细胞增殖MTT检测经验总结
MTT实验心得2
MTT实验心得MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。
MTT的原理：活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀。
由于一般介绍园子里已经很多，笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流交流。
1、培养好细胞点板。
养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。
如果知道了细胞的名字，就可以上检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法。
当然可以根据自己实验要求进行修改。
由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。
这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10 ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50 微升的孔比较合适，而点板时没孔需点200 微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）。
这样就OK了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操作。
注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的。
建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它。
点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大。
2、点板布局。
其实这一点很多人不懈一顾。
如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。
因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。
细胞增殖抑制率检测--MTT
细胞增殖抑制率检测--MTT
细胞增殖抑制率检测-- MTT
要点：1、细胞的接种密度为2～5×104/ml，细胞的消化要好，不要形成细胞团；
2、细胞接种时要一边吹打，一边接种；
3、培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为指标检测孔；
4、于检测指标前4小时，加MTT（5mg/ml）；检测前观察结晶形态和大体数量，弃上清（亦有不主张弃上清者，以免损失结晶，个人认为为了尽快溶解结晶，应去上清，可用翻板法，我用枪头吸，未见明显影响，还可离心1000r/min,10分钟后再吸），加无水乙醇（还可用DMSO、酸化异丙醇等），震荡10分钟（个人认为可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；有资料报道可放入孵箱15分钟溶解结晶），完全溶解后用酶标仪检测。
5、要低血清或无血清培养，减少血清的影响，因为血清高容易和MTT反应，也有报道血清和处理因素反应等等；
6、对于连续测数天的情况，可以考虑每天换液，但要注意条件齐平；另外就要注意的就是接种时宁可稀一点不要细胞接种过密！。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告细胞增殖实验是研究肿瘤细胞增殖和药物筛选的重要手段。
目前常见的肿瘤细胞增殖实验包括MTT法、SRB法、CCK-8法和细胞计数法。
本综述将介绍常用的MTT法和SRB法。
一、MTT法MTT法是一种常用的检测细胞增殖和细胞存活率的方法。
其原理是MTT剂通过被细胞还原，形成紫色沉淀，而细胞活性越强，则代谢产物越多，MTT的还原能力也越强，所以其颜色越深。
MTT法的步骤如下：1. 细胞接种：将待检测的细胞分离并接种到96孔板中，对照组和实验组各重复3次，每孔加入100 μl的细胞悬液。
2. 细胞培养：将孔板置于37℃、5% CO2培养箱中，培养24h，待细胞贴附后进入下一步。
3. 加入MTT：将MTT溶液加入孔板中，加入的量为100 μl/孔，最终浓度为0.5mg/ml。
4. 离心：孔板离心5min，去除上清，加入150 μl的DMSO，进行溶解。
5. 检测：将各孔450 nm波长下吸光度值读取，数据处理和结果分析。
MTT法适用于多种肿瘤细胞，操作简便，可用于初筛药物的活性。
然而，MTT法也存在局限性，如MTT还原能力受到某些实验条件影响，如细胞密度、孵育时间、细胞凋亡等，需要注意标准化操作。
二、SRB法SRB法是酸性快速比色法的缩写，它通过酸性溶液中蛋白质的沉淀和染色，反映了细胞的增殖情况。
该方法操作简单，速度快，结果信度较高。
步骤如下：3. 加入SRB：将SRB溶液加入各孔中，保持10 min。
4. 洗涤：将各孔反复洗涤至清晰。
6. 检测：将各孔570 nm波长下吸光度值读取，数据处理和结果分析。
SRB法比较适用于肿瘤细胞形态大而扁平的情况。
此外，SRB法还能够评价细胞的耐药性，并可用于筛选化合物对细胞增殖的抑制率，是一种较为全面的细胞增殖试验方法。
三、结论以上两种实验方法在检测肿瘤细胞增殖及药物筛选中具有重要的应用价值。
在操作上，需要严格地控制实验条件，确保数据的准确性和可靠性。
mtt法检测细胞增殖
MTT法检测细胞增殖前言细胞增殖是生物体生长和发育的基本过程之一，也是许多疾病的病理基础。
因此，准确测定细胞增殖的能力对于生物医学研究具有重要意义。
MTT(Methylthiazolyl tetrazolium)法是目前常用的细胞增殖分析方法之一，能够可靠地简单测定细胞增殖的活性。
本文将介绍MTT法的原理和操作步骤，并对其优缺点进行分析。
MTT法原理MTT法是一种基于细胞代谢活动的间接检测方法。
其基本原理是利用细胞对MTT的还原作用，通过测定产生的紫色产物的吸光度来间接反映细胞增殖的活性。
MTT是一种黄色的可溶性化合物，能够通过细胞内氧化还原酶系统还原为紫色的结晶体—formazan。
被还原的formazan会在细胞内积累，并且随着细胞数量的增加而增加。
