各种酶活力测定方法及注意事项

碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。

其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。

以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制：碱性蛋白酶测定方法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法以下是方法碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。

2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。

表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（μg/mL）取 100 μg/mL 酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取水的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。

图 2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。

其 K 值应在 95-100 范围内。

上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。

2.2.6.2 测定方法（1）计算方法X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1）式中，X —样品的酶活力，μ/g；A —样品平行实验的平均吸光度；K —吸光常数；4 —反应试剂的总体积，mL；10—反应时间 10 min，以 1 min 计；n —稀释倍数。

（2）测定方法①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。

②按下列程序操作，进行测定。

于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。

试管A（空试管B（样酶液1.00 mL 酶液1.00 mL预热2 min 预热2 min三氯乙酸2.00干酪素1.00 mL mL混匀混匀保温10 min干酪素1.00 mL 三氯乙酸2.00 mL 混匀混匀10000 r/min10000 r/min 离心2 min离心2 min滤液1.00 mL 滤液1.00 mL加碳酸钠溶液5.00 加碳酸钠溶液mL 5.00 mL加福林试剂1.00 mL 加福林试剂1.00 mL 显色20 min 显色20 min角蛋白酶活力的测定1、角蛋白酶活力测定方法试剂和溶液：a. 硼酸缓冲溶液（pH 10.5）：称取硼酸钠 9.54 g，氢氧化钠 1.6 g，加水至 900 mL，搅拌均匀。

用 1 mol/L 盐酸溶液或 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液调整 pH=10.5±0.05，定容至 1000 mL。

b. 硼酸缓冲溶液（pH 9.5、11.5）：称取硼酸钠 9.54 g，加水至 800 mL，用氢氧化钠溶液调整 pH=9.5±0.05 或 pH=11.5±0.05，定容至 1000 mL。

c. 10%三氯乙酸：10 g 三氯乙酸，加水至 100 mL。

d. 0.5%羊毛角蛋白溶液：取 0.5g 羊毛角蛋白加入 100ml 硼酸缓冲液溶解测定方法：取 1 mL 酶液（0.1 g 酶粉用对应 pH 缓冲液溶解离心，取上清液适当稀释），取 4 支具塞试管中，空白加 1mL 酶液、2 mL 0.5%羊毛角蛋白溶液（pH10.5、硼酸缓冲液溶解）、2 mL 10 %三氯乙酸，对照加入 1ml 酶液和 2ml 角蛋白溶液，在40℃恒温水浴锅中反应1 h 后对照加2 mL 10 %三氯乙酸终止反应，在10000 r/min 离心 10 min，取上清液，过滤，在 280 nm 处测吸光度。

（使用石英比色皿）酶活定义：1 ml/1 g 酶在该反应体系下对照相对于空白样 A280nm 吸光每升高 0.01 为 1 unit（U）。

X=(A280-A0)×100×NN 为稀释倍数胶原蛋白酶活力的测定标曲的绘制取11支试管分别标号，向每支试管中分别加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 m L 的0.75umol/ml 的标准甘氨酸溶液，并用水补足至0.5 mL，各加入0.5 ml乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）充分混合，最后加入0.5m L 茚三酮显色液，充分混合。

用试管盖盖住，在100℃下水浴加热 10 min，冷却放置10min，加入4.5 m L乙醇（60%，v/v）进行稀释，在570nm 下比色。

吸光值与甘氨酸浓度标准曲线10.9 0.8y = 1.2122x + 0.0135 R² = 0.99550.70.60.50.40.30.20.10 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8Gly-umol/mly=1.2122x+0.0135酶活X=55.7359×N×(OD-0.0135)酶活力测定发酵粗酶液12000rpm/min离心10分钟取上清（固体酶粉酶活测量时，取酶粉取0.1 g，加入适当硼酸缓冲液（pH 10.5）溶解并在旋涡混匀器混匀3 m in直至无明显固体团,并用硼酸缓冲液（pH 10.5）适当稀释一定倍数，分别取 0.5 mL稀释后的酶液于 4 支试管中，将所需 I 型胶原和酶液于 37℃下保温五分钟，然后向空白样中加入 0.5 mL 的Ι型胶原（5 mg/mL，底物溶于水中）和 0.5 ml 的TCA，对照样中加入 0.5 ml I 型胶原，混匀，37 ℃，40 min，之后对照中加入 0.5mL 0.4 M 的三氯乙酸终止反应。

