第3章抗体的人工制备
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第三章 人工抗体的制备
是将 Ig 的 H 链和 L 链的 V 区基因 相连，转染大肠杆菌表达的抗体分子，又称单 链 FV分子。
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四、其他基因工程抗体：
如:Ig相关分子：将抗体分子部分片段连接到与 抗体无关的序列上得到。
噬菌体抗体：将已知特异性的抗体分子的
所细有菌五，V区模、基拟全因免套在疫噬抗选菌体择体过基中程因构，库建使基具因有库相，应用特噬异菌性体的感重染
如：在抗肿瘤方面的应用。在戒毒上 也有重要应用价值。
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三、多克隆抗体制备过程
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第二节 单克隆抗体
一、概念： 是指由一个B细胞分化增殖的子代
细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原决定簇 的抗体，简称单抗。
特点：高特异性、高均一性
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抗体产生细胞
多克隆性
单克隆性 二、单抗与多抗的比较
同质性
高度异质
高度同质
特异性 高，与特定
较高，与抗原上
决定簇 结合
小鼠腹水： 0.5~1.0
10~15
其他血清蛋白
有
体外培养：少量
牛血清白蛋白
小鼠腹水：少量杂蛋白
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三、建立B细胞杂交瘤与单克隆抗体生产 基本过程
度均一性： 纯度很高的均一性抗体
高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应。
大量产生及稳定性： 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖之传代。
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五、单克隆抗体的应用
（一）在血清学技术方面。 （二）在免疫学基础研究方面。 （三）在肿瘤治疗方面。如生物导弹。 （四）在抗原纯化方面。 （五）用于制备实用抗文档独特型抗体疫苗。
第三节 基因工程抗体
一、概念： 利用基因工程技术制备的抗体分子，
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四、其他基因工程抗体：
如:Ig相关分子：将抗体分子部分片段连接到与 抗体无关的序列上得到。
噬菌体抗体：将已知特异性的抗体分子的
所细有菌五，V区模、基拟全因免套在疫噬抗选菌体择体过基中程因构，库建使基具因有库相，应用特噬异菌性体的感重染
如：在抗肿瘤方面的应用。在戒毒上 也有重要应用价值。
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三、多克隆抗体制备过程
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第二节 单克隆抗体
一、概念： 是指由一个B细胞分化增殖的子代
细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原决定簇 的抗体，简称单抗。
特点：高特异性、高均一性
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抗体产生细胞
多克隆性
单克隆性 二、单抗与多抗的比较
同质性
高度异质
高度同质
特异性 高，与特定
较高，与抗原上
决定簇 结合
小鼠腹水： 0.5~1.0
10~15
其他血清蛋白
有
体外培养：少量
牛血清白蛋白
小鼠腹水：少量杂蛋白
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三、建立B细胞杂交瘤与单克隆抗体生产 基本过程
度均一性： 纯度很高的均一性抗体
高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应。
大量产生及稳定性： 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖之传代。
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五、单克隆抗体的应用
（一）在血清学技术方面。 （二）在免疫学基础研究方面。 （三）在肿瘤治疗方面。如生物导弹。 （四）在抗原纯化方面。 （五）用于制备实用抗文档独特型抗体疫苗。
第三节 基因工程抗体
一、概念： 利用基因工程技术制备的抗体分子，
《抗体制备过程》课件
免疫动物的筛选
选择合适的动物种类： 如小鼠、大鼠、兔子
等
确定动物的健康状况： 确保动物健康，无疾
病
确定动物的年龄：选 择合适的年龄，如成
年动物
确定动物的性别：选 择合适的性别，如雌
性动物
确定动物的免疫状态： 选择免疫状态良好的
动物
确定动物的遗传背景： 选择遗传背景合适的
动物
确定动物的饲养条件： 确保动物饲养条件良
免疫佐剂的选择原则：根据抗 原性质、免疫途径、实验目的 等因素选择
免疫佐剂的优化方法：通过实 验筛选最佳浓度、组合方式等
抗体纯化技术的优化
亲和层析法： 利用抗体与抗 原的特异性结 合，实现抗体
的纯化
离子交换层析 凝胶过滤层析
法：利用抗体 法：利用抗体
与离子交换树 分子大小不同，
脂的相互作用， 实现抗体的纯
抗体应用
医学领域：用于诊 断和治疗疾病
生物技术领域：用 于基因工程和生物 制药
食品工业：用于食 品检测和食品安全
环境监测：用于环 境污染物检测和监 测
抗体制备过程
免疫原的制备
免疫原选择：选择合适的抗原或半抗原 免疫原纯化：通过纯化技术去除杂质 免疫原处理：对免疫原进行化学修饰或物理处理 免疫原保存：在适当的条件下保存免疫原，防止降解或变质
免疫原的纯化： 去除杂质，提 高抗原的纯度
免疫原的浓度： 选择合适的抗 原浓度，以提 高抗体的产量
和质量
免疫原的保存： 选择合适的保 存方法，如低 温保存、干燥 保存等，以保 持抗原的活性
和稳定性