在MTT法中，细胞被处理后，MTT溶液被加入到培养基中，经过一段时间的孵育后，细胞会将MTT还原为formazan，形成紫色的晶体。
随后，使用溶解剂溶解晶体，使其可溶于溶液中，最后通过光谱仪测定溶液的吸光度。
在MTT法中，吸光度的值与细胞数量成正比，因此可以通过比较不同处理组细胞的吸光度值来评估细胞增殖能力的差异。
操作步骤以下是使用MTT法检测细胞增殖的基本操作步骤：1.准备细胞培养物：将需要进行细胞增殖检测的细胞培养在含有适当培养基的培养皿中。
确保培养皿的表面充分涂覆了细胞，并且培养皿中的细胞密度适中。
2.处理组织/药物/生物活性物质：根据实验设计的需求，将细胞培养在含有需要测试的药物或生物活性物质的培养基中。
如果是对不同处理组进行比较，需要设置对照组。
3.孵育细胞：将培养皿放入恒温培养箱或细胞培养箱中，以维持适当的温度、湿度和气体环境，使细胞进行增殖。
孵育时间根据实验需要而定，通常为24-72小时。
4.添加MTT溶液：取出培养皿，将预先配好的MTT 溶液均匀地加入到培养基中，确保与细胞充分接触。
MTT 溶液的浓度和加入量可以根据实验要求进行调整。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告5篇
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告5篇篇1一、引言肿瘤细胞增殖实验是研究肿瘤发生、发展及其相关机制的重要手段。
随着科技的进步，体外检测肿瘤细胞增殖的方法逐渐成为研究热点。
本文将对体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法、应用及优缺点进行综述，为相关研究者提供参考。
二、实验方法1. 细胞培养细胞培养是体外检测肿瘤细胞增殖的基础。
研究者需根据实验需求选择合适的细胞系，并掌握细胞培养的基本技术，如细胞的复苏、传代、冻存等。
2. 实验试剂与仪器在进行肿瘤细胞增殖实验时，需要使用一系列的试剂和仪器，如细胞计数试剂、酶标仪、显微镜等。
这些试剂和仪器的选择对实验结果的准确性至关重要。
三、实验技术1. MTT法MTT法是一种常用的检测细胞增殖的方法，其原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原MTT，生成蓝色结晶物并沉积在细胞中，从而反映细胞的增殖情况。
该方法具有操作简便、快速、准确等优点，在肿瘤细胞增殖实验中得到了广泛应用。
2. BrdU法BrdU法是通过检测细胞内BrdU的掺入量来反映细胞的增殖活性。
该方法需要预先在培养基中加入BrdU，然后通过特异性抗体检测BrdU的掺入量。
BrdU法具有较高的灵敏度和特异性，能够更准确地反映细胞的增殖情况。
3. 流式细胞术流式细胞术是一种能够同时检测单个细胞多个参数的技术，可以用于分析细胞的周期、凋亡、增殖等情况。
在肿瘤细胞增殖实验中，流式细胞术可以用于检测细胞的DNA含量、BrdU掺入量等指标，从而更全面地了解细胞的增殖情况。
四、应用及优缺点1. 药物筛选与评价体外检测肿瘤细胞增殖实验可以用于药物的筛选与评价。
通过检测药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，可以评估药物的抗肿瘤活性，为药物的进一步研究和开发提供依据。
2. 肿瘤病理学研究体外检测肿瘤细胞增殖实验还可以用于肿瘤病理学研究。
通过分析肿瘤细胞的增殖特性，可以了解肿瘤的发生、发展及其相关机制，为肿瘤的诊断和治疗提供理论依据。
3. 个体化治疗与预后判断体外检测肿瘤细胞增殖实验在个体化治疗和预后判断中也具有重要价值。
MTT实验心得
MTT（四唑盐）法检测细胞力【实验目的】：检测细胞活力【实验材料】：96孔板，1ML 100ul枪头；MTT配制5MG/ML单细胞悬液；处理条件如各种浓度的化疗药物（根据实验目的自行选择）【实验步骤】1．消化贴壁细胞，制成1x105个/ml 的单细胞悬液（可根据不同细胞的生长情况调整浓度）2．接种：每个浓度梯度至少设3个孔（当然复孔越多越好），每空加细胞悬液80-100μl3．24h细胞贴壁后再加已配置好的各个浓度的ADM20μl，至试验所需的终浓度4．37.00c 5%CO2 100%湿度培育48小时5．加5MG/ML MTT 10μl，培育4小时注意MTT溶液配置好后要避光，不能长期使用。
6．去上清，加DMSO原液100μl，震荡5分钟，室温10分钟，7．A492nm波长测吸光度8．设置空白对照：与实验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照，余步骤同前。
实验结果分析：细胞存活数（%）=实验组光吸收率/对照组光吸收率x100% 【注意事项】1．每次加样时枪不要太打到底，这样会多吸，或者枪头松动，或有气泡，液体会溢出，会影响实验结果。
2．许多化疗药物粉末用PBS往往很难完全溶解，可以经注射器注入生理盐水，充分混匀后。
3. 切记要设置对照【典型举例】以ADM（阿霉素）和CIS（顺铂）对MCF-7，MCF-ADR细胞活力的影响为例：ADM的配置：（1）10mg粉末中加入灭菌注射用水10ml 1mg/ml 的原液10ML（2）取1mg/ml 的原液0.5ml, 加入9.5ml灭菌注射用水配成50μg/ml 液体10ml(3) 取50μg/ml 液体0.5ml加入4.5ml灭菌注射用水配成5μg/ml 液体5ml(4) 取5μg/ml 液体0.5ml加入4.5ml 灭菌注射用水配成0. 5μg/ml 液体5ml(5) 取0. 5μg/ml 液体0. 5ml加入4.5ml灭菌注射用水配成0.0 5μg/ml 液体5ml(6) oμg/ml消化贴壁细胞，制成1x105个/ml 的细胞悬液接种：每个浓度梯度设3个孔，每空加细胞悬液80μl，24h细胞贴壁后再加各个浓度的ADM20μl，至终浓度0, 0.01, 0.1, 1.0, 10 μg/ml .37.00c 5%CO2 100%湿度培育48小时加5MG/ML MTT 10μl，培育4小时去上清，加DMSO原液100μl，震荡5分钟，室温10分钟，A490nm波长测吸光度。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告肿瘤是一类以异常细胞增殖为主要特征的疾病。
准确评估肿瘤细胞增殖对于肿瘤治疗的效果以及疾病的预后具有重要意义。
