(完整版)Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题
ELISA原理方法操作及注意事项
ELISA原理方法操作及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测目标分子的存在和浓度。
ELISA方法基于抗原-抗体反应的原理，通过酶标记的二抗或底物来标记和检测特定抗原或抗体的结合。
1.涂覆：将特异性抗体或抗原溶液加入微孔板的孔中，使其在孔壁上吸附，形成“涂覆抗原”或“涂覆抗体”的微孔板。
孔顶部通常需要使用一个覆膜或负压干燥来防止蒸发。
2.阻断：将孔中添加阻断剂如牛血清白蛋白（BSA）或乳糖，以防止非特异性结合。
3.样品加入：将待测样品加入微孔板，并充分搅拌孔内溶液，以使潜在的目标分子与涂覆的抗原或抗体结合。
4.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。
5.次级抗体加入：加入酶标记的二抗，以与结合到涂覆抗原或抗体的目标分子结合。
这种二抗可以是对目标物质抗体的抗体，也可以是对使用的抗原的抗体。
6.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。
7.底物加入：加入底物（通常为染色底物），以使酶标记的二抗产生可观察的信号。
底物反应产生的颜色或荧光强度与目标分子的浓度成正比。
8.停止反应：加入停止剂如酸，以停止底物反应，并防止进一步的信号增加。
此步骤通常在一定时间后进行。
1.注意对ELISA试剂的保存和使用条件，避免试剂的过期或不适当的保存导致结果偏差。
2.样品收集和处理方面要仔细。
避免样品的污染和交叉污染。
根据检测的目标分子选择适当的样品收集方法和处理方法。
3.在操作过程中，严格控制操作温度和时间。
不同的ELISA方法和试剂可能需要不同的温度和时间条件。
4.遵循相关的操作规程和实验室安全准则，使用个人保护装备，确保实验室安全。
5.在操作过程中，要准确记录每个步骤的时间、温度和取样量等信息，以便进行准确的数据分析和结果解释。
6.ELISA的结果通常是通过测量光密度或荧光强度来表达的，因此在结果分析时需要针对每个样品和对照进行准确的光度或荧光测量。
(完整版)实验方法整理-ELISA
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay, ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
一、ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
进行检测时，样品中的受检物质（抗原或抗体）与固定的抗体或抗原结合。
通过洗板除去非结合物，再加入酶标记的抗原或抗体，此时，能固定下来的酶量与样品中被检物质的量相关。
通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的灵敏度。
二、ELISA的基本类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
这种测定方法中有3种必要的试剂：1. 固相的抗原或抗体；2. 酶标记的抗原或抗体；3. 酶作用的底物。
根据试剂的来源和标本的性状及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
1. 双抗体夹心法测抗原针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体。
适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
2. 竞争法测抗原首先将特异性抗体包被于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，另一组只加酶标记抗原，经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。
此方法测定的抗原只要有一个结合部位即可，对小分子抗原如激素和药物类的测定常用此法。
优点是快，缺点是需要较多量的酶标记抗原。
3. 免疫抑制法测抗原被检标本对底物显色的抑制程度与标本中所含抗原的量成正比，二者之差即为预测抗原的量。
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常见的免疫检测方法，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
Elisa的操作方法和常见问题对于熟练进行实验和解决实验中的问题都至关重要。
以下是Elisa的常见类型、实验标准操作方法以及常见问题的详细介绍。
一、常见类型：1. 间接Elisa：该方法利用抗体的特异性结合性质来检测特定抗原。
首先，在官网上涂上反应性抗原的试样，然后添加能与抗原结合的一抗，再加入与一抗结合的二抗和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。
2. 直接Elisa：该方法利用特异性抗体与抗原的结合性质来检测特定抗原。
在官网上涂上反应性抗原的试样，然后加入能与抗原结合的标记抗体和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。
