
• 特点：成像具有立体 感。
• 可见光的波长400700nm。
• 光学显微镜的最大分辨 率为0.2μm。
一、光学显微镜
• 光镜样品制备： 石蜡包埋切片， 苏木精-伊红染色。
一、光学显微镜
（二）相差显微镜和微分 干涉显微镜
• 原理：利用显微镜中的 特殊装置，使光线通过 样品时波长和振幅发生 变化，以增大样品明暗 的反差。
• 用途：这两种显微镜可 用于观察未染色的活细 胞的细胞结构及其动态 变化。
细胞生物学研究方法专题讲座讲解材料课件-PPT
II.荧光能量共振转移的条件
1.供体与受体间的距离 <10nm或=1-7nm
用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。
laser confocal scanning microscope, LCSM
sin α /2的最大于值必普然小通于1光； 学显微镜的特殊之处:
Robert Hooke 用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；
• 4. 分辨力： 最重要参数.
•
D=0.61λ/N．A．
– 其中λ为入射光线波长；N．A＝ｎsin(α/2
)，为镜口率 , n=介质折射率；α=镜口角（样品 对物镜镜口的张角） 。
•如何提高显微镜的分辨能力？
• 增加分辨率的二个必备条件: • 增大镜口率---有一定限度 • 缩短波长---为可靠办法
显微镜的发明打开了微观世界的大门
光学显微镜
透射电子显微镜
扫描电子显微镜
—、光学显微技术
• 普通复式光学显微镜 • 荧光显微镜 • 激光共聚焦扫描显微镜 • 暗视野显微镜 • 相差和微分干涉显微镜 • 倒置显微镜
（一）普通光学显微镜 Light microscopy
1.显微镜的发明
➢ 300多年前 Leeuwenhoek 世界上最早的显微镜
原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。
七、基因作图与人类基因组计划
常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。
第一节 细胞形态结构的观察方法
用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；
• 光学显微镜的几个光学特点：
– 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介 质的折射率越接近玻璃的越好。
第二章 细胞生物学研究方法
光学显微镜技术（Optical microscopy）
4、暗视野显微镜
（Dark field microscope）
原理 特殊的聚光器，使得光线不能直接 进入物镜，被样品散射的光线确可以进 入 主要物用镜途而被放大。因此，在黑暗的背景 中观可察活以细看胞到外明形亮清晰的图像。
Autoradiography 流程
支持物
清洗混合
Cells
脱水并包埋于石蜡或 塑料中
细胞和放射性 化合物共孵育
固定
显影
银粒位置
玻片 背景银粒
感暗光室层储乳中液存胶等态乳于待感胶曝光 光支持物
支持物 容器
玻片
玻片
Autoradiography Autoradiograph
显示DNA合成部位
三、 细胞的分离和分析技术
传代培养 (Secondary culture) 将适应了体外条件的原代培养细胞进 行传代和扩大培养。
细胞培养（Cell culture）
体外培养细胞的特性
贴壁生长
多数体外培养细胞需要贴附于玻璃或特殊塑料表 面才能生长、分裂，形成单层细胞（single layer cell）的现象。
接触抑制 (contact inhibition)
原理
电子束穿透样品而成像
主要用途 观察细胞超显微结构
电子显微镜技术（Electron microscopy）
透射电镜图片
制样技术
1）超薄切片
• 用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的 超薄切片，用超薄切片机制作。
• 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级 脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推 进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。
细胞生物学 第2章 细胞生物学研究方法
PRA在散发性浸润性乳腺导管癌中 的表达
王辛，赵彤，赵嘉佳，熊静波. 中华医学杂志 2010， 90（20）：1399-1402
（三）原位杂交技术
• 自学
三、 细胞分离技术
（一）离心分离技术
用离心力和沉降系数的差异进行分离、浓缩和提纯的方法。 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基
描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。
Scanning electron microscope（ SEM）
