真核细胞表达系统(干货分享)

真核细胞表达系统自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。

并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。

随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。

利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段.在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。

该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒)转化细菌（通常选用的是大肠杆菌）,通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白.其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉.但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。

为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是:①根据原核生物蛋白与靶DＮＡ间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制；...文档交流仅供参考...②能诱导基因高效表达,可达105倍，为其他系统所不及；③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关"，还可人为地调控基因表达量。

因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。

目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统....文档交流仅供参考...1、酵母表达系统最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。

目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Ｃandiｄa Bodｉni，Pichia Pasｔris3种。

以Pichia Ｐastoriｓ应用最多。

...文档交流仅供参考...甲醇酵母的表达载体为整合型质粒,载体中含有与酵母染色体中同源的序列,因而比较容易整合入酵母染色体中。

大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一１（A0x１），在该基因的启动子（PAXOI）作用下，外源基因得以表达.PＡXO Ｉ是一个强启动子,在以葡萄糖或甘油为碳源时。

甲醇酵母中ＡOx1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时PAＸＯI可被诱导激活,因而外源基因可在其控制下表达，将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。

此外甲醇酵母的表达载体都为Ｅ．coli/Piｃhia Pastoris的穿梭载体，其中含有E.cｏlｉ复制起点和筛选标志,可在获得克隆后采用E。

ｃoli细胞大量扩增．目前，将质粒载体转入酵母菌的方法主要有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等.甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。

培养至高浓度。

再以甲醇为碳源。

诱导表达外源蛋白。

这样可以大大提高表达产量。

利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。

与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化....文档交流仅供参考...利用PAXOI表达外源蛋白时，一般需很长时间才能达到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。

使得实验操作过程中存在不小的危害性。

且不宜于食品等蛋白生产。

因此那些不需要甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP、FLD1、PEＸ8、YＰTI 等多种。

利用三磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡP）启动子代替PAXOI，不需要甲醇诱导.培养过程中无需更换碳源，操作更为简便，可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间. ...文档交流仅供参考...酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统,由于兼具原核以及真核表达系统的优点,正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。

...文档交流仅供参考...2、昆虫细胞表达系统杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒（AcNPＶ)作为表达载体。

在ＡcNPＶ感染昆虫细胞的后期，核多角体基因可编码产生多角体蛋白,该蛋白包裹病毒颗粒可形成包涵体.核多角体基因启动子具有极强的启动蛋白表达能力，故常被用来构建杆状病毒传递质粒.克隆入外源基因的传递质粒与野生型AcNＰＶ共转染昆虫细胞后可发生同源重组，重组后多角体基因被破坏,因而在感染细胞中不能形成包涵体，利用这一特点可挑选出含重组杆状病毒的昆虫细胞但效率比较低,且载体构建时间长，一般需要4~6周。

此外，昆虫细胞不能表达带有完整N联聚糖的真核糖蛋白。

...文档交流仅供参考...在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解,胞质内的物质释放出来,与目的蛋白混在一起,从而使蛋白的纯化工作变得很困难,另外水解酶的释放会降解重组蛋白.为了克服以上这些困难，科学工作者先后尝试用丝蛾肌动蛋白基因启动子或杆状病毒iｅ－１基因启动子表达外源蛋白，但效果都不明显。

Ｆarrel等介绍了一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统，该系统主要包括3个调节外源蛋白表达序列：...文档交流仅供参考...（１）Bｏmbyx moｒi的肌动蛋白基因启动子；（2)Bombｙx mori的核型多角体病毒（BｍNＰＶ)的立早基因ｉe—1(编码俄IE-1蛋白,该蛋白是种转录激活因子,可在体外激活肌动蛋白基因启动子);...文档交流仅供参考...(３）BmNＰV的同源重复序列3（ＨＲ3）可作为肌动蛋白基因启动子的增强子。

三者协同作用,可使转录活性提高1０00倍以上,从而大大地提高外源蛋白的表达水平。

另外目前还有一种新型的宿主范围广的杂合核多角体病毒(HyNPV)被应用于昆虫细胞表达系统的构建，该病毒由ＡcNPV及Bnｉ'qP发展而来。

...文档交流仅供参考...一般情况下杆状病毒表达系统所能表达的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分为非分泌性。