二、实验标准操作方法：1.样品制备：收集要检测的样品，并进行必要的处理和制备，如离心、稀释等。
2.官网涂布：将样品或标准物质涂在官网上，并在适当的温度条件下孵育一段时间，使其抗原完全吸附到官网上。
3.阻断：用适当的阻断缓冲液或血清阻止非特异性结合。
4.添加（初级）抗体：加入特异性的初级抗体，让其与官网上的抗原结合。
5.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的初级抗体。
6.添加（二级）抗体：加入特异性的二级抗体，使其与初级抗体结合，并将标记物引入实验系统。
7.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的二级抗体。
8.底物添加：加入含有底物的溶液，使底物被标记物催化，产生颜色反应。
9.反应终止：加入适当的溶液将反应停止。
10.测定：通过检测底物催化反应产生的颜色变化，使用酶标仪等设备测量并分析光密度。
三、常见问题：1.如何选择合适的抗体和标记物？2.如何优化实验条件？在实验过程中，可以通过优化浓度和孵育时间等条件来提高实验的敏感性和特异性。
可以尝试不同浓度的抗体和试剂，并对孵育时间和温度进行调整。
3.如何处理实验结果？实验结果通常会通过测量光密度来表示。
典型的Elisa实验结果可以使用标准曲线进行定量，或者通过比较样品和对照组的光密度差异来进行定性判断。
酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤
酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤酶联免疫吸附测定（ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
实验步骤1.标准品的稀释：按表1在小试管中进行标准品的稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50µl，待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品1 0µl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟.10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（O D值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
12.计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
BDNF的ELISA结果显示为毫微克/毫克组织（ng / mg）或皮克/mL上清液（pg / mL），并表示为平均值±SEM。
常见问题一、白板现象：显色结束后，酶标板所有孔均无颜色，阳性对照不显色。
ELISA步骤试剂及注意事项
ELISA步骤试剂及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生命科学、医学和工业领域的实验技术，用于检测和测定生物样本中的抗原或抗体。
以下是ELISA的一般步骤、试剂及注意事项的详细介绍。
一、ELISA步骤：1.样品制备：首先，需要将待测样品（血清、细胞上清、组织提取物等）制备成特定体积的稀释液，以便进行ELISA实验。
2.涂布：将测定物（抗原或抗体）加入固相（例如，微孔板或磁珠）上，使其与固相表面发生特异性结合。
3.阻断：将非特异性结合位点阻断，以降低假阳性结果。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）和干奶粉等。
4.孵育：将样品（稀释液）加入到涂布的微孔板孔中，与固相上的结合位点结合，并孵育一定时间，促使特异性结合反应进行。
5.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
6.探针反应：加入特定的称量标记的抗体或标记化的抗原，使其与待测样品特异性结合，并与固相上的结合位点结合。
7.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
8.显示：加入染色剂或底物，使其与标记物发生特异性反应，并显示颜色或荧光。
9.终止反应：加入终止液停止底物与染色剂的反应。
10.读板：使用酶标仪或光度计测量吸光度，在特定波长下测量显示产物的光密度，并根据标准曲线或控制组数据计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。
二、常用ELISA试剂：1.涂布缓冲液：主要用来将测定物溶解在其中，涂布在微孔板或磁珠上。
2.试样稀释液：用于制备待测样品的稀释液。
3.标准物：用于制作标准曲线，以确定待测样品中抗原或抗体的浓度。
4.阻断剂：用于封闭非特异性结合位点，以降低假阳性结果。
5.洗涤缓冲液：用于去除孔内非特异性结合物质。
6.探针：用于特定抗体或抗原的检测，通常经过标记，如HRP（辣根过氧化物酶）或荧光染料等。
7.显示试剂：用于显示标记物与底物的特异性反应，如碱性磷酸酶底物或H2O2和TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二唑基）等。
ELISA中常见问题及解决方法!
