7细菌的革兰氏染色 (1)
革兰氏染色(1)
菌种鉴定
菌种获取
分离鉴定 保存复壮 革 兰 பைடு நூலகம் 染 色
Gram与革兰氏染色：
革兰氏染色法（Gram stain）是细菌学中广泛使用 的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家Hans Christain Gram创立并以其名字命名的。 Gram在对死于 肺炎的患者肺部组织进行检查时发现某些细菌对特定的染 料有很高的亲和力。他的染色方法是：首先采用苯胺-结 晶紫染液进行初然，然后用卢戈式碘液媒染，最后用乙醇 脱色。经过这样的染色后，发现肺炎球菌保持蓝紫色，肺 部组织背景为浅黄色，达到了将细菌与被感染的肺部组织 区分开的目的。几年以后，德国病理学家Carl weigert （1845-1904）在Gram染色方法基础上加上番红复染， 使其成为微生物学研究领域最常用的染色方法之一。
染色结果
革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。 其中变形杆菌被染成红色为阴性菌，四联球菌被染成紫 色为阳性菌。
变 形 杆 菌
四 联 球 菌
在实验中经常会出现假阳性和假阴性的结果
影响实验成功的因素：
涂片过厚 结晶紫染色过度 导致脱色不完全 （假阳性）
细胞固定过度 细胞培养 时间太长
造成细胞壁通透性的改变 （假阴性）
因此，在实验过程中应注意：
• 选择活跃生长期菌种染色
• 涂片不宜过厚
• 染色及脱色时间得当
实验报告
1》结果
（1）绘出油镜下观察的图像 （2）填表
菌名 大肠杆菌 四联球菌 菌体颜色 细菌形态 结果（G+ G- ）
思考题：
现有一株未知菌，个体明显大于大肠杆菌 请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴 性，如何确定你的染色结果的正确性？
微生物学实验细菌的简单染色和革兰氏染色(共7张PPT)
二、实验原理
1、细菌的简染色原理
①细菌菌体微小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须通过染色来增加菌体的显示力， 从而更清楚地观察到其形态和结构。 ②在碱性、中性或弱酸性溶液中，细菌菌体通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染 色局部带正电荷〔酸性染料的染色局部带负电荷〕，因此，碱性染料很容易与菌体结合而是菌 体着色。
2、细菌革兰氏染色的原理
G+菌和G-菌的细胞壁结构和组成有较大的区别。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小， 通透性降低，结晶紫-碘复合物被滞留在细胞内，因此细菌仍保存初染时的颜色，经番红复染后呈蓝紫 色。 G-菌细胞壁的外膜层富含类脂，而且其肽聚糖层次薄、交联度低；乙醇脱色时，细胞壁因类脂被 溶解而出现较大缝隙，使得菌体内的结晶紫-碘复合物较易渗出，而使菌体变成无色，再经番红 复染就成为红色。
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细菌的革兰氏染色法
细菌的革兰氏染色法细菌的革兰氏染色法实验二细菌的革兰氏染色法学习细菌的革兰氏染色原理和方法。
单染色法：只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。
复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。
常用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。
革兰氏染色机制：由于G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质，增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。
而G＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（24h培养物）、革兰氏染色液一套3. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
4. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。
5. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15-20秒，后立即用流水冲洗。
6. 复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。
7. 镜检：观察染色结果并绘图。
记录所观察到的两种菌革兰氏染色颜色的差别，并绘图。
如图所示，被染为紫色的部分即为金黄色葡萄球菌，红色部分即为大肠杆菌。
六、问题与讨论要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？哪一步是关键？Why?按照操作顺序来看1、首先，必须强调的是实验过程中全程的无菌操作：玻片的消毒、接种环的杀菌以及实验所用材料试管的无菌使用；2、其次，是金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌的刮取过程中，它们的量一定要适中，以免过多影响后期观察结果；3、再者，涂片操作结束后，通过酒精灯的烘烤将细菌固定，要注意控制烘干的程度，防止细菌全被烧死；4、接下来的染色过程中，注意各染色剂染色的时间长度，尤其是95%乙醇脱色的时长，18秒为适宜时长；5、最后，就是吸干水分，注意油镜的使用，先在低倍镜下找视野，再转成高倍镜、油镜。
实验一 细菌的革兰氏染色
实验一细菌的革兰氏染色实验一细菌的革兰氏染色实验一_细菌的革兰氏染色实验一细菌的革兰氏染色生物科学贺冰冰[1**********]5周二9、0节1自学显微镜油镜的采用方法2学习微生物的无菌操作技术3自学细菌的革兰氏染色法1显微镜及油镜物镜的使用原理1)油镜头的标志油镜头上常刻有oi或hi字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记。
