17-核酸的物理化学性质和常用的研究方法

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五、核酸的变性、复性及杂交 核酸的变性、
3. 影响核酸变性的因素 热变性，酸碱变性， 热变性，酸碱变性，化学试剂变性 4. DNA的熔解温度 的熔解温度Tm(melting temperature) 的熔解温度 DNA变性的特点：爆发式 变性的特点： 变性的特点 DNA的熔点 的熔点Tm 的熔点 通过加热使DNA的 通过加热使 的 双螺旋结构解旋50％时 双螺旋结构解旋 ％ 的温度
稀盐溶液
DNA的变性过程是双螺旋结构被 的变性过程是双螺旋结构被 破坏， 破坏，物化性质发生改变的过程
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变性实质：氢键断裂， 变性实质：氢键断裂，双链解体成单链 核酸的降解：多核苷酸骨架上共价键断裂， 核酸的降解：多核苷酸骨架上共价键断裂， 因而引起核酸分子量的降低 氢键的破坏导致变性， 氢键的破坏导致变性，共价键的破坏 导致降解 2. 变性DNA物化性质的改变 物化性质的改变 变性 变性后， 变性后，DNA溶液的流体力学性质及 溶液的流体力学性质及 一系列物化性质都会随之改变： 一系列物化性质都会随之改变：粘度大 大降低，沉降速度提高，浮力密度增大， 大降低，沉降速度提高，浮力密度增大， 紫外吸收增加，比旋下降， 紫外吸收增加，比旋下降，酸碱滴定曲 线改变 部分甚至全部失去生物活性
A =1 50µg/ml 双螺旋 双螺旋DNA 40µg/ml 单链 单链DNA(或RNA) 或 20µg/ml 寡核苷酸
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三、核酸的紫外吸收
3、用摩尔磷消光系数ε(p)表示溶液中核酸的含量 用摩尔磷消光系数 表示溶液中核酸的含量
碱基和磷原子含量相等，可以用 的含 碱基和磷原子含量相等，可以用P的含 量来表示核酸的含量 ε(p) = A/CL = 30.98A/WL
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二、核酸的酸碱性质
限制性内切酶 restiction nucleise
发现： 发现： 1968年，于大肠杆菌 年 于大肠杆菌(E. Coli K) 来源： 主要在细菌和霉菌中 来源： 特点： 专一性非常强， 特点： 专一性非常强，具有严格的碱基 序列专一性，能识别DNA的特定 序列专一性，能识别 的特定 位点
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三、核酸的紫外吸收
1、核酸具有紫外吸收 吸收范围： 吸收范围：240-290 nm λmax = 260nm （定量测定核苷酸） 定量测定核苷酸） 2、根据紫外吸收判断样品纯度 不纯的样品
DNA：A260/A280 = 1.8；RNA：A260/A280 = 2.0 ： ：
纯的核酸分子或寡核苷酸
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四、核酸的沉降特性
溶液中的核酸受到引力作用会下 沉，不同构象的分子沉降速度有很大 差异 超速离心：分离纯化核酸 超速离心： 测定核酸的沉降系数 相对分子量
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四、核酸的沉降特性
密度梯度超离心 分离RNA常用蔗糖梯度，分离DNA 常用蔗糖梯度，分离 分离 常用蔗糖梯度 常用CsCl梯度 常用 梯度
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二、核酸的酸碱性质
限制性内切酶
修饰和限制现象
微生物有修饰和限制现象， 微生物有修饰和限制现象，这是细菌 的自卫方式之一。 的自卫方式之一。如E.coli K株繁殖出来 株繁殖出来 的噬菌体入（ ）只能感染E.coli K株， 的噬菌体入（K）只能感染 株 而不感染E.Coli B株，该现象称“限制” 而不感染 株 该现象称“限制” 现象 然而被限制的噬菌体群体中也可能有 极少的幸存个体， 极少的幸存个体，这些个体可以在受限 制的菌株中繁衍子代。此现象称“修饰” 制的菌株中繁衍子代。此现象称“修饰”
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二、核酸的酸碱性质
限制性内切酶的命名
第一个字母为该酶所属的细菌属名 的第一个字母，用大写表示。第二、 的第一个字母，用大写表示。第二、三 个字母是这种细菌的种名的前二个字母， 个字母是这种细菌的种名的前二个字母， 用小写表示，如果这个细菌有不同株系， 用小写表示，如果这个细菌有不同株系， 还需加第四个代表株系的字母或数字， 还需加第四个代表株系的字母或数字， 若同一菌有不同种类的限制酶，要用大 若同一菌有不同种类的限制酶， 写罗马数字表示
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五、核酸的变性、复性及杂交 核酸的变性、
5、RNA的变性 、 的变性 特点： 特点： Tm较低，变性 较低， 较低 曲线较宽 tRNA的Tm较高 的 较高 双链RNA的变性 的变性 双链 与DNA相同 相同
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（二）、复性（renaturation） ）、复性（ 复性 ） 复性：在适当条件下，变性DNA的两条 复性：在适当条件下，变性 的两条 链重新缔合成双螺旋结构的过程 复性： 复性：物化性质和生物活性 DNA复性的影响因素 复性的影响因素 1、降温速度 、 退火：变性DNA缓慢冷却而复性的过程 退火：变性 缓慢冷却而复性的过程 2、DNA片段的大小 、 片段的大小 3、DNA的浓度 、 的浓度 4、核苷酸顺序的复杂程度 、