• 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面
激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，
次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电
子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。
（四）暗视野显微镜 dark field microscope
• 用于观察活细胞等无色透明标 本 • 聚光镜中央有挡光片，照明光
线不直接进人物镜，只允许被
标本反射和衍射的光线进入物 镜，因而视野的背景是黑的， 物体的边缘是亮的。 • 可观察 4~200nm的微粒子，
分辨率比普通显微镜高50倍。
（五）相差显微镜
• dX/dt=[2r2 (ρp—ρM) /9η]· · g=s g
• 式中dX/dt为粒子的沉降速度，ρp:颗粒的密度；ρM：悬浮 介质的密度；η：介质粘度；r：为粒子的半径；g：为重 力加速度。 • S：沉降系数（sendimetation coefficient）， 与颗粒直 径、颗粒密度、介质密度、介质粘度有关； • S的单位：秒; • 习惯上把10-13s作为沉降系数的单位（svedberg unit）， 简称S（大写）
λ=光源波长，可见光0.5um N=介质折射率,空气为1,油为1.5 θ=物镜镜口张角的半角
ru-第2章 细胞生物学研究方法 20170925(2)
描电镜
13
2.2 细胞组分的分析方法 2.2.1 细胞化学技术 （cytochemistry） 2.2.2 细胞分选 (cell sorting) 2.2.3 细胞组分的分离 (isolation of cell component)
14
2.2.1 细胞化学技术（cytochemistry）
Cell morphology + cell component analysis
◆酶细胞化学技术（酶与底物） 酶细胞化学技术就是通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细 胞内的定位。
◆免疫细胞化学技术（抗原抗体） 利用免疫反应定位组织或细胞中的抗原成分分布 免疫荧光技术 免疫电镜技术
◆放射自显影技术 (radioautography)：利用放射性同位素标记研 究细胞内大分子的合成动态（分布、定位、排出、合成等）
? ? ? 最大分辨率
a:70° n:1.5(油) λ :450nm(可见光)
200nm(紫外光)4
2.1.1.2 常用光学显微镜：
◆普通双筒显微镜
(binoular microscope) ◆相差显微镜:
(phase contrast microscope) ◆微分干涉显微镜
(differential interference microscope） 微镜
(The Light Microscope) (Electron microscope)
照明系统 (illumination)
可见光 vs 电子束
Light
Electron
样品 (sample)
透镜系统 (optics)
物镜: 玻璃 vs 目镜： 玻璃 vs
电磁透镜 荧光屏
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丁明孝《细胞生物学》(第5版)笔记和课后习题(含考研真题)详解
目 录第一章 绪论1.1 复习笔记1.2 课后习题详解1.3 名校考研真题详解第二章 细胞生物学研究方法2.1 复习笔记2.2 课后习题详解2.3 名校考研真题详解第三章 细胞质膜3.1 复习笔记3.2 课后习题详解3.3 名校考研真题详解第四章 物质的跨膜运输4.1 复习笔记4.2 课后习题详解4.3 名校考研真题详解第五章 细胞质基质与内膜系统5.1 复习笔记5.2 课后习题详解5.3 名校考研真题详解第六章 蛋白质分选与膜泡运输6.1 复习笔记6.2 课后习题详解6.3 名校考研真题详解第七章 线粒体和叶绿体7.1 复习笔记7.2 课后习题详解7.3 名校考研真题详解第八章 细胞骨架8.1 复习笔记8.2 课后习题详解8.3 名校考研真题详解第九章 细胞核与染色质9.1 复习笔记9.2 课后习题详解9.3 名校考研真题详解第十章 核糖体10.1 复习笔记10.2 课后习题详解10.3 名校考研真题详解第十一章 细胞信号转导11.1 复习笔记11.2 课后习题详解11.3 名校考研真题详解第十二章 细胞周期与细胞分裂12.1 复习笔记12.2 课后习题详解12.3 名校考研真题详解第十三章 细胞增殖调控与癌细胞13.1 复习笔记13.2 课后习题详解13.3 名校考研真题详解第十四章 细胞分化与干细胞14.1 复习笔记14.2 课后习题详解14.3 名校考研真题详解第十五章 细胞衰老与细胞程序性死亡15.1 复习笔记15.2 课后习题详解15.3 名校考研真题详解第十六章 细胞的社会联系16.1 复习笔记16.2 课后习题详解16.3 名校考研真题详解第一章 绪论1.1 复习笔记【本章概述】本章为绪论部分，主要对细胞生物学的研究内容与现状、细胞学发展简史、原核细胞、古核细胞、真核细胞等内容做了简单的介绍，考点较细，需要理解掌握。