体外检测肿瘤细胞增殖是一种常用的方法，本文主要对体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法和研究进展进行综述。
一、MTT法MTT法是一种常用的体外检测肿瘤细胞增殖的方法。
该方法是根据细胞线粒体活性的改变来评估细胞增殖的程度。
实验流程主要包括：将细胞悬浮液均匀涂布在培养皿中，待细胞贴附后加入MTT试剂，培养一段时间后将形成的晶体溶解并用酶标仪读取吸光度值。
吸光度值越高，细胞增殖越旺盛。
该方法简单、灵敏度较高，被广泛应用于肿瘤细胞增殖实验中。
二、Clonogenic assayClonogenic assay是一种评估肿瘤细胞增殖潜能的经典方法。
该方法通过培养肿瘤细胞单个细胞或一小群细胞，观察并统计形成的克隆数目来评估细胞增殖的能力。
实验流程主要包括：将肿瘤细胞以适当密度接种在培养皿中，培养一段时间后用甲醛固定，染色后用显微镜观察并计数克隆数量。
克隆数量越多，细胞增殖能力越强。
该方法简便、直观，是评估肿瘤细胞增殖的重要手段之一。
三、Cell proliferation assayCell proliferation assay是一类常用的体外检测肿瘤细胞增殖的方法。
这些方法主要通过检测细胞增殖相关指标来评估细胞增殖的程度，包括细胞数量、细胞代谢活性、DNA合成等。
常用的方法有细胞计数法、脱氧核糖核酸(DNA)含量测定法、流式细胞术等。
这些方法具有高通量、高灵敏度等特点，被广泛应用于肿瘤细胞增殖实验中。
四、组织培养方法组织培养方法是一种用于体外检测肿瘤细胞增殖的重要手段。
该方法直接使用体外培养的肿瘤组织，观察并统计肿瘤细胞的增殖情况。
常见的组织培养方法包括原代细胞培养、血管瘤体外培养等。
这些方法可以更真实地反映肿瘤细胞的增殖状态，但操作复杂、时间长，限制了其在实验中的应用。
体外检测肿瘤细胞增殖是评估肿瘤治疗效果和预后的重要手段之一。
MTT方法总结详解
MTT方法总结详解第一篇：MTT方法总结详解MTT方法总结1.MTT原理MTT比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法，所用的显色剂是一种能接受氢原子的化合物MTT，原理是，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的MTT还原为蓝紫色的结晶formazan(甲瓒）后者的产量与活细胞数成正相关。
formazan可用DMSO、无水乙醇或酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长490nm和570nm处进行比色。
所检测的OD值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。
2.优点（1）有灵敏度高，重复性好，（2）操作简便、经济、快速、易自动化的优点，（3）而且没有3H—TdR掺入试验放射性污染，（4）还可以减少如细胞计数法、软琼脂克隆形成试验中的人为性因素缺点：影响因素多，重复性较差。
MTT有毒性致突变性，操作时应注意防护3.步骤(1)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1604培养液配成单个细胞悬液，以每孔5×103~1×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。
(2)培养细胞；将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及湿度条件下，培养4h以上（至细胞状态稳定）．加药物干预24~48h(培养时间取决于实验目的和要其求)(3)呈色：加MTT时一定要避光，测24h细胞增殖率时，于加药干预20h后，每孔加入MTT 溶液(5mg/mL)20ul，37℃，继续孵育4h；测48h细胞增值率时，于加药干预44h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20uL，继续孵育4h。
终止培养后，对悬浮生长的细胞，需离心,(2000rpm．15min)；对贴壁细胞最好也离心（2000rpm,3min).然后用1mL或3mL注射器小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150uL DMSO振荡10min，使结晶物充分溶解。
(4)比色：选择490nm和570nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结果。
最全MTT实验经验总结
最全MTT实验经验总结做 MTT 走了不少弯路，后来看了很多的资料，再做的时候结果好了很多。
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实验前应明确的问题1. 选择适当的细胞接种浓度。
一般情况下，96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有100000 个细胞。
但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定实验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。
这样，才能保证 MTT 结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。
否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2. 药物浓度的确定。
一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。
根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。
否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。
在不同时间点的测定 OD 值，输入 excel 表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线。
曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