ELISA中常见问题及解决方法！ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不留意，有可能导致显色不全、花板等结果。
我将操作中各个环节常消失问题的缘由及解决方法总结如下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。
下面分析Elisa试验操作中可能影响结果的缘由，并给出相应的解决方法。
1 选择试剂选择质量优良的检测试剂，严格根据试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。
2 加样可能缘由：1）血清或血浆标本分别不好即进行加样；2）手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特殊是室内温度较高时)；3）加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。
解决方法：①标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必需使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必需马上颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。
②加样后准时放入孵箱。
③加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
④假如采纳AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。
⑤标本较多时，请分批操作。
3 孵育可能缘由：1) 孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；2) 孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔四周，难以清洗彻底。
解决方法：①贴封片或加盖；②按说明步骤严格掌握操作时间。
4 洗板可能缘由：1) 采纳手工洗板,孔与孔之间液体交叉；2) 采纳半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差；3) 反应板过多造成洗板等待时间长。
解决方法：①保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸（选择洁净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干；②合理支配，或多用几台洗板机。
酶联免疫吸附试验(ELISA)的程序精选全文完整版
精选全文完整版酶联免疫吸附试验（ELISA）的程序第一节间接ELISA试验一用可溶性抗原的ELISA：1、纯化抗原：用包被液稀释至1—20ug/ml；2、以50—100ul/孔量加入酶标板孔中；3、置4（度）过夜或37（度）吸附3h；4、PBST洗三次；5、每孔200ulPBS/NCS 4（度）过夜封闭或37（度）封闭3h；6、PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或许（度）保存备用）7、每孔加50—100ul第一抗体，同时设阳性、阴性对照。
若杂交瘤筛选，每孔加杂交瘤培养上清；8、37（度）孵育2h9、PBST洗5次，每次5min10、每孔加50—100ul酶标第二抗体；若杂交瘤筛选，每孔加HRP 标记的抗小鼠（IgG+IgM）抗体；11、37（度）孵育2h12、PBST洗5次，每次数5分钟；13、每孔加OPD 或TMBS底物100ul14、37（度）避光作用；（OPD为10—20）分钟，TMBS为40分钟）；15以50ul2MH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值（OPD底物选用490nm滤光片，TMBS底物选用450nm滤:光片）；16结果判定：（1）P/N≥2.1 为阳性(2) P≥N+3SD 为阳性成功范例:NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测亚类鉴定和鸡白痢检疫等。
二、用全菌抗原的ELISA法（一）GA法1、新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌浓度至1X10（6）个/ml。
注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭活诊断菌液；2、酶标板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1M NaHCO4 95ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小时3、蒸馏水洗5次;4、加细菌悬浮液,50ul/孔;5、37(度)温箱内过液,干燥吸附(20—24h)6、加PBS/NCS 220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封闭；7、PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用；8、以下步骤同一。
（完整版）Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题
（完整版）Elisa常见类型及实验标准操作⽅法与常见问题Elisa常见类型及实验标准操作⽅法与常见问题酶联免疫吸附试验（ELISA）是⼀种实验室常⽤的检测⽅法，⼴泛应⽤于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。
与其他基于抗体的检测⽅法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相⽀持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和⾮特异性相互作⽤的分离，并可通过最终有⾊产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。
ELISA 实验通常以细胞培养上清液、⾎清、⾎浆以及组织裂解物等为样品。
该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作⽤的底物。
根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测⽅法。
该实验可迅速分析⼤量平⾏样品，在基础研究和临床诊断实践中⼴泛使⽤。
⼀、直接ELISA原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进⾏孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要⽤于测定抗原。
优点：操作流程简短，实验步骤少；⽆需使⽤⼆抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。
缺点：实验中的⼀抗需要直接⽤酶标记，成本相对较⾼。
