酶体外定向进化技术及其发展

酶体外定向进化技术及其发展
酶的定向进化是20世纪90年代初兴起的一种蛋白质工程的新策略，近年来发展迅速。

酶能催化各种各样的化学反应，可使需要几天几个月甚至几年时间完成的转化在几分钟甚至几秒钟内完成，能催化化学方法难以完成的反应，如构象的改变等。

同时，它无毒无害，对环境没有污染，在环境问题日益严重的今天，酶的应用显得至关重要。

1 概述
酶的体外定向进化又称蛋白质分子定向进化，是蛋白质工程的新策略。

简单来说，就是在事先不了解酶的空间结构和催化机制的情况下，在实验室中通过模拟达尔文自然进化过程，让目标酶分子在预先设计好的道路上快速进化，获得有价值的非天然酶。

定向进化是随机突变和选择的结合，随机突变是人为控制某些条件改变而引发的。

后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起选择预期方向的突变、排除其他方向突变的作用，整个进化过程是在人为控制下进行的。

定向突变使在自然选择条件下需几百万年乃至上亿年才能完成的进化过程，缩短到几年、几个月，甚至更短的时间，加速了酶的进化过程。

目前，该方法主要应用于提高酶的稳定性、酶活性、对有机溶剂的耐受性，扩大底物的选择性，改变光学异构体的选择性等方面。

在目前已发现的8 000多种酶中，真正能够进行大规模生产和应用的商品酶并不多，主要原因是天然酶的性质与生产环境，例如高温、高压、有机溶剂、极端pH等的要求相差甚远。

天然酶的底物选择性等性质难以满足对蛋白酶的需求。

酶的定向进化技术是酶工程学研究的有效工具，该技术的发展使酶应用于工业生产成为可能。

2 酶体外定向进化的常用方法
2.1 易错（error-prone）PCR
易错PCR技术是指采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，比如提高镁离子浓度、加入锰离子等方式改变体系中4种dNTP的浓度等，改变Taq酶的突变频率，从而向目的基因中引入随机突变构建出突变体库，并从中选择或筛选出所需要的突变体。

由于在实验中仅经过一次易错PCR扩增，所以往往很难得到所需的突变，由此而产生了连续易错PCR扩增技术，即一次PCR获得的扩增基因作为下一次的目的基因进行操作，连续多次进行上述PCR过程，直至获得突变显著的结果基因。

易错PCR是一种相对简单、快速、低廉的方法，但该方法较为费时、费力，一般适用于较小的基因片段（800 bp）。

目前，使用易错PCR的方法已取得了一定的成果。

例如，Moore 等对鼠伤寒沙门菌产生的α-门冬氨酰二肽酶进行了改良，提高了酶的活力。

Chen等用此方法在非水相溶液中对枯草杆菌蛋白酶E的活性进行了改良。

使用该方法易出现同型碱基转换，可以说这种方法是最为基础的方法，缺点也比较明显。

如何改善其费时、费力等缺点将是改进技术的重点。

2.2 DNA改组（DNA shuffling）
DNA改组是Stemmer于1994年建立的模仿自然进化的一种DNA体外随机突变方法。

DNA改组也叫DNA重排，是对一组同源基因进行体外随机重组的特殊PCR技术，也叫作基因洗牌术。

所谓DNA 改组，简单来说，就是将DNA拆散后重排，即将目的基因在DNaseI 的作用下随机酶切成20～50 bp的片段混合物，然后通过多次无引物PCR循环，各片段之间互为模板和引物，在扩增的过程中进行随机组合，最终获得发生多个突变位点的全长基因。

DNA改组可使酶的2个或更多的已优化性状合为一体。

因此，在理论和实际上，都优于连续易错PCR。

总体来说，该技术简便、高效，已逐渐成为分子改造的主干技术。

利用DNA改组，Stemmer等成功实现了对β-内酰胺酶的定向进化，提高了水解头孢类抗生素的
能力。

Yano等人用该方法进化天冬氨酸转氨酶，结果显示支链氧代氨基酸的活力提高了105倍。

2.3 随机引发重组（RPR）
RPR技术是Aronld于1998年首先报道的。

其基本原理是以单链DNA为模板，随机扩增出有重叠片段模板的小片段，由于碱基错配和错误引发，使这些小片段中也存在少量的突变。

在随后的PCR反应中，这些片段互为引物进行合成，随之这些突变也发生重组，组装成完整的基因。

RPR技术与DNA改组相比，具有如下特点：①所需亲代DNA的量较少；②无需DNase I的处理，解决了DNA改组中DNase I所具有的序列偏向性；③组装前不需进行纯化操作。

2.4 交错延伸技术（StEP）
StEP是Aronld等人于1998年建立的一种新的体外重组方法。

其原理是，在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步，新生链再作为引物与模板进行退火和延伸，如此重复进行，直到获得全长基因。

Bulter等通过易错PCR、交错延伸重组等方法对漆酶（一种含铜多酚氧化酶）进行了体外定向进化，筛选得到的突变酶的总活力比原酶提高了160倍。

近年来，新技术大量涌现，以上述几种方法为基础的各种新方法不断出现，如过渡模板随机嵌合生长技术（*****T）、外显子重排（Exon Shuffling）、退火低核苷酸基因重排（DOGS）和增加平截杂合酶法（ITCHY）等方法。

通常，在酶定向进化过程中，各种方法并不是独立的，也没有哪一种方法是万能的，因而可通过多种方法的组合，使酶的性质得到更大的提高。

3 讨论
基因文库的构建是酶体外定向进化的基础。

在众多的基因文库构建技术中，易错PCR是最早出现的一种，其后产生的各种各样的新技术，或是以其为基础，或是对其进行改良。

时至今日，易错PCR技术仍常被用于文库的构建。

每种方法都有其独特之处，例如，DNA
shuffling是一种产生杂合酶的有效方法，但只能重组2个亲本基因，而且只限于产生单杂交文库；RPR技术可使用单链DNA且不需要DNase I的处理；StEP法是一种只依赖于条件严格控制的PCR的不同的体外重组法。

选择合适的方法会使定向进化过程变得更加简单，使结果更趋于理想。

4 结束语
成功的定向进化需要满足功能实际、目标功能可行、合适的筛选方法等条件。

在一定程度上，现实中自然进化的难易度决定了定向突变能否解决实际问题，因而在做选择之前，要先对所需优化性状进行可行性分析，应选择易于优化的性状进行改良。

通常来说，使用上述技术可实现已有性状的优化，但是创造全新性状的新酶，是一项艰巨的工作，因为一种新的功能需要新的顺序空间，而人们很难预测需要重复多少次才能得到预期的答案，可能会很幸运，很快就得到，也可能会是一个漫长而艰难的过程。

上述定向进化方法几乎可以运用到生命科学研究的各个领域。

目前，体外定向进化的方法不仅被成功地运用在酶的改造上，而且还被成功地运用于DNA的进化（如DNA疫苗等）、酶以外蛋白质的进化（例如提高抗体基因表达、对细胞因子生长因子的改造等）。

我们坚信，这些技术方法的进一步完善和更广泛的运用，必将推动很多领域的发展，实现人类认识自然、改造自然史上的又一次飞跃。