食品微生物学实验技术

食品微生物学实验技术

实验1 食品中细菌菌落总数的测定

1 目的要求

（1）掌握食品中菌落总数测定方法。

（2）了解食品清洁程度（被污染程度）及观察细菌在食品中繁殖的动态，从而为被检样品进行卫生学评价时提供依据。

2 基本原理

菌落（colony）是指细菌在某一种固体培养基上克隆增殖发育成肉眼可见的细菌集团。

菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL（g，cm2)检样中所含菌落总数。通常以cfu/g（mL，cm2)表示，cfu代表的colony forning unit。

菌落总数是作为判定食品的清洁程度（被污染程度）的标记，通常越干净的食品，单位样品菌落总数越低。反之，菌落总数就越高。菌落总数的测定是以每个活细菌能克隆增殖形成一个可见的单独菌落为基础的，但是在实践中除了单个细胞形成菌落外，二个或两个以上相连的同种细胞也同样可形成菌落，所以现在均以菌落总数（而不是活细菌数）或菌落形成单位数表达。由于菌落总数的测定是在37℃有氧条件下培养的结果，对于厌氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的细菌也受到限制。因此，这种方法所得到的结果，实际上只包括一群在普通营养琼脂中发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。但由于在自然界这类细菌占大多数，其数量的多少能反映出样品中细菌的总数，正因为如此，用该方法来测定食品中含有的细菌总数已得到了广泛的认可。

3 实验材料

3．1 仪器恒温箱、冰箱、恒温水浴锅、天平、微波炉、均质器。

3．2 材料吸管（容量为0.1mL、1m和10mL）、广口瓶或三角烧瓶、灭菌平皿、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、灭菌镊子。

3．3 试剂营养琼脂培养基、75%乙醇、0.85%生理盐水。

4 实验方法与步骤

4．1 菌落总数实验程序（如图28-1）

4．2 检样稀释及培养

（1）以无菌操作将检样25g(25mL)剪碎放于装有225mL灭菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶，经过充分振荡或均质处理制作成1：10的均匀稀释液（固体食品有的需先用灭菌研钵研磨后再稀释）。

（2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管（注意吸管尖端不要触及管稀释液），振摇试管混合均匀，作成1：100稀释液，按上述操作顺序，作10倍系列稀释液，每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。

（3）根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释液，分别在作10倍递增稀释同时，吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿，每个稀释度作两个平皿。

（4）稀释液移入平皿后，应及时将融化并冷却到46℃营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿使其混合均匀，同时将营养琼脂培养基注入加有无菌生理盐水的灭菌平皿作空白对照。

（5）待琼脂凝固后，翻转平板，置36+1℃温箱培养24+2hr（肉、乳和蛋品为48+2h，水产为30℃48+2h）。

4．3 菌落计数

将培养24h后的平板取出，选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平板，取两个平板的平均数，乘以稀释倍数，即得每克（或毫升）样品所含菌落总数。

4．4 平板菌落计数方法

(1) 平板菌落数的选择

选取菌落数在30～300个之间的平板作为菌落总数测定的标准，且一个稀释度应使用两个平板的平均数。其中当一个平板有较大片状菌落生长时，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。

(2) 稀释度的选择

A．应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。

B．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300个之间，则视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告其平均数；若两者之比大于2，则报告其中较小的数字。

C．若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

D．若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最底的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

E．若所有稀释度均无菌落生长，则以小于<1乘以最低稀释倍数报告之。

F．若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

(3) 菌落数的报告

菌落数在100以时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。

(见表28-1)

表28-1 稀释度选择及菌落数报告方式

例次

稀释液及菌落数两稀释

液之比

菌落总数

（cfu/g，mL）

报告方式

（cfu/g，mL）10-1 10-210-3

1 多不可计164 20 - 164000 16000或1.6×104

2 多不可计295 46 1．6 37750 38000或3.8×104

3 多不可计271 60 2．2 27100 27000或2.7×104

4 多不可计多不

可计313 - 313000 310000或

3.1×105

5 27 11 5 - 270 270或2.7×102

6 0 0 0 - <1×10<10

7 多不可计305 12 - 30500 31000或3.1×104

5 实验结果

（1）将实验得到的菌落总数结果记入下表

10-210-310-410-5备注

1

2

平均

（2）报告所选两个稀释度之比及检测结果。

6 注意事项

（1）若实验样品为食品，为防止食品碎屑混入琼脂影响计数，通常需在琼脂中添加一定量TTC(氯化三苯四氮唑)，每100mL加1mL0.5%TTC，培养后，如系食品颗粒，不见变化，如为细菌，则生成红色菌落。

（2）理论上讲，为了得到实验食品中所有细菌菌落总数，应将样品接种到几种不同的培养基中并培养在不同的条件下，所得到的细菌菌落数总和。但根据国家颁发的不同食品的规定，都是根据用普通营养琼脂，37℃（水产品30℃）进行需氧培养的结果来确定的，而且这种测定确具代表性，因而菌落总数在一般卫生学评价中并不要求用不同培养基进行选择性培养。

（3）目前还有几种快速检测菌落总数的方法如由军事医学科学院研制而成食品细菌检验箱，菌落总数测定采用试管斜面计数法操作简便，不易受污染，结果与国标法平板计数一致。另一种是3M提供的Petrifilm Plates测试片（菌落总数测试片）。由于测试片中含有一种红色指示剂，使所有菌落易于识别计数，该片也可用于乳酸菌测定，48hr可确定菌落总数。

7 思考题

（1）什么是菌落总数，何谓cfu？

（2）若平板上菌落数生长一半较均匀，另一半呈片生长，如何计数菌落数？

（3）影响杂菌总数准确性的因素有哪些？