为了解决这个问题将Hsp7０(热休克蛋白７0)与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平，这是因为分泌性多肽被翻译后必须到达内质网进行加工才能被分泌至胞外.如果到达内质网前，前体多肽就伸展开来，暴露出疏水残基，残基间的相互作用可引起多肽的凝聚,这对最终的表达水平有很大影响。

而Hｓｐ70是一种分子伴侣,能够与新翻译的多肽结合，抑制前体肽的凝聚使前体肽顺利到达内质网进行加工,从而提高蛋白的分泌水平。

...文档交流仅供参考...最近，人们又构建了杆状病毒－S2表达系统，该系统能将重组杆状病毒转染果蝇S2细胞，以前人们认为杆状病毒仅能在鳞翅目昆虫细胞（如sｆ9、sf21）中复制,不能在其他昆虫细胞（如果蝇细胞)中复制，然而目前研究表明在一定条件下，杆状病毒也能感染果蝇细胞。

在果蝇细胞中,杆状病毒的多角体基因启动子几乎不发生作用。

杆状病毒-S2表达系统的表达载体利用的是果蝇启动子如Ｈsｐ70启动子、肌动蛋白5Ｃ启动子、金属硫蛋白基因启动子等，其中,Hsｐ70启动子的作用最强。

重组杆状病毒感染S2细胞后不会引起宿主细胞的裂解,且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似，因此，杆状病毒—Ｓ2系统是一个很有应用前景的昆虫细胞表达系统。

昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全,表达量高，目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。

...文档交流仅供参考...３、哺乳动物细胞表达系统由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质,在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。

哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等....文档交流仅供参考...将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过2类方法:一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞,二是通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及ＤEAＥ一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中.外源基因的体外表达一般采用质粒表达载体,如将重组质粒导入CHO细胞可建立高效稳定的表达系统,而利用ＣOS 细胞可建立瞬时表达系统。

目前,病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具,在临床基因治疗的探索中也发挥了重要作用。

痘苗病毒由于其基因的分子量相当大（约1８7kb)，利用它作为载体可同时插入几种外源基因,从而构建多价疫苗。

另外，逆转录病毒感染效率高，某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因,但要注意的是逆转录病毒可整合入宿主细胞染色体，具有潜在的危险性. ...文档交流仅供参考...由于腺病毒易于培养、纯化，宿主范围广，故采用该类病毒构建的载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒和包装载体之间的同源重组。

但是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很低，利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高,即将外源基因插入到腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒，将其线性化后与腺病毒包装质粒共转化大肠埃希菌.另一种方法是通过CｒelaxＰ系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和包装质粒中都插入laxP位点，然后将两个质粒共转染表达Ｃrｅ重组酶的哺乳动物细胞，通过Ｃｒe介导两个lａxP位点之间的ＤNA发生重组，可获得重组腺病毒，这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。

最近，人们在杆状病毒中插入巨细胞病毒的启动子建立了高效的基因转移载体。

由于杆状病毒是昆虫病毒，在哺乳动物细胞中不会引起病毒基因的表达，而且载体的构建容易，因而利用杆状病毒进行基因转移为我们提供了很好的途径. ...文档交流仅供参考...利用哺乳动物细胞表达外源基因时，大多数情况下不需要诱导，但当表达产物对细胞有毒性时应采取诱导，这样可避免表达产物产生早期就对细胞产生影响.哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导，还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子.但这些系统存在一些共同的缺陷，如诱导表达特异性差；当系统处于关闭状态时表达有泄漏诱导剂本身有毒性，常对细胞造成损伤等。

...文档交流仅供参考...为此,Ｇoｓseｎ等构建了受四环素负调节的Ｔet－oｎ基因表达系统,该系统由调节质粒和反应质粒组成。

调节质粒中具有编码转录激活因子(fIA）的序列,在没有四环素或强力毒素存在的情况下ｔTA可引起下游目的基因表达。

随后Ｇossｅn等又对ｔＴA 的氨基酸序列进行了改造,构建了受四环素正调节的Tet—ｏｎ基因表达系统，该系统在没有四环素的情况下启动子不被激活，而在加入四环素或强力毒素后目的基因高效表达。

四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统,该系统具有严密、高效可控制性强的优点。