4. 200 ul 的培养液对于 10 的 4～5 次方的增殖期细胞来说，很难维持 68 h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向 G0 期而趋于静止，影响结果，我们是在 48 h 换液的。
MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。
做 MTT 时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致 MTT 比色 OD 值的升高。
5. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。
对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
6. 避免血清干扰。
用含 15% 胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。
由于实验本底增加，会有实验敏感性。
【整理总结】关于MTT实验总结--心血啊!大全[修改版]
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第一篇：【整理总结】关于MTT实验总结--心血啊!大全【整理总结】关于MTT实验总结－－心血啊！MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。
还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
也可以用DMSO来溶解。
MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
MTT步骤如下：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2:培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
注意事项：（1）选择适当得细胞接种浓度。
（2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。
在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。
MTT原理及实验心得
MTT法原理：活细胞线粒体中的脱氢酶能够还原黄色的溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyiterazolium bromide,MTT]为篮紫色的不溶于水的甲瓉（formazan）,甲瓉的多少可通过酶标仪测定其在490nm处的OD值而得知。
因为甲瓉生成量在通常情况下与活细胞数成正比，因此可以通过OD值推测活细胞数目，了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。
其原理是很清楚，但是我是做的海洋微生物抗肿瘤药物筛选，将发酵液作为筛选对象，有抗肿瘤活性的继续做，但是我做了很多样本，用SGC7901肿瘤细胞做筛选，结果用MTT法检测，得到抑制率都是负的％二百多，也就是好像有促进肿瘤细胞生长作用，我不知道为什么？是不是用MTT法检测有什么弊端，请各位大侠讨论一下。
1、可能你的药物有颜色，可以在细胞内沉积，又能被最后的溶剂溶解。
2、你的药液成份和浓度都不清楚，又不能定量，最好能够通过别的途径检测一下你的药液的主要成份和浓度。
或者能够知晓是哪类成份也有帮助。
3、MTT单次的结果可能不是很稳定，但多次结果是可信的。
4、跟操作方法有一定关系，96孔板的最外围36孔只能单加培养液，不能养细胞测OD值，只能使用中间的60孔测OD值，因有边缘效应存在。
5、可以将你的发酵液用膜过滤，分成几种不同粒径的样品，分别冻干，用培养基溶解。
我做过一些蛋白的抗肿瘤筛选，有的蛋白有明显促肿瘤增殖作用。
有的多糖也有促肿瘤生长作用。
所以我认为最关键的是样品的处理问题。
MTT法的操作要比较仔细，测定的细胞抑制率和IC50是可以重复的。
1.我的样品是发酵液，不会有染色，而且是在吸出培养液后在加入新鲜的培养液再加MTT的，所以药物的影响基本可以排除。
2.我的粗发酵液，只是粗筛，没办法弄出它是什么成分，如果弄出成分啦，我就毕业啦。
3.边缘效应不会有，在吸出培养液后在加入新鲜的培养液再加MTT的，所以边缘效应可以排除。
MTT使用讨论总结(附MTS测定方法)
/dxymurong > 复制 > 收藏 | 手机看个人门户登录 | 注册 | 和讯博客 | 和讯首页樱桃红了欢迎来到樱桃园个人门户博客微博相册音乐转帖邮箱朋友圈好友留言进入我的家联系主人发送私信 | 给主人留言 | 送小礼物 | 关注主人 | 加为好友 | 进入Ta的家主人：dxymurong [发送私信] [加为好友] [关注]快速链接[和讯博客][发表文章][博客设置][文章管理]搜索分类友情链接MTT使用讨论总结（附MTS测定方法） [转贴 2005-04-09 16:17:59]字号：大 中 小文章来源: 丁香园一、关于眙盼蓝、MTT、H3测定细胞增殖程度的问题xuweilai近期看文献发现国外一些文献仅采用眙盼蓝计数法测定细胞增殖程度，多本书上明确说明这是一种很不准确的方法，可是文章照样能发在BLOOD等杂志上，对此本人有些想不通。
本实验室也有人据此而仅采用眙盼蓝计数法测定细胞增殖程度，做药物对细胞株生长的影响时，我想细胞增殖程度应该是比较重要的指标，怎可马虎行事。
请高手指点迷津！bengbu_bli 用普通血球计数板计数增殖细胞的数量， 只要检测的细胞样本数量不是非常大，只要能够数得过来，而且一般来讲，都是熟练者计数的话，应该是比MTT法要准确的多。
据了解，国外许多档次不低的杂志都是认可这种经典或传统计数细胞的方法的。
midas丁香园主任是的，只要idea巧妙有创意，而用于证明他们的方法都是次要的！diandian眙盼蓝、MTT确实不是一个好的方法，国外的许多杂志已不太使用，国内还认可的。
关键是整篇文章的思路和结构，好的idea是很重要的。
我的一个师姐的文章就被提出眙盼蓝、MTT的问题，但最后编委认为整篇文章的思路很好，也就不计较眙盼蓝、MTT的问题了。
实属兴运。