⼆、间接法ELISA原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加⼊特异性⼀抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标⼆抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标⼆抗结合，从⽽间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显⾊。
优点：酶标⼆抗可加强信号，提⾼灵敏度；灵活性更⼤，同⼀酶标⼆抗可应⽤于多种不同的⼀抗；不直标⼀抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使⽤标记抗体更少。
缺点：交叉反应⼏率升⾼。
三、双抗夹⼼法ELISA原理：双抗体夹⼼法适⽤于测定⼆价或⼆价以上的⼤分⼦，但不适⽤于⼩分⼦抗原。
将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。
ELISA实验中常见问题和注意事项
ELISA实验中常见问题和注意事项临床标本的收集和保存用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆）。
本实验室用ELISA测定乙肝两对半，甲肝，戊肝，抗HIV的标本时，在处理和保存方面要考虑以下几个方面：1）要注意避免出现严重溶血及血清中混有红细胞。
当标本出现严重溶血及血清中混有红细胞时，反应孔不易洗净，残留在反应孔内的血红蛋白具有过氧化物酶的活性，显色时可能造成假阳性。
2）标本凝固不全强行离心，造成血清中含有少量的纤维蛋白原，在实验过程中形成纤维蛋白吸附在反应孔孔壁上不易洗掉，易造成假性结果。
3）血清标本可在2～8℃下保存1周。
如血清样本需长时间保存，则需放入-20℃冰柜内冰冻保存。
冰冻保存的血清标本须注意避免反复冻融，标本可能引起假阴性结果。
此外冻融标本的混匀不要进行剧烈振荡，应反复颠倒混匀。
ELISA测定中试剂准备在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，证试剂盒温度要和室温一致。
如果把试剂盒从冰箱拿出来直接做实验会造成一些弱阳性标本的检测出现假阴性。
因为在后面的孵育反应步骤中，造成孵育时间不够。
其次，ELISA实验中洗板用的洗液需每日更换配制，稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。
加血清样本及反应试剂血清样本使用微量加样枪加样。
使用微量加样枪加样必须注意避免以下几点：1）加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。
需匀速加样，吸样时，加样枪需按到第一档，加样时，加样枪需直接按到底。
2）加样应直接加入反应孔底部，加在反应孔孔壁上易溅出会对邻近孔产生污染。
尽量避免出现气泡。
3）反应试剂的加入时先要注意试剂的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。
滴加太快易出现重复滴加或加在两孔之间。
温育的时间与温度温育是ELISA测定中最容易出现问题的步骤。
温育温度应在37℃，水浴。
温育时间应按照试剂说明书上的时间严格执行。
温育实际测定操作中要注意以下几点：1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。
elisa常见实验方法
elisa常见实验方法摘要：1.ELISA实验原理简介2.ELISA实验步骤概述3.常见ELISA实验方法分类4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景5.提高ELISA实验效果的方法6.ELISA实验中常见问题及解决策略正文：ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于生物医学领域，用于检测蛋白质、抗原和抗体等生物分子的方法。
ELISA实验通过特异性抗体与待检测物结合，再通过酶标记的二抗检测结合物，从而实现对目标分子的定量分析。
以下是ELISA常见实验方法的详细介绍。
1.ELISA实验原理简介ELISA实验基于抗原抗体反应原理，将抗原或抗体固定在固相载体上，待检测样品中的目标分子与固定在载体上的抗体结合，再加入酶标记的二抗，与结合在载体上的抗原或抗体发生反应。
最后，通过底物显色反应，根据颜色的深浅判断待测物含量。
2.ELISA实验步骤概述ELISA实验一般分为以下四个步骤：（1）抗原或抗体固定：将抗原或抗体吸附在固相载体（如酶标板）上；（2）样品处理：对待测样品进行适当处理，使其与实验体系相适应；（3）加样：将处理后的样品和酶标记的二抗加入酶标板，incubate；（4）底物显色：加入底物，酶标记的二抗与抗原或抗体结合后，底物被酶催化显色；（5）读数：用酶标仪测定显色程度，换算成待测物浓度。
3.常见ELISA实验方法分类根据实验过程中抗原抗体结合的方式，ELISA实验可分为以下几类：（1）双抗原夹心法：待测物为抗原，实验中使用两种针对抗原不同表位的抗体；（2）竞争法：待测物为抗体，与固定抗原竞争结合酶标抗体；（3）间接法：待测物为抗体，通过酶标记的二抗检测；（4）免疫共沉淀法：利用抗原抗体结合后形成的免疫复合物与底物结合。
4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景（1）双抗原夹心法：优点为特异性高、灵敏度高，适用于抗原含量较低的检测；缺点为操作复杂，易出现交叉反应。
（2）竞争法：优点为操作简便，适用于抗体含量较低的检测；缺点为特异性相对较低，易受其他物质干扰。
酶联免疫吸附试验(ELISA)手工操作注意事项
8 结果判断
• 临床ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定ห้องสมุดไป่ตู้和定量 测定两大类。
• 定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有” 或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示；定 量测定，每批测试均须用一系列不同浓度的标准品在相同 的条件下制作标准曲线。
• （4） 吸取后将移液枪提离液面，停约一秒钟，观察 是否有液滴缓慢地流出。若有流出，说明有漏气现象 （原因有：枪头未上紧；枪头不匹配；移液枪内部气 密性不好）。
• （5） 吸嘴外壁残留液滴可沿壁靠去或用滤纸蘸擦。
5. 放液
• （1） 将吸嘴口贴到容器内壁并保持10-40°倾斜。 • （2） 平稳地把按钮压到一档，停约一秒钟二档，排出
6 显色
• 在以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中，一般显色反应条件 为37℃或室温反应15－30分钟。在一定时间内，阴性孔可 保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。TMB （四甲基联苯胺）经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰， 随即逐渐减弱，至2小时后可完全消退至无色。
• TMB的终止液有多种，酸性终止液（硫酸）会使蓝色转变成 黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。
• 以3000r/min转速离心5－10min，使血清分离完全。
• 若过早离心，分离不全，血清中会残留部分纤维蛋白原，吸 附于反应微孔，并且不易洗去，可与酶标记物非特异性结合， 造成假阳性。