免疫佐剂的选用与优化
免疫佐剂的作用：增强免疫反 应，提高抗体产量
免疫佐剂的种类：铝盐、脂质 体、核酸等
第三章 抗体
Ag Binding
Complement Binding Site Binding to Fc Receptors Placental Transfer
三、免疫球蛋白的水解片段
1. 木瓜蛋白酶（Papain）（将重链于近氨基端切断） Fab段（fragment of antigen- binding，抗原结合片 段） Fab段可以与抗原结合，具有抗体的活性。 Fc段（fragment crystalizable，可结晶片段） Fc段不能与抗原结合，但可执行Ig的其他生物学功 能。
Origin of Secretory Component of sIgA
四、IgD 1.单体分子 2.存在形式：分泌性 — 血清中，功能不清； 膜结合性 — B细胞表面, 3.意义 （1）是B细胞成熟的重要标志； （2）抗原受体，对B细胞活化、增殖和分化起调节 作用； 4.占血清Ig含量的1%； 5.半衰期3天。
IgG1 (kappa)
IgM (kappa)
（二）同种异型（allotype）
同一种属不同个体之间免疫球蛋白也具有的差 异性，主要反映在分子的CH和CL上的一个或数个 氨基酸的差异 (genetic markers — 遗传标志)。 Gm因子：Gm1～30 Am因子：A2m1，A2m2 IgG1 (kappa) IgG1 (kappa) Person 1 Person 2 Km因子：Km1，Km2，Km3
概念
1. 抗体（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗 原发生特异性结合的、具有免疫功能的糖蛋白。 抗体主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、 小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。 2. 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）结构性概念 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的 球蛋白。
Complement Binding Site Binding to Fc Receptors Placental Transfer
三、免疫球蛋白的水解片段
1. 木瓜蛋白酶（Papain）（将重链于近氨基端切断） Fab段（fragment of antigen- binding，抗原结合片 段） Fab段可以与抗原结合，具有抗体的活性。 Fc段（fragment crystalizable，可结晶片段） Fc段不能与抗原结合，但可执行Ig的其他生物学功 能。
Origin of Secretory Component of sIgA
四、IgD 1.单体分子 2.存在形式：分泌性 — 血清中，功能不清； 膜结合性 — B细胞表面, 3.意义 （1）是B细胞成熟的重要标志； （2）抗原受体，对B细胞活化、增殖和分化起调节 作用； 4.占血清Ig含量的1%； 5.半衰期3天。
IgG1 (kappa)
IgM (kappa)
（二）同种异型（allotype）
同一种属不同个体之间免疫球蛋白也具有的差 异性，主要反映在分子的CH和CL上的一个或数个 氨基酸的差异 (genetic markers — 遗传标志)。 Gm因子：Gm1～30 Am因子：A2m1，A2m2 IgG1 (kappa) IgG1 (kappa) Person 1 Person 2 Km因子：Km1，Km2，Km3
概念
1. 抗体（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗 原发生特异性结合的、具有免疫功能的糖蛋白。 抗体主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、 小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。 2. 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）结构性概念 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的 球蛋白。
人工制备抗体
中被清除，从而影响到达肿 瘤局部的抗体浓度。
小分子抗体的类型：
（1）Fcb片段， （2）单域抗体， （3）Fv片段， （4）单链抗体（ScFc）， （5）最小识别单位（MRU）， （6）双价小分子抗体 （diabody）， （7）双特异性小分子抗体， （8）微抗体（minibody）。
（二）噬菌体抗体
三、基因工程抗体
概念：又称重组抗体，利
用基因工程技术制备抗体 分子，这是分子水平的抗 体。
基因工程抗体的优势：
去除或减少无关结构，保留 或增加天然抗体特异性和生
物学活性。
基因工程抗体包括：
（一）改造鼠源性抗体
（二）噬菌体抗体 （三）胞内抗体
（一）改造鼠源性抗体
1.人-鼠嵌合抗体
2.改型抗体或人源化抗体 3.小分子抗体
2.改型抗体或人源化抗体
概念：指利用基因工程技术，将
鼠单抗V区中互补性决定区（CDR）
序列取代人源抗体CDR序列，重
构成既具有鼠源性单抗的特异性
又保持人抗体亲和力的CDR移植
抗体。
改型抗体或人源化抗体的特点：
保留亲本鼠单克隆抗体的亲 和力和特异性，又降低了其
异源性，有利应用于人体。
3.小分子抗体
二、单克隆抗体
概念：1975年，Kohler和 Milstein在自然杂交基础上 创建杂交瘤技术，其产生的 抗体只针对单一程示意图
单克隆抗体的特点：
•高特异性
•高均质性
单克隆抗体的应用：
1、在血清学技术方面, 2、在免疫学基础研究方面, 3、在抗原纯化方面, 4、在肿瘤治疗方面，如生物导 弹, 5、用于制备抗独特型抗体疫苗。
（3）细菌增殖快，培养成本低，适
合大规模生产，为临床上大量应用
小分子抗体的类型：
（1）Fcb片段， （2）单域抗体， （3）Fv片段， （4）单链抗体（ScFc）， （5）最小识别单位（MRU）， （6）双价小分子抗体 （diabody）， （7）双特异性小分子抗体， （8）微抗体（minibody）。
（二）噬菌体抗体
三、基因工程抗体
概念：又称重组抗体，利