杂志Cancer Research Therapywm_ni丁香园主任国内由于实验条件的问题，应用H3的还是不多，而以MTT为主，以我的经验眙盼蓝计数法误差确实很大，所以不知道bengbu_bli的观点源自何处，另外如果有一个好的idea，如果不能用好的方法去证实，实在是一种遗憾，当然发不发还是要看编辑了。
MTT法小结详解
实验结果统计学处理
• 所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分 析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显 著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞 生线，专门公式求IC50（半数抑制浓度 ）。或计算 抑制率。 OD对照组-OD实验组 ×100 % • 细胞死亡率% = OD对照组
4. 每孔加入10ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续 培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小 心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。 6. 每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使 结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸 光值。 7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔 （细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚 砜）
悬浮细胞操作步骤：
• 1）调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 lg/ml，需预试寻找最佳稀释 度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共 100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照。 • 2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 • 3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细 胞推荐使用WST-1，培养4 h后直接测），直接酶联免疫检测仪OD570nm（ 630nm校准）测量各孔的吸光值） • 4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇 床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm 校准）测量各孔的吸光值。 • 5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的 药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
肿瘤细胞增殖是肿瘤发展过程中的重要特征，对于研究肿瘤的生物学特性以及寻找抑制肿瘤细胞增殖的治疗方法具有重要意义。
体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法有多种，本文对其中的几种常见方法进行综述和分析。
一、MTT法
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)法是一种常用的测定细胞活力和细胞增殖的方法。
该方法通过将MTT重链亚甲蓝溶液添加到培养皿中，MTT会被活细胞内还原为紫色的甲蓝晶体。
晶体可被有机溶剂溶解，测定溶液的吸光度即可得到细胞的增殖情况。
二、细胞计数
细胞计数是一种直接测量细胞数目的方法，可以通过显微镜计数室或细胞计数仪来进行。
方法简单、直观，但由于需要高倍显微镜观察和手工计数，准确性较差，且操作繁琐。
三、焦磷酸酶检测
焦磷酸酶检测通过检测细胞中的磷酸化焦磷酸酶来间接估计细胞增殖情况。
细胞中的焦磷酸酶水平与细胞增殖密切相关，因此可以作为评价细胞增殖的指标。
四、流式细胞术
流式细胞术是一种高通量、高灵敏度的细胞分析技术，可以测定细胞免疫表型、细胞周期以及检测细胞增殖。
通过细胞标记物（如细胞融合素、DNA染料等）与流式仪相结合，可以对细胞增殖情况进行定量分析。
选择合适的体外检测肿瘤细胞增殖的方法需要综合考虑实验的目的、所需灵敏度、成本以及实验室的设备和技术水平。
不同的方法可以互补使用，以提高结果的准确性和可靠性。
未来，随着技术的不断进步和发展，体外检测肿瘤细胞增殖的方法将会更加完善、快速和准确。
MTT方法总结详解
MTT方法总结1.MTT原理MTT比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法，所用的显色剂是一种能接受氢原子的化合物MTT，原理是，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的MTT还原为蓝紫色的结晶formazan(甲瓒）后者的产量与活细胞数成正相关。
formazan可用DMSO、无水乙醇或酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长490nm 和570nm处进行比色。
所检测的OD值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。
2.优点（1）有灵敏度高，重复性好，（2）操作简便、经济、快速、易自动化的优点，（3）而且没有3H—TdR掺入试验放射性污染，（4）还可以减少如细胞计数法、软琼脂克隆形成试验中的人为性因素缺点：影响因素多，重复性较差。
MTT有毒性致突变性，操作时应注意防护3.步骤(1)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1604培养液配成单个细胞悬液，以每孔5×103~1×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。