在低倍物镜、高被物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径最大，而工作距离最短。
2)显微镜的分辨率显微镜性能主要就是看看它的分辨率的大小，然后看看它的总压缩倍数。
分瓣率是所指显微镜能够辨别出来物体两点间最轻距离（d）的能力。
d值愈小说明分辨率愈低。
d值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（na）成反比：d=λ/2na2细菌的革兰氏染色原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家c.gram创立的。
作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色的基本步骤就是：先用初染剂结晶紫展开染色，再用碘液媒染，然后用乙醇脱色，最后里韦县染剂番红复染。
革兰氏染色法可以将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（g+）和革兰氏阴性菌（g－）两大类.g－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。
g+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
1菌种：培育24h的枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆营养琼脂菌斜面培育物。
2染色液和试剂：生理盐水、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红为丛藓科扭口藓染液,香柏油，显微镜冲洗液.3器材：酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。
1涂片:挑一整洁载玻片,中央几滴一小几滴生理盐水,无菌操作取菌无菌操作(快):在酒精灯上灼烧接种环(注意手势)---松动试管帽---取下试管帽---灼烧管口---在火焰旁接种环通过火焰进入菌种管---接种环在管壁冷却---挑取菌少许---退出---灼烧管口---盖帽---涂片(调匀涂成薄膜)---灼烧接种环.2潮湿:室温自然肥干活3固定:手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）.4染色:初染(加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,自来水水洗)---媒染(加碘液冲回去残水,并全面覆盖一分钟,水洗)---脱色(将水打翻净,方体白背景,用95%酒精几滴洗至流入的酒精不发生紫色时年才,约20-30秒,立即用水冲净酒精)---复染(用蕃红液染2-3分钟,水洗)5干燥:室温凉干或吹风机吹干6镜检:先低倍观测，再高倍观测，并找到适度的视野后，将高倍镜办理手续，在涂片上有香柏油，油观测细菌的形态。
实验1-细菌的革兰氏染色
环境微生物学实验(参见课本P388-392)实验1 细菌的革兰氏染色一.实验目的(1)了解细菌的涂片和染色在微生物学试验中的重要性。
(2)掌握革兰氏染色法的基本操作技术。
二.实验材料(1)器皿：显微镜、接种环、载玻片、酒精灯。
(2)试剂：草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、95%乙醇、5g/L沙皇染色液。
(3)材料：常见菌种。
三.实验内容各种细菌经革兰氏染色法染色后，能区分成两大类，一类最终染成紫色，称革兰氏阳性细菌（Gram positive bacteria,G+）；另一类被染成红色，称革兰氏阴性细菌（Gram negative bacteria,G-）。
其过程如下：(1)涂片、固定(干燥)取干净的载玻片于试验台上，在正面边角作几号，并滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，灼烧接种环，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过多。
干燥过程最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，也可在微小火焰上方烘干。
烘干后再在火焰上方快速通过3~4次，使菌体完全固定在载玻片上。
但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。
(2)初染滴加草酸铵结晶紫染色液1―2min,水洗。
(3)媒染滴加革兰氏碘液，染1-2min,水洗。
(4)脱色滴加体积分数为95%的乙醇，约45s后即水洗；或滴加体积分数为95%的乙醇后将玻片摇晃几下即倾去乙醇，如此重复2-3次后即水洗。
(5)复染滴加沙黄液（番红），染2-3min,水洗并使之干燥。
(6)镜检按显微镜的操作步骤观察菌体形态，及时记录。
根据呈现的颜色判断该菌属是G+还是G-细菌。
观察时先用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察。
四.注意事项（1）涂片所用载玻片要洁净无油污迹，否则影响涂片。
（2）挑菌量应少些，涂片宜薄，过厚重叠的菌体则不易观察清楚。
（3）染色过程中勿使染色液干涸。
用水冲洗后，应甩去玻片上的残水以免染色液被稀释而影响染色效果。
（4）革兰氏染色成败的关键是脱色时间是否合适，如脱色过度，革兰氏阳性细菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性细菌。
实验1(实验二：细菌的革兰氏染色)实验报告
实验二细菌的革兰氏染色一、目的与要求了解革兰氏染色的原理，掌握革兰氏染色的主要操作步骤，学会革兰氏染色的方法。
二、实验原理革兰氏染色法能将细菌分成两大类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