用基因工程技术制备抗体 分子，这是分子水平的抗 体。
基因工程抗体的优势：
去除或减少无关结构，保留 或增加天然抗体特异性和生
物学活性。
基因工程抗体包括：
（一）改造鼠源性抗体
（二）噬菌体抗体 （三）胞内抗体
（一）改造鼠源性抗体
1.人-鼠嵌合抗体
2.改型抗体或人源化抗体 3.小分子抗体
2.改型抗体或人源化抗体
概念：指利用基因工程技术，将
鼠单抗V区中互补性决定区（CDR）
序列取代人源抗体CDR序列，重
构成既具有鼠源性单抗的特异性
又保持人抗体亲和力的CDR移植
抗体。
改型抗体或人源化抗体的特点：
保留亲本鼠单克隆抗体的亲 和力和特异性，又降低了其
异源性，有利应用于人体。
3.小分子抗体
二、单克隆抗体
概念：1975年，Kohler和 Milstein在自然杂交基础上 创建杂交瘤技术，其产生的 抗体只针对单一程示意图
单克隆抗体的特点：
•高特异性
•高均质性
单克隆抗体的应用：
1、在血清学技术方面, 2、在免疫学基础研究方面, 3、在抗原纯化方面, 4、在肿瘤治疗方面，如生物导 弹, 5、用于制备抗独特型抗体疫苗。
（3）细菌增殖快，培养成本低，适
合大规模生产，为临床上大量应用
抗体制备课件
9
根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方法 主要有以下几类： ①带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原： 羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基 形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体 羧基缩合。 ②带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与 载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基 的半抗原衍生物后才能与载体连接。 ③带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮 化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原 衍生物。
是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。 （3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲
基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完 全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。
8
2.连接方法
半抗原与载体的连接有物理法和化学法。 物理法是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其
原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主 要有PVP和CMC等； 化学法是利用某些功能基团把半抗原连接到白质 类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用 不同的方法进行连接。
29
载体
SPA IgG 杂质
再生
载体 洗脱
图4 亲和层析纯化IgG基本过程示意图
30
四、免疫血清的鉴定 1. 效价的测定：颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗
原常用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。 2. 特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、
免疫电泳法。
31
3. 纯度的鉴定：抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺 凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向扩散试验、免疫电泳 等方法。IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE 结果应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和22kD）， 若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需 进一步纯化。
根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方法 主要有以下几类： ①带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原： 羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基 形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体 羧基缩合。 ②带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与 载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基 的半抗原衍生物后才能与载体连接。 ③带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮 化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原 衍生物。
是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。 （3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲
基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完 全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。
8
2.连接方法