【重点难点归纳】一、细胞学与细胞生物学发展简史1生物科学3个阶段以及细胞的发现（1）三个阶段：形态描述阶段、实验室生物阶段、现代生物学阶段。
二章节细胞生物学研究方法
• 免疫细胞化学技术(immunocytochemistry) 利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分
布的一类技术。主要分为两大类: 免疫荧光 技术和免疫电镜技术。
分离技术
• 分离技术是一大类技术的总称，包括细胞 组分的分离和生物大分子的分离
第二章.细胞生物学研究方法
• 显微成像技术 • 细胞化学技术(cytochemistry) • 细胞培养和细胞融合 • 分离技术 • 分子生物学方法
显微成像技术 • 光学和电子显微镜成像原理 三个基本要素:①照明系统， ②被观察的样品，
③聚焦和成像的透镜系统
• 常用的光学显微镜 • 普通双筒显微镜(binocular microscope) • 荧光显微镜(fluorescence microscope) • 相差显微镜(phase contrast microscope) • 暗视野显微镜(dark field microscope) • 倒置显微镜
(gene knockin) • 乳腺生物反应器技术
基因克隆(gene cloning)
• 这项技术可概括为∶ 分、切、连、转、选
PCR技术
• PCR是英文聚合 酶链式反应 (polymerase chain reaction) 的简称， 是80年代发展起 来的一项具有重 大意义的分子生 物学技术
细胞融合与单克隆抗体技术
• 细胞融合(cell fusion) 指自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或
原生质体融合形成一个杂种细胞(图2-33)。 • 单克隆抗体技术(monoclonal antibody
technique) 1975年英国科学家Milstein和Kohler发明了单克隆
02细胞生物学第二章 细胞生物学研究方法
（四）暗视野显微镜 dark field microscope
• 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直 接进人物镜，只允许被标本反射和衍 射 的光线进入物镜，因而视野的背景 是黑 的，物体的边缘是亮的。
• 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率 比普通显微镜高50倍。
（五）相差显微镜
• 相差显微镜在结构上进行了特别设计，尤其是光学系统有很 大的不同， 可用于观察未染色的活细胞 .由P.ZEMIKE于1932年 发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖.
透射电镜
—、光学显微镜 （一）普通光学显微镜 •1. 构成： • ①照明系统 • ②光学放大系统 • ③机械装置 •2. 原理：经物镜形成倒 立实像，经目镜进一步 放大成像。
透镜的像差 •球面像差 •慧形像差 •像散 •像场弯曲 •畸变 •色差
球差：由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系 列折射后，若原光束不同孔径角的各光线，不能交于 主轴上的同一位置， 以至在主轴上的理想像平面处，形成一弥散 光斑（俗称模糊圈），则此光 学系统的成像误差称为球差。
A Yeast Cell
冰冻断裂与 冰冻蚀刻技术
（二）扫描电子显微镜
•20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。
• 分辨力为6~10nm ，由于人眼的分辨力 （区别荧光屏上距离 最近两个光点的能力 ）为0.2mm，扫描电 镜的有效放大倍率为 0.2mm/10nm=2000 0X。
• 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样 品，在样品表面激发出次级电子，次级电子 的多少与样品表面结构有关，次级电子由探 测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电 子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图 像。
• 紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300～450nm范围内 的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
2020年(生物科技行业)第二章细胞生物学研究方法
（生物科技行业）第二章细胞生物学研究方法第二章细胞生物学研究方法(theresearchmethodinthecellbiology)教学目的1、了解主要工具和常用方法，侧重掌握基本原理和基本应用；2、认识工具和方法和学科发展的相关性。