在用乙醇进行脱色时，两种菌的细胞壁结构不同，阳性菌细胞壁为网状结构，比较厚，结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，而阴性菌细胞壁比较薄，颜色更容易洗脱出来，所以最终革兰氏阴性菌为红色，阳性菌为紫色。
三、实验材料菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
染色液：草酸铵结晶紫染液、路戈氏碘液、95%酒精、番红染液。
器皿及材料：洁净载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、酒精灯、接种环、镊子、无菌水、洗瓶、染色盘、载玻片架、记号笔、75%消毒酒精瓶、废玻片缸、火柴等。
仪器：显微镜。
四、实验方法与步骤1.染色步骤：（1）制片：接种环蘸取细菌液置于载玻片，酒精灯外焰加热玻片进行细菌固定。
（2）初染：添加结晶紫染色，1min后倾去染色液，蒸馏水冲洗至无色。
（3）媒染：吸干残留蒸馏水后，加入一滴碘液，作用1min，水洗。
（4）脱色：吸干残液后，加入95%酒精进行脱色，30s后水洗。
（5）复染：吸干残液后，用番红液复染，1min后，水洗。
（6）镜检：吸干残液后，低倍镜寻找目标物体，再用高倍镜放大目标物，目标视野添加香柏油进行观察。
2.平板划线（1）左手中指、无名指和小拇指托住无菌平皿。
（2）盖子用食指和拇指掰开，右手持接种环进行第一区划线。
（3）酒精灯灼烧接种环至通红，晾凉后进行第二区划线（4）重复（3）进行第三、四区划线（5）将平皿置于适宜温度的培养箱培养过夜。
五、实验结果将显微镜下观察到的2个菌种的革兰氏染色结果填于下表中，并描述菌体的颜色、形态、排列方式。
菌种名称大肠杆菌枯草芽孢杆菌菌体形态图菌体颜色紫色红色菌体形态圆形椭圆形菌体排列方式并列分散结论(G+或G-) G+G-。
细菌的革兰氏染色
实验内容
•对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡 萄球菌分别进行革兰氏染色。
•对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合涂片进 行革兰氏染色。
步骤
•经碱性染料结晶紫染色 •经碘液媒染 •用酒精脱色 ✓有的细菌紫色不被脱去——（G+）， ✓有的可被脱去——（G-）
• 脱色后再用一种红色染料，如碱性番红等 进行复染。
•阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同 pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料
较多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所 以染色时的条件要严格控制。
方法与步骤
•涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫染色 （1min）→水洗→路哥氏碘液媒染 （1min）→水洗→95%乙醇脱色（30s） →水洗→番红复染（1min）→水洗→干 燥→镜检。
固定
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖菌膜1分 钟，对结晶紫染色进行巩固，之后用蒸 馏水对其进行冲洗，至无颜色流出为止。
脱色
将玻片倾斜，用滴管吸95%的酒精进行 冲洗脱色30秒，立即用蒸馏水冲洗。
复染
用沙皇复染液对其进行复染1分钟，用蒸 馏水冲洗。
镜检
用滤纸将水吸干，滴1滴香柏油在菌膜中 央，用油镜观察。
• 阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。
• 有芽孢的杆菌和绝大多数球菌，以及所有 的放线菌和真菌都成革兰氏正反应（G+）
• 弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆 菌都成负反应（G-）
•革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组 成和生理性质上有很多差别，染色反应 不一样。
•革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质 镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫 的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌 复合物结合程度低，吸附染料差，易脱 色，这是染色反应的主要依据。
制片
实验细菌的革兰氏染色
• 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
• 它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
• 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌 的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色 反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示； 染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性 细菌，用G-表示。 • 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细 胞壁的成分和结构不同而造成的。
（二）细菌细胞的革兰氏染色
1．涂片：将培养24小时的枯草芽孢杆
球菌、大肠杆菌和未知菌分别作涂片
（注意涂片切不可过于浓），干燥、
固定。固定时通过火焰1～2次即可，
不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2．染色