1 标本的收集和保存
• （1）要注意避免出现严重溶血、脂血标本。
• 血红蛋白中铁卟啉具有类似过氧化物酶的活性，因此，在 以辣根过氧化物酶（HRP）为标记酶的ELISA测定中，如 标本溶血，血清中血红蛋白浓度较高，则其很容易在温育 过程中吸附于固相，从而与后面加入的底物反应，从而产 生非特异性显色。
ELISA操作常见问题解决办法
ELISA操作常见问题解决办法ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。
但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。
引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。
下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。
1．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。
因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。
一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。
但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。
2．试剂盒平衡试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温（约25℃），一般需在室温放置20～30分钟以上。
平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。
冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。
3．样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。
4．加样在现在的ELISA商品试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。
注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。
加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。
加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。
溅出会对邻近孔产生污染。
出现气泡则反应液界面有差异。
所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。
5．温育温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。
ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。
elisa操作步骤及注意事项
elisa操作步骤及注意事项以elisa操作步骤及注意事项为题，本文将为大家介绍elisa（酶联免疫吸附测定法）的操作步骤和注意事项。
一、操作步骤1. 准备工作在进行elisa实验前，需要准备好实验所需的试剂和仪器设备，包括酶标板、试剂盒、洗涤缓冲液、底物溶液、阻断缓冲液等。
同时，需要对实验室台面和仪器进行消毒，并佩戴好实验手套和口罩，以确保实验的准确性和安全性。
2. 样品处理将待测样品（如血清、尿液、细胞培养上清液等）和对照样品放置在室温下静置，使其达到室温后，进行稀释处理。
通常情况下，待测样品需要按照一定比例进行稀释，以确保其浓度处于检测范围之内。
3. 酶标板涂覆将酶标板中的亲和素或抗体溶液加入到孔板中，然后将其在4℃下静置过夜，使亲和素或抗体能够均匀地吸附在酶标板上。
4. 标准曲线制备将标准品按照一定比例稀释，以制备出一系列浓度递增的标准品溶液。
然后将这些标准品溶液依次加入已涂覆的酶标板孔中，孔位之间要保持一定的距离。
5. 样品孔加样将样品溶液加入到酶标板的样品孔中，注意每个孔的加样量要保持一致。
为了保证实验的准确性，通常会设置阳性对照孔和阴性对照孔，以验证实验的可靠性。
6. 孔板洗涤使用洗涤缓冲液对酶标板进行洗涤，去除未结合的物质和杂质。
洗涤时要注意洗涤液的温度和洗涤次数，以确保洗涤的充分彻底。
7. 酶标记物加入将酶标记的二抗或酶标记的亲和素加入到酶标板的孔中，使其与靶分子结合。
然后，将酶标板置于恒温摇床上，进行孵育反应，使酶标记物与靶分子发生特异性结合。
8. 反应终止通过加入反应终止溶液，使酶标记物的酶活性停止，并终止酶标记物与靶分子的结合。
终止溶液的选择要根据实验所使用的底物和酶标记物来确定。
9. 读板测定使用酶标仪或多功能酶标仪对酶标板进行测量，测定底物的反应产物的吸光度。
根据吸光度值，可以计算出样品中靶分子的浓度。
二、注意事项1. 严格控制实验条件在进行elisa实验时，需要严格控制实验条件，包括温度、湿度、时间等。
ELISA原理、方法、操作及注意事项
ELISA是一种常用的实验技术，用于检测抗原或抗体的存在。本演示将介绍 ELISA的原理、不同方法、操作步骤，并提供注意事项，用以帮助您更好地理 解和应用ELISA技术。
ELISA概述
ELISA（酶联免疫吸附测定法）是一种常用的生物化学分析方法，通过测定 光学信号来检测抗原或抗体的存在和浓度。
操作流程严格按照规定步骤进行，减少误差。
仪器设备质量
使用可靠的仪器和试剂，确保实验结果的可靠性。
实验记录完整性
详细记录实验步骤和结果，以备后续分析和参考。
反应生成的颜色变化。
7
样品预处理
收集样品，进行预处理，如离心、稀释等。
操作实例简介
具体操作步骤，如添加抗体、洗涤、添加 底物等。
酶标记方法简介
添加酶标记的抗体或试剂，通过酶催化使 信号产生。
数据分析方法简介
根据样品信号强度与标准曲线比对，计算 样品中分析物的浓度。
ELISA检测技术的应用领域
医学
ELISA在临床诊断、病 原体检测和新药开发等 方面有重要应用。
选择性ELISA方法
选择性ELISA是根据特定需求进行的修改，可用于检测特定抗原或抗体，提高 特异性和灵敏度。
ELISA操作步骤简介
1
涂覆准备
2
将样品或标准物质固定在试板上，使其与
试板表面特异性结合。
3
洗涤方法简介
4
通过洗涤去除非特异性结合物，减少背景
信号。
5
信号检测方法简介
6
利用光学或化学方法测量信号强度，如酶
食品安全
ELISA可用于检测食品 中的污染物、过敏原等， 确保食品安全。
环境监测
ELISA常见问题及处理方法4页
ELISA常见问题及处理方法一、概述ELISA试验以灵敏度较高,特异性较好的特点在临床上、兽药残留检测得到了广泛的应用,但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大,如不注意,有可能导致实验失败。
二、样本的处理步骤：采样与样品的制备（样品预处理）提取净化浓缩检测三、样品制备（1）样本采集来后应应注意：1.遵循代表性原则2.除去不可食部分3.防止处理样本时被污染3.如需制成同一样本，应将其混匀后再分次匀将4.匀将后分袋分装(一般用2号自封袋,每袋约30g)5.样品储存在–20℃6.不使用有异味或坏了的样本.四、药物提取用溶剂将待测样品中兽药溶解、分离出来的操作步骤。
根据样本和待测兽药种类，用不同溶剂和方法进行提取。
✶原理：相似相溶。
选择与待测兽药极性相似的溶剂，提取剂沸点应45～80℃，且不能与样本发生作用，毒性低，价格便宜，必须能溶解待测兽药。