教学内容本章从以下5个方面介绍了细胞生物学的研究方法:1．显微成像技术2．细胞化学技术3．细胞分选技术4．细胞工程技术5．分离技术6．分子生物学方法计划学时及安排本章计划3学时。
教学重点和难点生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验才得以发现和发展的。
许多细胞生物学的重要进展以及新概念的形成,往往来自新技术的应用。
因此,方法上的突破,对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用，这是学习本章应确立的基本思想。
1．显微成像包括直接成像和间接成像。
显微技术是细胞生物学最基本的研究技术,包括光学显微技术和电子显微技术。
在光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜。
电子显微镜是研究亚显微结构的主要工具,透射和扫描电镜的是俩类主要的电子显微镜,对其基本结构、工作原理和样品制备方法则是学习的重点。
2．细胞化学技术介绍了酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技术,其中流式细胞分选技术是细胞生物学和现代生物技术中的重要技术,应重点掌握。
3．细胞工程技术是细胞生物学和遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。
包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。
主要内容包括：细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养。
4．分离技术是壹大类技术的总称，包括细胞组分的分离和生物大分子的分离,应掌握各种分离技术的原理和用途。
本章对分子生物学方法作了简要介绍,为今后的学习奠定基础。
简言之，本章教学重点是仪器方法的基本原理和基本应用；教学难点是电镜制样及分子杂交技术。
细胞生物学第2章-方法
3. 几种特殊的光学显微镜
使用明视野显微镜（bright-field microscope）有时很难观察到小的、未经染 色的样品，如：活细胞。
（1）相差显微镜（phase contrast microscope）
利用光的衍射现象，通过增加相差板和环形 光阑，将肉眼不能察觉的相位差转变成振幅差， 从而表现为肉眼可见的明暗区别，易于观察高透 明的材料。
胞彼此分离，观察完整的活的或者死亡的细胞 或组织，例如：原生生物、血细胞、根尖等。
（2）切片观察：将组织切成1~10μm的薄层再 进行观察 ，组织材料需要经过固定、包埋、 切片和染色等一系列处理。
组织切片的制备
固定的目的是使细胞及其成分锁定在原有的位置， 常用的有乙醇、甲醇、甲醛、戊二醛等。
常用的染色剂有苏木精、伊红、孔雀绿、苏丹黑、 考马斯亮蓝等，它们对细胞某一特殊的亚细胞成分 有特异的亲和性。
样品不需要染色，优点是能观察无色、透明的活 细胞中的结构。利用的是不同成分、部分的光衍 射系数不同的特点。
（2）倒置显微镜（inverted microscope） 结构上物镜和照明系统颠倒，光源来自上
方，物镜在载物台的下方。
细胞培养中使用的倒置相差显微镜，更便 于观察培养物中的活细胞。
倒置显微镜：适合直接观察培养的细胞
以油为折射介质，可以达到0.2um； 如果以紫外线（200-300nm）作为光源，分
辨率可达到0.1um。
光镜下可以看到的结构包括细菌、线粒体 （0.5um大小，是光镜下能清晰可见的最小物 体）、中心体、核仁等，称为显微结构。
2.光学显微镜样品的制备
光学显微镜观察样品的方式分成两大类： （1）整体观察：分离、涂布、压碎等方法使细
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一、显微成像技术（一）普通光学显微镜⏹1.构成：⏹①照明系统⏹②光学放大系统⏹③机械装置⏹2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。
⏹3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。
⏹光学显微镜的分辨力R=0.61λ/N．A．⏹其中λ为入射光线波长；⏹N．A．为镜口率＝ｎs i nα/2；⏹n=介质折射率；⏹α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。
2、常用的光学显微镜⏹（1）普通双筒显微镜有较强的立体感。
⏹（2）荧光显微镜：研究细胞内物质的吸收、运输、及化学物质的分布及定位以紫外为光源。
⏹（3）相差显微镜，观察无色、透明、活细胞中的结构（未经染色的活细胞）产生明暗差异⏹（4）暗视野显微镜：观察未经染色的活体或胶体粒子适合观察细胞核、线粒体、细菌、霉菌等。
⏹（5）倒置显微镜培养细胞观察03年选择题倒置显微镜i n v e r s e m i c r o s c o p e⏹物镜与照明系统颠倒；⏹用于观察培养的活细胞，通常具有相差或D I C物镜，有的还具有荧光装置。
⏹学习重点：⏹1.光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜。