取 1 ml 反应后的液体于 12000rpm/min 离心 2min，取上清 0.5 mL，加入 0.5ml 乙酸-乙酸钠缓冲液（2 mol/L，pH 5.4），最后加入 0.5ml 1%的茚三酮显色液，将试管封塞混匀，于100 ℃下水浴加热10 min，冷却10min，加入 4.5 ml60%乙醇稀释于 570nm 以空白为零测定吸收值。

根据甘氨酸标准曲线计算出酶活力大小。

酶活力定义：37 ℃，pH 7.5 条件下，每分钟每毫升发酵液水解胶原产生 1 μg甘氨酸为一个酶活力单位。

（1）三氯乙酸溶液（0.4 mol/L）：准确称取三氯乙酸65.4 g，用水溶解并定容至1000 mL。

（3）氢氧化钠溶液（0.5 mol/L）：称取20 g NaOH，用水溶解并定容至1000 mL。

（4）60%乙醇：量取无水乙醇60 mL 加水定容到100 mL，待用。

（5）Ι型胶原溶液：取500 mg I型胶原溶于100 mL磷酸缓冲液（pH 7.5）中，4 ℃避光保存。

（6）0.75 μmol/mL甘氨酸标准液：称取0.2252 g甘氨酸溶解后定容到100 mL 得到30 umol/ml的甘氨酸溶液，之后取0.5ml加4.5 ml水混匀稀释10倍，再从混匀后的溶液中取3 ml加入9 ml水混匀稀释4倍，得到0.75 umol/ml的甘氨酸标准溶液。

（7）茚三酮显色液：称取0.85 g茚三酮二水与0.15 g还原茚三酮二水溶于90ml乙二醇单甲醚，定容100ml。

（8）2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.4）：82.7 mL2 mol/L乙酸钠与17.3 mL 2 mol/L乙酸混匀。

（9）2 mol/L乙酸钠溶液：称取82 g无水乙酸钠溶于500 mL水中。

（10）2 mol/L乙酸：量取12.01 g冰乙酸加水定容至100 mL。

弹性蛋白酶活力的测定采用Sacher3 方法并参照中国现行药用弹性蛋白酶测定方法进行。

称取10 mg 刚果红-弹性蛋白于试管中，加2 mL pH 值7.4、0.2 mol/L 硼酸缓冲液，取1 mL 适当稀释酶液(固体酶粉酶活测量时，取酶粉取0.5 g，加入10 ml 硼酸缓冲液溶解震荡溶解2 min，12000rpm/min 离心2 min，用硼酸酸缓冲液（pH 7.4）适当稀释一定倍数)于37 ℃下振荡反应20 min，加入pH 值6.0、0.2 mol/L 磷酸钠缓冲液2 mL 终止反应，离心过滤后取上清液测495 nm 光密度，以不加酶液和底物的反应系统为空白。

在此反应条件下溶解1 mg 刚果红-弹性蛋白底物所需的酶量定义为一个弹性蛋白酶活性单位（U）。

参照Sacher 方法绘制弹性蛋白酶标准曲线.y=0.2109x（mg/ml）X=1.1854xODxN（1）0.2M硼酸缓冲液(pH 7.4)：取19.07 g硼砂（Na2B4O7·10H2O, MW 381.37）溶于水定容1 L，配置成A液，取12.37 g硼酸（H3BO3 ,MW 61.83）溶于水定容1 L，配置成B液，取两种液体以A:B=1:9的比例混合并适当调节pH至7.4。

（2）0.2 mol/L 磷酸钠缓冲液（pH 6.0）: 0.2M 磷酸缓冲液（pH 7.5）：取71.63g 十二水磷酸氢二钠溶于水并定容1L 水中，配置成A 液，取7.8 g 二水磷酸二氢钠溶于水并定容于250 ml 水中，配置成B 液，A 液与B 液以比例混合，并用适当的A 液和B 液适当微调pH 至pH 6.0以下说说我在碱性蛋白酶活力测定过程中出现的问题和解决方法首先我在多次测定碱性蛋白酶酶活力的过程中发现样品酶活力差异较大，甚至同一个样品酶活力也有20%-240%的大小差异，这使得我陷入思考，为什么会这样，我经过多次测定酶粉时的碱性蛋白酶活力发现同一个样品在不同稀释倍数下有不同的OD 值，理论上讲同一个样品不管怎么稀释，只要OD 在0.2-0.8 范围内时应该根据酶活力计算公式X=4*A*N*K/10计算的结果应该无显著差异的，但是结果与预料中的不一致，以下是我选取一个碱性蛋白酶样品的酶粉，稀释不同的倍数，呈现不同的OD 值，最后计算的酶活力，根据计算，发现其中的规律。