对含水量高的样本，一般选与水相混溶的溶剂（乙腈、丙酮等），要求溶剂对样本有较强的渗透能力，以便能将样本中兽药充分提取。
当单一溶剂效果不理想，可选择2种或2种以上不同极性的溶剂，以不同比例配成混合提取剂。
四、提取方法✶①振荡法：将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，使容器内的样品与提取溶剂充分接触，以深入到样本组织内部提取待测组分✶振荡方式：✶振荡器上进行上下、往返式振荡。
手摇式上下振荡✶注：1、在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防止组织凝结成团，不利于提取。
②均质法：用均质机对加提取剂的样本快速均质。
特点是快速、简便。
③超声法：样本加入提取剂，以超声波提取。
④索氏提取：提取效果好，但时间长，干扰物多。
多用于动物样本。
⑤快速混匀法：适用于液体样品。
五、净化将样本中待测兽药与干扰杂质分离的步骤。
原则是尽量完全除掉干扰杂质，而又使待测兽药损失尽量少。
但经过提取的待测组分，提取物中通常含有一些会干扰试剂盒中抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似的杂质，这就导致我们在检测过程中出现假阳性。
ELISA常见问题及措施分析
样本不可使用NaN3。 如有怀疑，可复检。
目测结果正 常，但酶标 仪读值偏低
读取吸光值时使用了错误的 滤光片
TMB为底物时应在450nm波长读取 吸光值，并以650nm作为校正波 长。
标 准 曲 线 不 佳 /重 复 性 不 好
结果描述
可 能的 原 因
建议或预防措施
严格按照说明书标准品配制进行
标准品配制有误
终止后，整
除去残余的缓冲液。
板结果显现 孵育时间过长
严格按照说明书操作。
均一的黄色 或淡黄色； 或标曲有线
酶标记物污染了吸头及盛放 显色剂容器或阳性对照污染 了微孔
吸取不同的试剂时应更换吸头， 配置不同的试剂组分时，应使用 不同的储液器皿。操作时请使用 移液器。
性但背景过
高
检测抗体或Avidin-HRP的浓 检查浓度计算是否正确或进一步
加液时，过多残留于孔壁上
加液时，吸头在不碰到孔底的前 提下尽量沿着孔壁下方加液。
吸取不同的试剂时应更换吸头，
耗材重复使用
配置不同的试剂组分时，应使用
不同的储液器皿。
操作时细心，注意不要触碰底部。
微孔底部被划伤或存在污垢 擦拭酶标板底部，以去除污垢或
指纹。
阈值附近时阴时阳
同一样品做3个复孔，以2个（含 2个以上相同结果为准）。
enzyme-linked immunosorbent assay
酶联免疫吸附测定（ELISA）是指将可溶性的抗原或抗体 结合到固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反 应的定性和定量检测方法。
但在实际操作及分析中，总会出现各种问题，本次就ELISA 常见问题分析汇总，希望对科研菌的实验有所帮助。
加样时交叉污染
ELISA标准操作及技术服务的常见问题分析
ELISA标准操作及技术服务的常见问题分析ELISA标准操作及技术服务的常见问题分析一.ELISA 标准操作要点优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。
ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的本公司要求使用的纯化水电导率小于1.5μs/cm。
1. 标本的采取和保存大部分ELISA 检测均以血清为标本。
血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP 为标记的E LISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。
如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
一般说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清I gG 聚合，使间接法的试剂本底加深。
超过一周测定的需－20℃保存。
冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。
混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。
保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。
抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。
2.加样加样时应将所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。
3.保温在建立ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2 小时，产物的生成可达顶峰。
为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。
应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。
由于公司的试剂盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。
另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。
4.洗涤洗涤在ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。
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Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种实验室常用的检测方法，广泛应用于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。
与其他基于抗体的检测方法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和非特异性相互作用的分离，并可通过最终有色产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。
ELISA 实验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以及组织裂解物等为样品。
该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。
根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测方法。
该实验可迅速分析大量平行样品，在基础研究和临床诊断实践中广泛使用。
一、直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。
缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高。
二、间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗；不直标一抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使用标记抗体更少。