半抗原与载体的连接有物理法和化学法。 物理法是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其
原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主 要有PVP和CMC等； 化学法是利用某些功能基团把半抗原连接到白质 类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用 不同的方法进行连接。
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载体
SPA IgG 杂质
再生
载体 洗脱
图4 亲和层析纯化IgG基本过程示意图
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四、免疫血清的鉴定 1. 效价的测定：颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗
原常用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。 2. 特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、
免疫电泳法。
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3. 纯度的鉴定：抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺 凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向扩散试验、免疫电泳 等方法。IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE 结果应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和22kD）， 若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需 进一步纯化。
抗体的制备ppt课件
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23
c、有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的 介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电 荷的引力，导致溶解度降低而沉淀，有些 有机溶剂能破坏蛋白质的水化膜而使蛋白 质沉淀，例Cohn地温酒精可将血浆蛋白分 为五组。IgG属CohnⅢ。
d、其它沉淀剂：常用聚乙二醇(PEG)和硫酸 葡聚糖。PEG浓度3~4%可沉淀IC，6~7%沉淀 IgM，8~12%沉淀IgG，12~15%沉淀其它球 蛋白，25%则沉淀白蛋白。
1、佐剂的条件：
A、增加抗原的表面积，并改变抗原 的活性基团构型，从而增加抗原的 免疫原性。
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32
B、与抗原结合能延长抗原在局部组织 中的存留时间，达到持续刺激基团 产生高效价的抗体。
C、 可以激活免疫活性细胞，增强体 液免疫、细胞免疫和非特异免疫功 能。
D、 无毒、无副作用。
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19
B、冷热交替法：将材料投入沸水中，90 ℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中。 在细菌或病毒中提取蛋白质及核酸可用 此法。
C、超声波破碎法：是利用超声波的机械振 动而使细胞破碎的方法。微生物和组织 细胞破碎多用此法，但真菌厚膜孢子则 较难打破。
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20
D、酶处理法：酶在一定的条件下能消化细 菌和细胞。例如在碱性(pH8.0)下，溶菌 酶可专一破坏G+菌细胞壁。此法适用于 多种微生物。
1
4
Ag
2 3
抗原(antigen，Ag)
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3
▪ 3.单克隆抗体
(Monoclonal Antibody, McAb)
由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生 的同源抗体。
▪ 4.多克隆抗体
第三章抗体
由粘膜上皮细胞合成。 是分泌型IgA（SIgA）的结构成分。 作用：保护SIgA抵抗外分泌液中蛋白酶 的降解作用和介导多聚IgA向粘膜上皮外 主动输送的作用。
二、免疫球蛋白的功能区
链内二硫键折叠成球形区称为功能区，
约由110个aa组成。 1. L链：2个，VL，CL各1 2. H链： IgG，IgA，IgD：4个（V区1个，C区3个）
（二）IgM :五聚体 900KD
1. 产生部位：同IgG
2. 含量与分布：10%
分布血液和组织液中
3. 初次应答中的主要抗体 4. 进化上和个体发育最早出现的抗体 5. 处女型B cell的主要mIg
（一）轻链和重链
1. 轻链（light chain，L链）
214个氨基酸残基，24KD。
分为：κ与λ
2个亚型。
2. 重链（heavy chain，H链） 450-550个氨基酸残基，55-75KD。 分为5类，μ、γ、α、δ、ε链。 IgM，IgG，IgA，IgD，IgE。
H链与L链的区别
V/C H L 1/3 1
高变区(hypervariable region，HVR)
HVR3
150 Variability Index
100 HVR1
HVR2
50
FR1 FR2 FR3 FR4
0
25
50 Amino acid residue
75
100
框架区(Framework,FR)
决定簇互补区
（complementarity-determinant region, CDR ）
2. Nisonoff 胃蛋白酶
(1)F(ab’)2 段 1个 结合颗粒性抗原出现凝集反应 (2)Fc’段 1个
二、免疫球蛋白的功能区
链内二硫键折叠成球形区称为功能区，