(2)培养细胞；将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及湿度条件下，培养4h以上（至细胞状态稳定）．加药物干预24~48h(培养时间取决于实验目的和要其求)(3)呈色：加MTT时一定要避光，测24h细胞增殖率时，于加药干预20h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20ul，37℃，继续孵育4h；测48h细胞增值率时，于加药干预44h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20uL，继续孵育4h。
终止培养后，对悬浮生长的细胞，需离心,(2000rpm．15min)；对贴壁细胞最好也离心（2000rpm,3min).然后用1mL或3mL注射器小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150uL DMSO振荡10min，使结晶物充分溶解。
(4)比色：选择490nm和570nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结果。
以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线。
mtt实验报告
mtt实验报告MTT实验报告MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性实验中的化合物。
它可以通过颜色反应的方式来检测细胞代谢活性，从而评估细胞的增殖情况和毒性作用。
本实验旨在利用MTT实验方法，研究不同药物对细胞增殖和毒性的影响。
实验方法：1. 细胞培养：选取人类肝癌细胞株HepG2，进行细胞培养，细胞密度控制在5×10^4/ml。
2. 药物处理：将不同浓度的药物溶液加入培养基中，与细胞一起培养。
3. MTT实验：培养一定时间后，加入MTT试剂，使其与细胞代谢产物形成可溶性紫色产物。
4. 溶解产物：去除培养基，加入DMSO将产物溶解。
5. 测定吸光度：用酶标仪测定产物的吸光度，以评估细胞的代谢活性和药物的毒性作用。
实验结果：通过MTT实验，我们发现不同药物对HepG2细胞的影响存在一定差异。
在低浓度下，某些药物能够促进细胞的增殖，而高浓度下则表现出明显的毒性作用。
其中，药物A在低浓度下对细胞的增殖有一定促进作用，但在高浓度下表现出明显的细胞毒性；而药物B则在低浓度下对细胞增殖无明显影响，但在高浓度下能够抑制细胞的增殖。
这些结果为我们进一步研究药物的毒性和治疗效果提供了重要参考。
结论：MTT实验是一种简便、可靠的细胞代谢活性检测方法，能够快速评估药物对细胞增殖和毒性的影响。
通过本次实验，我们发现不同药物在不同浓度下对细胞的影响存在一定差异，这为药物的临床应用提供了重要参考。
希望通过进一步研究，能够发现更多具有治疗潜力的药物，并为临床治疗提供更多选择。
mtt法检测细胞增殖
MTT法检测细胞增殖引言细胞增殖是生物学研究中的重要过程，对于理解细胞生长、组织再生、疾病发展等方面具有重要意义。
因此，准确、快速、可靠地检测细胞增殖的方法至关重要。
其中，MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法被广泛应用于细胞增殖的研究。
MTT法原理MTT法基于细胞代谢的活性形成的彩色产物的检测。
MTT是一种黄色草酰胺化合物，在细胞内受到还原酶酶水解后转化为具有紫色的产物。
细胞的代谢活性越高，产生的紫色产物也就越多。
因此，通过检测紫色产物的形成情况可以间接估计细胞的增殖活性。
MTT法步骤1.培养细胞在实验开始之前，首先需要培养细胞到适当的生长状态。
根据具体实验要求，选择适当的培养基和培养条件。
2.接种细胞将培养好的细胞接种到96孔板或其他合适的细胞培养器皿中。
为了得到准确的结果，每个孔或容器应有足够数量的细胞。
3.处理样品根据实验的需要，处理待测样品。
可以是对照组、实验组或不同浓度/处理时间的样品。
4.加入MTT试剂将MTT试剂溶液加入孔中或培养器皿中。
MTT试剂的浓度和用量应根据实验要求进行优化。
5.生化反应将细胞和MTT试剂一起在恒温振荡器中培养一段时间，以促进MTT的还原反应。
6.溶解产物将产生的紫色产物溶解。
可以使用有机溶剂，如二甲基亚硫酸钠溶液。
7.测量吸光度用酶标仪或分光光度计测量溶液的吸光度。
对照组和实验组应分别测量，并根据测量结果进行数据处理和分析。
MTT法优缺点优点•相对简单易行，不需要复杂的设备和技术。
•操作方便，批量处理大量样品。
•结果可靠，可以定量分析细胞增殖活性。
缺点•MTT法只能反映细胞的代谢活性，不能直接反应细胞数量的变化。
•在某些情况下，MTT法对于检测细胞增殖存在一定的局限性。
结论MTT法是一种常用的测定细胞增殖活性的方法。
它通过测量细胞代谢活性所产生的彩色产物来推断细胞增殖的程度。
MTT原理及实验心得
MTT原理及实验心得MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）是一种常用的细胞代谢活性检测试剂，其原理是通过测量细胞对MTT的还原能力来评估细胞的存活率和代谢活性。
MTT溶液进入细胞内后，被细胞内还原酶（如线粒体呼吸链中的NADH和NADPH）还原为可溶的紫色产物，然后用溶剂将细胞中的紫色产物溶解出来，最后通过测量溶液的吸光度来评估细胞代谢活性。
MTT实验在细胞生物学和药物筛选中广泛应用，在实验中需要注意以下几点：1.细胞密度和培养时间：MTT实验中，细胞的初始密度和培养时间是影响实验结果的重要因素。
一般来说，细胞密度不能过低，否则会导致实验结果的可靠性降低；同时，培养时间也要控制好，细胞培养时间过长可能导致细胞的过度增殖，从而影响细胞的代谢活性。
2.MTT处理的时间和浓度：MTT的处理时间和浓度需要根据实验的需求和细胞的特性来确定。
一般来说，处理时间通常介于1-4小时之间，而处理浓度则需要根据具体细胞的特性来确定。
在实验中，不同的细胞对MTT的还原能力可能会有差异，因此需要进行实验优化和控制。
3.MTT颜色的溶解：MTT的还原产物是紫色的，所以在溶解过程中需要使用适当的溶剂。
常用的溶剂有二甲基亚砜（DMSO），其溶解能力较强，适用于大多数细胞。
在溶解过程中，需要充分摇匀，使细胞内的还原产物完全溶解，以确保实验结果的准确性。