掌握电子显微镜的原理和样品制备方法，以及和光学显微镜的差别．⏹２.掌握酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技术的原理⏹３.了解细胞培养和细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养⏹4.离心分离技术⏹这一章每年都有真题出现，大部分以填空，选择和判断的题型出现，总体看来，题目难度在下降，但是实际应用的能力越来越看重，07、08年就近30分的考题第二章：细胞生物学研究方法1. 原理⏹以电子束作光源，电磁场作透镜。
电子束波长与 加速电压(通常50~120K V )的平方根成反比；⏹由电子照明系统透镜成像系统、真空 录系统、电源系统等5部分构成；⏹ 分辨力0.2n m ，放大倍数可达百万倍；⏹用于观察超微结构（小于0.2µm ）。
TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE ，TEM2. 制样技术⏹1）超薄切片 ⏹ 超薄切片厚度仅50n m 左右，用超薄切片机（u l t r a m i c r o t o m e ）制作。
⏹ 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。
4、 电子显微镜⏹ 由三大部分组成∶电子光学系统(镜筒)、真空系统、电子学系统(供电系统)。
观察的是亚显微结构⏹ 电子显微镜的样品也需固定、包埋、切片 （超薄切片，切片放在载网上）、染色等。
采用负染色：只染背景不染样品⏹ 透射电子显微镜，扫描电子显微镜3、 光学显微镜的样品制备与观察⏹ 3.1 样品的固定(f i x a t i o n )：醛类⏹ 3.2 包埋和切片(e m b e d d i n g a n d s e c t i o n i n g ) 切片厚度：1-10u m⏹ 3.3 染色(s t a i n i n g ):有机染料⏹ 3.4 放射自显影技术⏹ 断面的三种处理方法： ⏹ 蚀刻（ e t c h in g 蚀刻（no e t c h i n g蚀刻（d e e p e t c h i n g ）tip cell with etching.培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，示Clathrin 衣被（二）扫描电子显微镜 ⏹ 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构；⏹分辨力为6~10n m ，因人眼的分辨力（区别荧光屏上 距离最近两个光点的能力）为0.2m m ，扫描电镜的 有效放大倍率为0.2m m /10n m =20000X 。
Scanning electron microscope （ SEM ）3）冰冻蚀刻 f r e e z e -e t c h i n g⏹亦称冰冻断裂。
标本置于干冰或液氮中冰冻。
然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。
向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。
然后将 组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜（r e p l i c a ）。
2）负染技术⏹电镜观察需要有足够的反差。
用重金属盐(如磷钨酸) 染 色；吸去染料干燥后， 样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5n m 左右。
aineArchaebact⏹光学和电子显微镜成像原理⏹照明系统的波长是显微镜成像的一个重要因素，因为波长决定能被检测样品的最小极限电子显微镜与光学显微镜的基本区别二、细胞化学技术⏹1、酶细胞化学技术┌────酶的细胞化学反应─────┐│酶+条件初级捕捉剂│底物──→反应产物──→最终反应产物（酶反应）（捕捉反应）⏹2、免疫细胞化学技术（免疫荧光技术和免疫电镜技术）⏹3、细胞分选技术⏹流式细胞计，掌握原理⏹细胞的分选⏹染色体的分选F l o w C y t o m e t r y’s b a s i c s t r u c t u r e单细胞悬液真题再现2000年用流式细胞仪分选细胞和染色体，从生物学角度来看，应该注意的三个关键技术环节 (比较难)三、细胞工程技术⏹1、细胞培养***7年大题研究方法：体外培养动物细胞⏹08大题两道A为研究工作的需要，请你提出建设一间动物细胞培养室的设计规划，包括培养室的大小、格局、基本设备、经费预算等（10分）⏹B为了将培养中的单层表皮细胞制备成单细胞悬浮液，通常要添加E D T A或E G T A，以胰蛋白酶，请问添加这些试剂作用是什么？（5分）⏹1.1原代培养(prim⏹传代培养（二者区别？？）⏹1.2细胞系和细胞株(c e l l l i n e a n d c e l l s t r a i n)⏹1.3动物细胞培养方法⏹贴壁培养⏹悬浮培养⏹1.4植物组织培养(p l a n t t i s s u e c u l t u r e)（可以留意）⏹1.5植物原生质体培养（三）激光共聚焦扫描显微境L a s e r c o n f o c a l s c a n n i n g m i c r o s c o p e,L C S M⏹用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描；⏹能显示细胞样品的立体结构；⏹分辨力是普通光学显微镜的3倍；⏹用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。