约由110个aa组成。 1. L链：2个，VL，CL各1 2. H链： IgG，IgA，IgD：4个（V区1个，C区3个）
（二）IgM :五聚体 900KD
1. 产生部位：同IgG
2. 含量与分布：10%
分布血液和组织液中
3. 初次应答中的主要抗体 4. 进化上和个体发育最早出现的抗体 5. 处女型B cell的主要mIg
（一）轻链和重链
1. 轻链（light chain，L链）
214个氨基酸残基，24KD。
分为：κ与λ
2个亚型。
2. 重链（heavy chain，H链） 450-550个氨基酸残基，55-75KD。 分为5类，μ、γ、α、δ、ε链。 IgM，IgG，IgA，IgD，IgE。
H链与L链的区别
V/C H L 1/3 1
高变区(hypervariable region，HVR)
HVR3
150 Variability Index
100 HVR1
HVR2
50
FR1 FR2 FR3 FR4
0
25
50 Amino acid residue
75
100
框架区(Framework,FR)
决定簇互补区
（complementarity-determinant region, CDR ）
2. Nisonoff 胃蛋白酶
(1)F(ab’)2 段 1个 结合颗粒性抗原出现凝集反应 (2)Fc’段 1个
病原生物与免疫学课件试题3第三章 免疫球蛋白与抗体
基因工程抗体
化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。
IgA的特点
参与皮肤粘膜的局部抗感染作用 初乳中含有高浓度的sIgA----母乳喂养 通过替代途径激活补体 参与Ⅲ型超敏反应
(四)IgD
IgD是B细胞的重要表面标志 B细胞的分化过程中首先出现mIgM，
mIgD的出现标志着B细胞成熟 对防止免疫耐受有一定作用
标志 CH2:补体C1q结合位点，
IgG可通过胎盘 CH3/CH4:与多种细胞表
面的FcR结合(免疫调理,I 型超敏反应)
第二节 免疫球蛋白的功能 一、免疫球蛋白的生物学活性
特异性结合Ag 激活补体 结合免疫细胞 穿过胎盘和粘膜
二、各类免疫球蛋白的特性与功能
在免疫球蛋白中IgG、IgD和IgE为单体 结构。
抗原抗体在免疫球蛋白 可变区结合
胃蛋白酶水解后由于 F(ab’)2片段保留了 结合相应抗原的生物 学活性，又避免了Fc 段抗原性可能引起的 副作用，因而被广泛 用作生物制品
第一节免疫球蛋白的分子结构
一、基本概念
抗体（antibody,Ab)是B细胞识别抗原 后活化，增殖，分化为浆细胞，由浆细 胞所产生的与相应抗原发生特异性结合 的球蛋白，是介导体液免疫的重要免疫 分子，主要存在于血清等体液中。
两条重链（H）和两条 轻链（L）
氨基端和羧基端。
1.重链与轻链
(1)根据重链分类： 根据重链靠近羧基末端氨基酸组成及排列顺序 不同，将重链分为种：γ、α、μ、δ、ε 根据重链组成不同，将Ig分为五类：IgG、 IgA、IgM、IgD、IgE
(2)根据轻链分型：κ、λ型
天然Ig分子中，重链同类，轻链同型
IgM是抗原刺激后出现最早的抗体，半衰期 短，故检测IgM水平可用于传染病的早期诊 断。
化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。
IgA的特点
参与皮肤粘膜的局部抗感染作用 初乳中含有高浓度的sIgA----母乳喂养 通过替代途径激活补体 参与Ⅲ型超敏反应
(四)IgD
IgD是B细胞的重要表面标志 B细胞的分化过程中首先出现mIgM，
mIgD的出现标志着B细胞成熟 对防止免疫耐受有一定作用
标志 CH2:补体C1q结合位点，
IgG可通过胎盘 CH3/CH4:与多种细胞表
面的FcR结合(免疫调理,I 型超敏反应)
第二节 免疫球蛋白的功能 一、免疫球蛋白的生物学活性
特异性结合Ag 激活补体 结合免疫细胞 穿过胎盘和粘膜
二、各类免疫球蛋白的特性与功能
在免疫球蛋白中IgG、IgD和IgE为单体 结构。
抗原抗体在免疫球蛋白 可变区结合
胃蛋白酶水解后由于 F(ab’)2片段保留了 结合相应抗原的生物 学活性，又避免了Fc 段抗原性可能引起的 副作用，因而被广泛 用作生物制品
第一节免疫球蛋白的分子结构
一、基本概念
抗体（antibody,Ab)是B细胞识别抗原 后活化，增殖，分化为浆细胞，由浆细 胞所产生的与相应抗原发生特异性结合 的球蛋白，是介导体液免疫的重要免疫 分子，主要存在于血清等体液中。
两条重链（H）和两条 轻链（L）
氨基端和羧基端。
1.重链与轻链
(1)根据重链分类： 根据重链靠近羧基末端氨基酸组成及排列顺序 不同，将重链分为种：γ、α、μ、δ、ε 根据重链组成不同，将Ig分为五类：IgG、 IgA、IgM、IgD、IgE
(2)根据轻链分型：κ、λ型
天然Ig分子中，重链同类，轻链同型
IgM是抗原刺激后出现最早的抗体，半衰期 短，故检测IgM水平可用于传染病的早期诊 断。
抗体制备过程PPT课件
背部皮下，每处注射0.2 ml, 共2～4点。待肿瘤到达一定大小后(一般10～20天
)那么可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可到达1-10mg／ml。但采血量有
限。
+
② 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于
BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可
+ 1. 有限稀释法的程序
+
① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备)
+
② 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml
+
③ 取130个细胞放入含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl
／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下细胞悬液补加含饲养细胞的完全培
养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下
备的，与其它抗原无交叉反响性。与其它常规免疫 血清相比，单抗的特异性高、效价高、质地均一， 便于精制浓缩，应用单抗可以提高检测方法的敏感 性和特异性。同时，他又可作为提纯抗原、制备疫 苗、生产生物制剂和用于根底研究的重要手段。