DNP
0.14 mol/L NaCl
DNP纤维 纤维
缠绕在玻璃棒 多次溶解、 多次溶解、沉淀 除去混杂蛋白 苯酚抽提 溶于水相 DNA 乙醇
较纯DNA 较纯
六、核酸的分离与纯化
2、RNA的分离 RNA的分离 RNA的分离比 的分离比DNA复杂，因为 复杂， 的分离比 复杂 因为RNA 分子不稳定， 分子不稳定，很容易降解 3、凝胶电泳 简单，快速，分离效果好， 简单，快速，分离效果好，大小分 子都适用 凝胶电泳对核酸的分离作用主要依 赖于它们的分子量及分子构型， 赖于它们的分子量及分子构型，而凝胶 的类型及其浓度对被分离核酸的分子大 小关系重大
DNA的Tm：82 – 95℃ 的 ： ℃
S形曲线－DNA的变性曲线 形曲线－ 形曲线 的变性曲线
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五、核酸的变性、复性及杂交 核酸的变性、
影响Tm值的因素 值的因素 影响 ⅰ）DNA的均一性 的均一性 ⅱ）G-C 含量 ⅲ）介质的离子强度
G-C %=（Tm － 69.3）× 2.44 （ ）
低离子强度： 低离子强度： Tm下降，熔解温度范围宽 下降， 下降 高离子强度： 高离子强度： Tm较高，熔解温度范围窄 较高， 较高
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二、核酸的酸碱性质
牛胰核糖核酸酶RNase Ⅰ 牛胰核糖核酸酶 内切酶，作用于 内切酶，作用于RNA 作用位点：嘧啶核苷-3’-磷酸与其它核苷酸之间的键 作用位点：嘧啶核苷 磷酸与其它核苷酸之间的键
核糖核酸酶T1 核糖核酸酶 内切酶， 内切酶，高专一性 作用位点： 鸟苷酸与其 作用位点：3’-鸟苷酸与其 它核苷酸5’-OH形成的键 它核苷酸 形成的键
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二、核酸的酸碱性质
EcoR I， MW： 58000 ， ： E co R I 属名 种名 菌株 编号 该酶识别一个6 的序列： 该酶识别一个 bp 的序列：
5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’
HindⅢ (haemophilus influenzae)是从 是从 流感噬血杆菌d 流感噬血杆菌 株分离到的第三种内切酶
实验室纯化质粒DNA： 染料（溴乙锭）-CsCl密 染料（溴乙锭） 度梯度超离心，得到的 度梯度超离心， DNA纯度较高，可用于 纯度较高， DNA重组，测序及限制 重组， 酶图谱等
DNA的密度与 的密度与G-C 的密度与 含量成正比
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五、核酸的变性、复性及杂交 核酸的变性、
（一）、变性（denaturation） ）、变性（ 变性 ） 1. 变性和降解
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酶水解 磷酸二酯酶： 磷酸二酯酶：非特异性水解磷酸二酯键的酶 核酸酶： 核酸酶：特异性水解核酸的磷酸二酯酶 分类： 分类： 根据底物专一性： 根据底物专一性： 核糖核酸酶， 核糖核酸酶，脱氧核糖核酸酶 根据对底物作用的专一性： 根据对底物作用的专一性： 核酸内切酶， 外切酶） 核酸内切酶，外切酶（3’-或5’-外切酶） 或 外切酶 根据底物断裂位点: 根据底物断裂位点 非特异性的磷酸单酯 酶对一切核苷酸都能作用
染色体DNA 染色体
（蛋白水解酶或变性剂） 蛋白水解酶或变性剂） 破碎细胞
1、DNA的提取 DNA的提取
粗分离DNA用密度 用密度 粗分离 梯度方法超离心 溶液制成密度 梯度， 梯度，超离心时 ，样品中不同成 分将根据各自不 同的密度停留在 NA 释放
1mol/L NaCl （水或浓盐溶液） 水或浓盐溶液）
第十七章
核酸的物理化学性质 和常用的研究方法
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一、DNA分子的一般性质
DNA分子的长度 1 DNA分子的长度
大肠杆菌染色体DNA 大肠杆菌染色体DNA bp ： 4×106 × MW：2.6×109 ： × 长度： × 长度：1.4×106 nm（L/D ≈ 7×105） （ ×
人类DNA分子 人类DNA分子 DNA
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二、核酸的酸碱性质
2、核酸的酸碱性质 核酸具有较强的酸性 核酸可视为多元酸
碱基 稳定性
氢键
碱基 解离状态
溶液pH 溶液
氢原子可以在碱基的N或 之间随意移动 之间随意移动？ 氢原子可以在碱基的 或O之间随意移动？ 碱基上的氢原子位置相对固定 生物学意义：它是碱基互补原则、 生物学意义：它是碱基互补原则、双螺旋 结构、 结构、DNA复制乃至遗传学的基础 复制乃至遗传学的基础
A：光吸收值 ： C：磷的摩尔浓度 ： L：比色杯内径 ： W：每升溶液中磷的重量（g） ：每升溶液中磷的重量（ ）
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三、核酸的紫外吸收
DNA的ε(P)：6600 的 ： RNA的ε(P)：7700-7800 的 ：
核酸的ε(P)比核苷酸单体低 比核苷酸单体低 核酸的 单链多核苷酸的ε(P)比双螺 比双螺 单链多核苷酸的 旋多核苷酸的ε(P)要高 旋多核苷酸的 要高 增色效应：核酸变性时， 增色效应：核酸变性时， ε(P)增加 增加 减色效应：当核酸复性时， 减色效应：当核酸复性时， ε(P)降低 降低
介质：液相，固相（硝酸纤维素膜） 介质：液相，固相（硝酸纤维素膜）