微生物学实验细菌染色

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目的要求
1. 学习微生物涂片，染色的基本技术，掌握 细菌的染色法。
2. 初步认识细菌的形态特征。 3. 巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操
作技术。
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微生物染色的染料
• 是一类苯环上带有发色基团和助色基团的 有机化合物。
2. 无菌操作从试管中生长有琼脂斜面上挑取少许 菌苔；
3. 将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀 并涂成薄膜。
注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不 宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。
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2、干燥
❖ 将涂好菌膜的载玻片平放在载玻片架上， 室温下自然干燥。
• 染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料 两大类。
• 在微生物染色中，碱性染料较常用，如常 用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性紫 复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于 碱性染料。
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微生物染色原理
❖在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞 通常带负电荷；
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4、染色
❖将热固定的细菌涂片平放于在载玻片架上， 滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄 膜为宜）。
❖染色时间：
➢吕氏碱性美蓝染色1~2min； ➢石炭酸复红染色约1min ➢草酸铵结晶紫染色约1min。
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• 材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸， 吸水纸，染色缸等。
• 染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol) 碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；
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革蓝氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较
成分
占细胞壁干重的%
革蓝氏阳性菌
革蓝氏阴性菌
肽聚糖 含量很高（50-90） 含量很低（~10）
磷壁酸 含量较高（<50） 无
类脂质 一般无（ < 2） 含量较高（~20）
蛋白质 无
ห้องสมุดไป่ตู้
含量较高
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革蓝氏染色的意义
• 细菌分类鉴定 • 指导临床用药
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微生物分类鉴定的特征
❖形态学和生理生化特征 ❖血清学实验和噬菌体分型 ❖氨基酸序列和蛋白质分析 ❖核酸碱基组成和序列分析
涂片
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简单染色方法
干燥
固定
镜检
干燥
水洗
染色
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革兰氏染色
• 菌种:
• 参考菌：G+：Staphylococcus aureus,
•
G-: Escherichia coli
• 仪器 显微镜；
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方法
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涂片
❖要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色; ❖注意练习无菌操作； ❖在载玻片上滴半滴生理盐水； ❖取菌不要贪多，接种环上肉眼可见菌苔痕
迹即可； ❖菌苔在生理盐水中涂片要均匀，局部不宜
• ⑷复染 滴加蕃红，染色2-3min，水洗。 最后用吸水纸轻轻吸干。
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• 干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为 革兰氏阳性菌(G)；被染成红色者是革兰 氏阴性菌(G-)。
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3、固定
❖手持已经自然干燥的涂好菌膜的载玻片， 涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，热 固定细菌细胞。
原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固、使细 菌细胞质凝固，从而固定细菌细胞形态， 并使之牢固附着在载玻片上。
注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚 至破坏细胞形态。
革兰氏阴性菌
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革兰氏阳性菌
• 实验报告
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作业
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1、涂片
1. 取一块干净的载玻片平放在载玻片架上，在载 玻片中央滴一滴生理盐水（或蒸馏水）；
❖自然干燥：将染好色的细菌涂片平放在载 玻片架上，室温下自然干燥；
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形态学特征
❖培养特征、菌落的形状、大小、颜色、表 面特征、光泽等
❖细胞形态：形状、大小、排列方式 ❖特殊结构：鞭毛、芽孢、孢子、荚膜等 ❖细胞内涵物 ❖染色反应：革蓝氏染色、抗酸性染色 ❖运动性
❖涂片 ❖初染 ❖媒染 ❖脱色 ❖复染 ❖镜检
过厚,以免脱色不完全造成假阳性。
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• ⑴初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵 结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色 1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲 洗。
• ⑵媒染 滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水 洗。
• ⑶脱色 滴加95%乙醇，脱色20-25s立即 水洗，以终止脱色。
❖而碱性染料在电离时，其分子的染色部分 带正电荷；
❖带正电荷的碱性染料染色部分很容易与带 负电荷细菌细胞结合使细菌染色。
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材料
1. 菌种 2. 染色剂 3. 仪器或其他用具：
➢ 显微镜 ➢ 酒精灯 ➢ 载玻片 ➢ 接种环 ➢ 香柏油 ➢ 酒精+乙醚 ➢ 擦镜纸 ➢ 生理盐水等。
5、水洗
❖将细菌涂片上染液倒入废液缸中； ❖手持细菌染色涂片，置于废液缸上方，用
洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无 色为止。 注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使 水从载玻片的一端流下。水流不宜过急， 过大，以免涂片薄膜脱落。
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6、干燥