4. 数据的分析：MTT实验得到的结果可以通过测量吸光度来评估细胞的代谢活性，常用的测量波长是570 nm。
一般来说，MTT实验得到的吸光度值越高，代表细胞的代谢活性越强。
然而，由于MTT实验只能评估细胞的整体代谢活性，而不能区分不同细胞群体中的代谢活性差异，因此在实验中需要结合其他方法来进一步分析数据。
在进行MTT实验的过程中，需要注意以下几点心得：1.优化实验条件：MTT实验的结果受到实验条件的影响很大，包括细胞密度、培养时间、MTT处理时间和浓度等。
MTT实验步骤及其心得
MTT实验铺板-----换培养基，加药------24h以后加mtt-----4h以后弃上清，加DMSO----测od记得做复孔和对照组。
（下文提到的打到底指的是抢按到第二档）1.铺96孔板1.细胞处理先将培养好的细胞弃去培养基，加些许（2ml）PBS洗洗，再弃去；再加入2ml胰酶消化，适当时间（细胞可被拍打，我基本是显微镜观察很多掉下来了就终止消化）加入两倍胰酶量的培养基进行终止消化，吹打，使细胞全部进入液体中，再离心，（1050-1200rpm,5min即可）；离心后弃上清，加入2ml培养基重悬，（吹打30下，不要太猛烈，不要打出气泡）。
2.细胞计数我是先留一部分继续培养，具体量具体分析，然后剩下的进行细胞计数，（可以先加个1-2ml培养基稀释一下，不然细胞密度太大计数不准，太稀也会不准）。
每个孔铺100ul，细胞量在3000-5000个，所有我们加的细胞液的浓度在30000-50000个/毫升。
用电脑细胞计数以后进行相应的计算，一个孔100ul，我们会多算一点，因为用排枪加要保证最后一次加时排枪也能吸够，（一个96孔板我们只铺中间，外围一圈加灭菌水，让细胞所处的环境一致。
）（细胞计数时一定要混匀）3.细胞铺板用培养基稀释完以后，混匀，有人用排枪打一百遍= =crazy。
用排枪进行铺板，每次加前都得用排枪混匀，加时记得贴着底面和侧面的交界处加，（这养排枪好控制一些）。
如果一次打到底那就全部打到底，一次没加到底，之后都不要加到底，要保证每个孔一致，铺完以后要摇匀，不停地来回摩擦，多几次就好了（这里我觉得还挺难混匀的）。
大概16-24h以后可以加药。
（我是次日差不多时间回来加药）2.配药（配药基本用DMSO配制）在这空余期间要配药，先用药物粉末配成一个大浓度，好像叫母浓度。
单位为mM，具体数值要根据你所需要的终浓度来配制（一般都是从大浓度配到小浓度，这样稀释下来的，再配小浓度之前，一定要将大浓度涡旋混匀在小小的离心一下，不然会很不准！切记切记）。
MTT实验跟踪总结
MTT实验MTT实验第一阶段细胞培养：细胞传代与冻存…（此处略，苹果你已会！）MTT实验第二阶段（自己总结）细胞种板：往96孔板中接种适宜数量的细胞，并保证细胞在96孔板小孔中均匀分布，正常生长，是MTT实验成功的首要条件。
主要步骤：（1）.细胞生长：保证细胞处于对数生长期，简而言之就是将已基本铺满培养瓶底的细胞进行消化，但不传代，就是将旧的培养基换掉，让贴壁的细胞悬浮，并培养一天。
此时细胞处于对数生长期，细胞活力最好，有利于MTT实验的结果。
（2）.细胞消化：将昨天的细胞吸去旧的培养基（将死细胞吸走，可用过滤灭菌的PBS 溶液轻轻冲洗细胞），加入胰酶消化，随后加入适宜培养基（不宜过多，勿将细胞稀释的过稀，达不到种板所需的细胞浓度要求）。
切记利用吹打管将细胞吹打均匀（大量细胞会聚集在一起，细胞分散不均，吹打不匀会影响细胞计数的准确性及随后种板的均一性）；但吹打过猛过多也会影响细胞活力。
（3）.细胞计数：计数之前，应用75%酒精将计数器其载玻片擦拭干净，以免上面残留杂质影响细胞计数。
取一小滴（估计20ul左右）吹打均匀的细胞培养液沿细胞计数器上端凹槽轻轻缓慢打出滴下，此时小液滴会自动（虹吸原理）铺满细胞计算器的上部小方块（如图1）；将细胞计算器放置于显微镜下观察计数，找到左上、左下、右上、右下各4块16格的区域（如图2），数下各块区域的细胞数目，并记录数据（计数原则：当有细胞压16格外线时，记上不记下，记左不记右）。
得到细胞浓度。
计算公式为：细胞浓度=[（A1+A2+A3+A4）/4]*104/ml（4）.细胞稀释：就是将细胞稀释到接种于96孔板时细胞接种数目浓度。
每孔加入200ul，细胞数目（5000左右，个人认为）。
在稀释细胞是既要考虑接种浓度，也要考虑接种总共所需的细胞培养液体积（避免细胞浓度适宜，但体积不够接种于所需加样的小孔）（5）.细胞加样：每次加样前需要将细胞培养液振荡，加几孔最好吹打一下细胞培养液（防止有的细胞沉降），目的是将细胞混合均匀，保证种板的均一性。
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细胞增殖检测：MTT实验经验总结
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。
还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
也可以用DMSO来溶解。
MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
一、步骤
1、接种细胞
用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。
2、培养细胞
同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3、呈色
培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
4、比色
选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
二、注意事项
1、选择适当得细胞接种浓度。
2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。
在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。
其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。
MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，
IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。