⏹工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。
⏹为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。
2.3显微操作术⏹细胞核移植、基因注入、染色体微切和胚胎切割等手术四、分离技术⏹1、离心分离技术⏹速度离心和等密度离心⏹1.1速度离心分离细胞器和大分子⏹●差速离心⏹●移动区带离心⏹1.2等密度离心⏹蔗糖、甘油和氯化铯都是密度离心分离中的介质一、离心技术⏹是分离细胞器及各种大分子基本手段。
⏹转速10~25k r/m i n的离心机称为高速离心机。
⏹转速>25k r/m i n，离心力>89K g者称为超速离心机。
⏹超速离心机的最高转速可达100000r/m i n，离心力超过500k g。
（一）差速离心D i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o n⏹特点：⏹介质密度均一；⏹速度由低向高，逐级离心。
⏹用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。
⏹沉降顺序：核⏹可可可将将将细细细胞胞胞器器器初初初步步步分分分离离离，，，常常常需需需进进进一一一步步步通通通过过过密密密度度度梯梯梯离离离心心心再再再行行行分分分离离离纯纯纯化化化。
2.2单克隆抗体技术(m o n o c l o n a la n t ib o d y t ec h n i q u e)筛选用的H A T培养基是选择性培养基在H A T培养基中，只有肿瘤细胞和正常细胞融合形成的杂交瘤细胞才能生存，而未融合的肿瘤细胞、正常细胞及非肿瘤细胞和正常细胞融合形成的细胞都会死亡单个细胞融合方法：有限稀释法2、细胞融合与单克隆抗体技术⏹2.1细胞融合(c e l l f u s i o n)⏹灭活的仙台病毒：促进融合的原因⏹聚乙二醇(p o l y e t h y l e n e g l y c o l，P E G)：促进融合的原因（三）密度梯度离心⏹用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。
⏹类型：速度沉降、等密度沉降。
⏹常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。
⏹分离活细胞的介质要求：⏹1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；⏹2）P H中性或易调为中性；⏹3）浓度大时渗透压不大；⏹4）对细胞无毒。
1.速度沉降v e l o c i t y s e d i m e n t a t i o n⏹用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器⏹特特特点点点：：：介介介质质质密密密度度度较较较低低低，，，介介介质质质的的的最最最大大大密密密度度度应应应小小小于于于被被被分分分离离离生生生物物物颗颗颗粒粒粒的的的最最最小小小密密密度度度。
⏹原原原理理理：：：介介介质质质密密密度度度梯梯梯度度度平平平缓缓缓，，，分分分离离离物物物按按按各各各自自自的的的沉沉沉降降降系系系数数数以以以不不不同同同的的的速速速度度度沉沉沉降降降而而而达达达到到到分分分离离离。
2.等密度沉降i s o p y c n i c s e d i m e n t a t i o n⏹用途：分离密度不等的颗粒。
⏹特点：⏹介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。
⏹力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。
⏹原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。
介质⏹蔗糖，甘油（1.3g/c m3）⏹氯化铯(大于1.3g/c m3)----- 浮力密度离心二移动区带离心⏹常用的是蔗糖密度梯度离心Differential centrifugationHighspeedLow speed五、分子生物学方法⏹1、基因工程技术：分，切，连，转，选（基因克隆）⏹2、P C R技术p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n⏹P C R即：p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n。