缺点：交叉反应几率升高。
三、双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。
洗涤除去未结合的抗体及杂质。
加入待检样品，保温孵育。
样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
加酶标抗体（检测抗体）保温孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
加底物反应。
双抗原夹心法测抗体的反应模式与测抗原相似，用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。
优点：高特异性，使用的捕获抗体与检测抗体都是检测特异性的；适用于复杂样品，抗原不需要进行纯化即可用于检测；灵活性更大，灵敏度更高，可采用直接法也可采用间接法。
缺点：检测物需要拥有两个以上不同的抗原表位或多个相同的重复表位；不适用于检测小分子物质。
四、竞争法ELISA
原理：竞争法ELISA最为复杂，通常用于检测小分子如半抗原、激素、药物等。
样品中待检游离抗原与固定于固相载体上的抗原一起竞争相同的有限量抗体，当样品中的游离抗原越多，就可结合越多的抗体，而固相抗原只能结合较少的抗体。
反之亦然。
经洗涤去除样品中的抗原与抗体的结合物，只留下固相抗原与抗体的结合物。
显示经计算可得样品中抗原的含量。
竞争法可根据实验设置直接法、间接法或夹心法形式。
常见问题：
Elisa 实验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。
下面一步步分析Elisa试验操作中可能影响结果因素。
Step1: 标本的选择与准备
用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清(浆)，有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。
目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。
对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。
如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。
又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。
再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。
用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面：
(1)要注意避免出现严重溶血。
血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。
(2)样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用;二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。
(3)血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。
样本的长时间保存，应在-70℃以下。
(4)冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。
标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。
此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。
(5)标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。
Step2: 试剂的准备
在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。
因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置30-60分钟，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。
这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。
Step3: 加样
（1）标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟;标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟;若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。
（2）加样后及时放入孵箱。
（3）加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
（4）如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。
（5）标本较多时，请分批操作。
（6）血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。
使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。
加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。
加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。
溅出会对邻近孔产生污染。
出现气泡则反应液界面有差异。
Step4: 孵育
（1）温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。
ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。
温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。
最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。
按照操作说明严格控制孵育时间；
（2）孵育时贴封片或加盖，避免标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁。
Step5：洗板
保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干;反应板过多时，合理安排，或多用几台洗板机，避免等待时间过长。
Step6: 显色
显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用; 加样时保持显色剂不外流。
Step7: 终止
在加终止液时应避免产生气泡，而导致假阳性结果。
Step8: 读板
整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸;尽可能实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。
在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。