+ 3 .生产简单，易于标准化 + 一旦选育成功一株高效价的杂交瘤细胞株，经鉴定
料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
+
(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
+
(5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
+
(6) 在室温下融合可先以预热40℃:
+
① 30秒内参加预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加
第三章 人工抗体的制备
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五、单克隆抗体的应用
（一）在血清学技术方面。
（二）在免疫学基础研究方面。
（三）在肿瘤治疗方面。如生物导弹。
（四）在抗原纯化方面。
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第三节 基因工程抗体
一、概念： 利用基因工程技术制备的抗体分子，称为基因工程抗体。这是分子水平的抗体。
优势：去除或减少 无关结构，保留或 增加天然抗体特异 性和生物学活性。
五、全套抗体基因库
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第四节 催化抗体
一、概念： 是具有催化活性的免疫球蛋白，也叫抗体酶。具有抗体的高度选择性和酶的高效催化性。
优点： 具有抗体的高
度选择性和酶的高
效催化性。
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二、催化抗体的制备：
如：细胞融合法、基因工程抗体技术、引入辅助因子法等。
三、催化抗体的应用：
如：在抗肿瘤方面的应用。在戒毒上也有重要应用价值。
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基本制备过程：
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一、嵌合抗体：
是指在同一抗体分 子中含有不同种属来 源抗体分子片段的抗 体。
嵌合抗体多为“鼠-
人”类型。
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二、重构抗体：
将鼠抗体超变区基因嵌入人抗体Fab骨架区编码基因中，再将 此DNA片段与人Ig恒定区基因相连，转染杂交瘤细胞，并表达嵌合的V 区抗体。
三、单链抗体：
单
需适当选择 产生高纯度抗体
无 悬浮培养：0.01~0.05
中空纤维： 小鼠
体外培养液：无7
三、建立B细胞杂交瘤与单克隆抗体生产基本过程
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四、单克隆抗体的优势
高度均一性： 纯度很高的均一性抗体
高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应。
[课件]第3章抗体的人工制备PPT
![[课件]第3章抗体的人工制备PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/251c4063be1e650e52ea9944.png)
一、嵌合抗体
嵌合抗体 （chimeric antibody)是指同一 抗体分子中含有不同种属来源抗体片段 的看体，又称杂种抗体．主要有“鼠－ 人类型。”Fab或Ｆ（ab）2来源于鼠类， Fc来源于人类。这种杂交瘤细胞分泌的 抗体特异性和亲和力与原杂交瘤细胞相 同，但减少了鼠源性成分。
二、重构抗体
为进一步减少鼠源蛋白在嵌合抗体中 的含量，将鼠抗体超变区基因嵌入人 抗体Fab骨架区的编码基因中，在将 此基因片段与人Ig恒定区基因相连， 然后转染杂交瘤细胞，使之表达V区 抗体，即为重构抗体（reshaping antibody）
三、单链抗体
单链抗体（single—chain antibody）又 称Fv分子。由VL区氨基酸序列VH区氨 基酸序列经肽连接物（linker）连接而成。 肽连接物还可以将药物、毒素或同位素 与单链抗体相连。这种抗体分子小，免 疫原性低；在血清中清除快；无FC片段， 避免非特异性杀伤；能进入实体瘤周围 的微循环等。
四、Ig相关分子
将抗体的部分片段连接到一些有治 疗作用的毒素或药物上，取代Fc片 段，可直接发挥毒素或药物的治疗 作用，起“生物导弹”作用。 例如：CD4免疫黏附素治疗AIDS。
五、噬菌体抗体
噬菌体抗体（phage antibody）是 将一直特异性抗体分子的所有V区 基因在噬菌体中构成基因库，用噬 菌体感染细菌，模拟免疫选择过程， 具有相应特异性重链和轻链可变区 即可在噬菌体表面呈现出来。这种 技术成为噬菌体表面展示技术 （phage display technology）
脾
B 细 胞
骨髓瘤小鼠 取腹水
抗原
骨髓瘤细胞 + PEG, 融合 杂交瘤细胞
Ab1 Ab2 Ab3 Ab4
《医学免疫学 》教学课件：第三章 抗体
抗体主要存在于血清和体液中，是介导特异性体液免疫作 用的重要效应分子。它们能与病原体等相应抗原特异性结 合，并在其他固有免疫细胞和分子协助下产生抗感染免疫 效应。
表 达 于 B 细 胞 表 面 的 膜 型 免 疫 球 蛋 白 M （ membrane immunoglobulin M, mIgM）为IgM 单体，其胞外区结构与 血液中的IgM基本相同，且具有特异性识别结合相应抗原 表位的功能，故称之为B细胞抗原受体（BCR）。
多克隆抗体：由多个B细胞克隆产生的针对多种抗原 表位的混合抗体。
特点：来源广泛，制备容易，但特异性不高，易发生 交叉反应。
单克隆抗体：由单一克隆杂交瘤细胞产生的只识别 某一特定抗原表位的同源抗体。
特点：结构高度专一，特异性强，效价高，少或无交 叉反应，可大量生产。
单克隆抗体的制备原理和方法：
与Tiselius一起，用电 泳证明了抗体是丙种球 蛋白。
Elvin A. Kabat （1914-2000）
Adapted from A. Tiselius and E. A. Kabat, J. Exp. Med. 1939, 69:119