把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。
要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！
三、举例
各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。
代入计算公式：
Pm=0.95
Pn=0.06
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*（3.1-（3-0.95-0.06）/4）=-3.6025
IC50=0.00025
有一个公式可供参考；
lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）
Xm：lg 最大剂量
I：lg（最大剂量/相临剂量）
P：阳性反应率之和
Pm：最大阳性反应率
Pn：最小阳性反应率
抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值
公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率
例：
用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定
一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。
一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。
我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。
一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比较明显。
MTT法心得
MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。
一、MTT的原理
活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀。
由于一般介绍园子里已经很多，笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流交流。
二、MTT法检测细胞增殖实验的注意事项
1、培养好细胞点板
养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。
如果知道了细胞的名字，就可以上检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法。
当然可以根据自己实验要求进行修改。
由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：
自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。
这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50微升的孔比较合适，而点板时没孔需点200 微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）。
这样就OK 了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操作。
注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的。
建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它。
点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大！
2、点板布局
其实这一点很多人不懈一顾。
如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。
因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为%26ldquo;边缘效应%26rdquo;这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。
3、加MTT
如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10），如果你没有把握，建议在加MTT前换一次液；如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的。
4、加入MTT后的反应
时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO。
为了将沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min。
提醒：如果你的细胞贴壁不好，此时的沉淀在弃去液体时易丢失，因此贴壁不好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体。
关于DMSO的量，每孔的体积有点儿差异不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了。
至于DMSO的体积差异不同为什么不影响检测值已经被数学证明了，在此我不多说，如果有人不明白我再证明给他看。
当然为了养成良好的实验习惯，DMSO的体积还是一致的好。
5、检测MTT
还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大细说波长检测就是了，最大波长，大概在550nm附近，必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。
6、吸收值分析
在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。
这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。
7、建议
如果你觉得MTT中出现的问题不好解决，那么建议你做CCK-8实验，原理与MTT相似，但操作上简化些，当然，费用也稍微高一些。