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1972
同种型
同种异型
独特型
（种属型标志） （个体型标志） （细胞型标志）
同种型
同一种属所有个体抗体分子共有的抗原特异性， 为种属型标志。 同种型抗原决定基位于CH、CL。 根据CH抗原特异性的不同将抗体分成五类。 亚类：因重链恒定区内某些抗原表位及二硫键数 目和位置存在差异，IgG分四个亚类（IgG1～4）， IgA分两个亚类（IgA1～2）。 根据CL抗原特异性的不同将Ig分成两型：κ、λ。 亚型：λ型轻链恒定区内由于某些抗原表位存在差 异，可将其分为λ1～4四个亚型。
表 达 于 B 细 胞 表 面 的 膜 型 免 疫 球 蛋 白 M （ membrane immunoglobulin M, mIgM）为IgM 单体，其胞外区结构与 血液中的IgM基本相同，且具有特异性识别结合相应抗原 表位的功能，故称之为B细胞抗原受体（BCR）。
多克隆抗体：由多个B细胞克隆产生的针对多种抗原 表位的混合抗体。
特点：来源广泛，制备容易，但特异性不高，易发生 交叉反应。
单克隆抗体：由单一克隆杂交瘤细胞产生的只识别 某一特定抗原表位的同源抗体。
特点：结构高度专一，特异性强，效价高，少或无交 叉反应，可大量生产。
单克隆抗体的制备原理和方法：
与Tiselius一起，用电 泳证明了抗体是丙种球 蛋白。
Elvin A. Kabat （1914-2000）
Adapted from A. Tiselius and E. A. Kabat, J. Exp. Med. 1939, 69:119
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1972
同种型
同种异型
独特型
（种属型标志） （个体型标志） （细胞型标志）
同种型
同一种属所有个体抗体分子共有的抗原特异性， 为种属型标志。 同种型抗原决定基位于CH、CL。 根据CH抗原特异性的不同将抗体分成五类。 亚类：因重链恒定区内某些抗原表位及二硫键数 目和位置存在差异，IgG分四个亚类（IgG1～4）， IgA分两个亚类（IgA1～2）。 根据CL抗原特异性的不同将Ig分成两型：κ、λ。 亚型：λ型轻链恒定区内由于某些抗原表位存在差 异，可将其分为λ1～4四个亚型。
3.抗体的人工制备
第三章抗体的人工制备由一个祖先细胞增殖而形成的一群细胞称为克隆(clone，无性繁殖系)一个B细胞克隆只能产生针对一种抗原表位的抗体;一个浆细胞只能分泌一种类型的抗体第1节多克隆抗体一、多克隆抗体的概念①将抗原物质经不同途径注入动物体内，经数次免疫后采取动物血液，分离出血清，由此获得的抗血清即为多克隆抗体(polyclonal antibody, PcAb)，简称多抗。
②从天然感染康复动物采取的血清。
无论是细菌抗原，还是病毒抗原，都含有多种抗原成分。
即使是纯蛋白质抗原分子也含有多种抗原表位，进入机体后可激活多种淋巴细胞克隆，机体可产生针对各种抗原或抗原决定簇(表位)的抗体, 由此获得的抗血清是一种多克隆的混合抗体，具有高度的异质性。
进一步讲，针对同一抗原决定簇的抗体仍是由不同B细胞克隆产生的不同质的抗体。
二、多克隆抗体制备的基本过程1.抗原制备2.动物免疫3.试血测定抗体效价4.血清分离与保存5.多抗纯化与标记三、多克隆抗体的用途1.用于血清学实验——作为阳性血清或标记抗体(血清凝集实验/沉淀实验/补体结合实验/中和实验/免疫标记技术/免疫转印技术) 2.治疗制剂——可用于一些传染病的紧张预防和治疗第 1 页/共 6 页第2节单克隆抗体一、单克隆抗体的概念单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞(浆细胞)产生的针对单一抗原决定簇的抗体。
将产生特异性抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤，这种杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又具有B细胞分泌特异性抗体的能力，由克隆化的B细胞杂交瘤产生的抗体即为单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)，简称单抗。
二、单抗与多抗的比较与多克隆抗体比较，单克隆抗体具有无可比拟的优越性：高特异性、高纯度、均质性好、亲和力不变、重复性强、效价高、成本低并可大量生产等。
三、建立B细胞杂交瘤与单克隆抗体的制备1.B细胞的制备小鼠脾细胞悬液2.骨髓瘤细胞的制备免疫相同来源的小鼠骨髓瘤细胞3.饲养细胞的决定融合之前, 将饲养细胞制成所需的浓度参加培养板孔中。
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第4节 催化抗体
一、概念 催化抗体（ 催化抗体（catalytic antibody）也称抗体 ） ），是具有催化活性的免疫球 酶（abzyme），是具有催化活性的免疫球 ）， 蛋白， 蛋白，兼有抗体的高度选择性和酶的高效催 化性。 化性。 二、催化抗体的制备。
为进一步减少鼠源蛋白在嵌合抗体中 的含量，将鼠抗体超变区基因嵌入人 抗体Fab骨架区的编码基因中，在将 此基因片段与人Ig恒定区基因相连， 然后转染杂交瘤细胞，使之表达V区 抗体，即为重构抗体（reshaping antibody）
三、单链抗体
单链抗体（single—chain antibody）又 称Fv分子。由VL区氨基酸序列VH区氨 基酸序列经肽连接物（linker）连接而成。 肽连接物还可以将药物、毒素或同位素 与单链抗体相连。这种抗体分子小，免 疫原性低；在血清中清除快；无FC片段， 避免非特异性杀伤；能进入实体瘤周围 的微循环等。
第3章 抗体的人工制备 (artificial antibody)
河南科技学院动物科学系
第1节 多克隆抗体
一、多克隆抗体概念 （polyclonal 多克隆抗体概念 antibodies,PcAb）：第一代抗体，是指由多 ）：第一代抗体 ）：第一代抗体， 克隆B细胞群产生的 细胞群产生的、 克隆 细胞群产生的、针对多种抗原决定簇的 混合抗体。 混合抗体。 将抗原物质经不同途径注入动物体内,经数次免 疫后采取动物血液,分离血清,由此获得的抗血 清即为多克隆抗体。 二、基本过程 抗原制备→动物免疫→血清效价测定→血清分 离与保存→多抗纯化与标记。.
单 克 隆 抗 体 和 多 克 隆 抗 体 产 生 区 别 示 意 图
脾 B 细 胞
骨髓瘤小鼠 取腹水
抗原
骨髓瘤细胞 + PEG, 融合 杂交瘤细胞
Ab1 Ab2 Ab3 Ab4
抗血清
HAT培养， 培养， 培养 稀释
Ab3 Ab1 Ab2 Ab4 Ab1 Ab3 Ab4
普通抗血清.多克隆抗体 普通抗血清 多克隆抗体
四、Ig相关分子
将抗体的部分片段连接到一些有治 疗作用的毒素或药物上，取代Fc片 段，可直接发挥毒素或药物的治疗 作用，起“生物导弹”作用。 例如：CD4免疫黏附素治疗AIDS。
五、噬菌体抗体
噬菌体抗体（phage antibody）是 将一直特异性抗体分子的所有V区 基因在噬菌体中构成基因库，用噬 菌体感染细菌，模拟免疫选择过程， 具有相应特异性重链和轻链可变区 即可在噬菌体表面呈现出来。这种 技术成为噬菌体表面展示技术 （phage display technology）
单克隆抗体
单克隆抗体和普通抗体的比较
•第3节基因工程抗体 第 节基因工程抗体
•基因工程抗体（genetically engineering 基因工程抗体（ 基因工程抗体 antibodies）：第三代抗体，对Ig基因结构 ）：第三代抗体 ）：第三代抗体， 基因结构 与功能的了解与DNA重组技术相结合，根 重组技术相结合， 与功能的了解与 重组技术相结合 据研究者的意图在基因水平对Ig分子进行切 据研究者的意图在基因水平对 分子进行切 拼接或修饰， 割、拼接或修饰，甚至是人工全合后导入受 体细胞表达，产生新型抗体。 体细胞表达，产生新型抗体。
பைடு நூலகம்
六、全套抗体基因库
将全套抗体基因库中VH基因与有限数目 基因排列 将全套抗体基因库中 基因与有限数目VL基因排列 基因与有限数目 组合构建Ig，这种抗体基因库称为全套抗体基因库。 组合构建 ，这种抗体基因库称为全套抗体基因库。 这种方法用于催化抗体的筛选时，不致丢失。 这种方法用于催化抗体的筛选时，不致丢失。
一、嵌合抗体
嵌合抗体 （chimeric antibody)是指同一 抗体分子中含有不同种属来源抗体片段 的看体，又称杂种抗体．主要有“鼠－ 人类型。”Fab或Ｆ（ab）2来源于鼠类， Fc来源于人类。这种杂交瘤细胞分泌的 抗体特异性和亲和力与原杂交瘤细胞相 同，但减少了鼠源性成分。
二、重构抗体
第2节 单克隆抗体 一、单克隆抗体（monoclonal 单克隆抗体（
antibodies,McAb）：第二代抗体，单 ）：第二代抗体， ）：第二代抗体 克隆抗体：是指由一个B杂交瘤细胞活化 杂交瘤细胞活化、 克隆抗体：是指由一个 杂交瘤细胞活化、 增殖、分化产生的子代细胞克隆分泌的、 增殖、分化产生的子代细胞克隆分泌的、 针对一个抗原决定簇的抗体。 针对一个抗原决定簇的抗体。1975年， 年 由Kohler和Milstein建立单克隆抗体技 和 建立单克隆抗体技 术。