（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， 水洗。 （2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分 钟，水洗。 （3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白 背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不 出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用 水冲净酒精。 （4）复染用番红液染1～2分钟，水洗。
4、染色：放标本于水平位置，分别滴加染色 液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染 色液而定。结晶紫染色液染2—3分钟，石 炭酸复红染色液约染1—2分钟。
5、水洗： 染色时间到后，用自来水冲洗， 直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流 不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避 免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干 或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油 镜下观察。
三、实验器材
• 1、菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆 菌,未知菌； • 2、试剂：草酸铵结晶紫，番红水 溶液，碘液，95%乙醇， • 3、仪器：显微镜，载玻片等。
四、实验步骤
（一）细菌细胞的简单染色 1、涂片 ：取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理 盐水于载玻片中央，用无菌操作挑取大肠杆菌和 枯草芽孢杆菌于载玻片的水滴中，调匀并涂成薄 膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。 2、干燥 ： 室温中自然干燥。 3、固定： 涂片面向上，于火焰上通过2—3次，使 细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱 落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色
蒸馏水； 草酸铵结晶紫染液 ；卢戈氏碘液
95%乙醇； 番红复染液；香柏油；二甲苯 光学显微镜
实验方法
滴水 取菌 涂片 自然干燥 火焰固定
结晶紫染色1分钟 乙醇脱色 （20~30秒） 水洗 碘液1分钟
水洗
水洗
番红1分钟
水洗
干燥
镜检 （油镜）
革兰氏染色操作步骤
E.coli
混合菌
S. aureus
涂片方法示意图
n=1.515 a 空气n=1
λ 分辨率 D= —— 2NA a 数值孔径 NA＝n×sin— 2
电源
电源
显微镜油镜的使用与保护
1.
2.
3.
开显微镜电源开关。 调节显微镜光源。 先用低倍镜、高倍镜查找标本视野，下降载物台约2cm ， 加香柏油一滴于标本的待检部位，换用油镜观察。 换用油镜后，眼睛从侧面注视油镜头，缓慢上升载物台至 油圈不再扩大为止，此时镜头几乎与装片接触，但不可压 及装片。 观察标本时，双眼同时挣开，左眼观察，右眼画图。 油镜用毕，转动粗调将载物台下降，取下标本，用擦镜纸 沾少许二甲苯将镜头擦净，然后再用擦镜纸擦去二甲苯。 使各部分还原，物镜镜头呈八字形，光源强度调至最暗， 关闭电源，罩上防尘罩，收拾干净台面。
实验目的
实验原理
微生物学实验-1
实验材料
实验方法 实验结果 注意事项 实验报告
实验一 细菌的革兰氏染色
思考题
实验目的
1. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌 分类鉴定中的重要性。 2. 学习并掌握革兰氏染色技术，进一步 熟练光学显微镜油镜的使用技术。
实验原理
革兰氏染色法（Gram staining） 是微生物学中常用的一种染 色方法，该染色法由丹麦医 生（Christian Gram）于1884 年创立，故名。
细菌革兰氏染色PPT课件
• 实验原理
革兰氏阴性菌细胞壁结构图
2021/3/12
而革兰氏染色阴性 细菌肽聚糖层很薄，含 量少，脂肪含量高，经 乙醇处理后部分细胞壁 脂类可能被溶解并改变 其组织状态，细胞壁孔 径变大或通透性增加， 不能阻止溶剂透入，酒 精将结晶紫与碘的复合 物洗脱，细菌被脱色， 经复染后染成红色，
7
• 实验原理
3
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定
的重要性状。它是1884年由丹麦医师 Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且 还可将所有细菌区分为两大类：染色反 应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用 G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏 阴性细菌，用G-表示。革兰氏染色是细 菌学上最常用的鉴别染色法。
8
• 革兰氏染液
1、碱性染料 （美蓝、碱性复红、结晶紫 ） 2、媒染剂 （碘液 ） 3、脱色剂 （95%的乙醇） 4、复染液 （复红溶液、番红溶液、沙 黄溶液）
2021/3/12
9
• 染色程序
大肠 涂片: 液体培养基、固体培养基
金葡
干燥：自然干燥。
干燥
固定：酒精灯下固定3-4次。 （杀死细菌、粘附、改变通透性）
2021/3/12
4
• 实验材料
1.活材料：培养18-24h的大肠杆菌
2.染色液和试剂：结晶紫、卢哥氏碘液、 95%酒精、复红、二甲苯、香柏油。
2021/3/12
3.器材：无菌水、废液缸、洗瓶、载 玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、 显微镜。
5
• 实验原理
革兰氏阳性菌细胞壁结构图
2021/3/12
革兰氏染色阳性 细菌肽聚糖层厚， 含量多，经乙醇处 理后使之发生脱水 作用而使孔径缩小， 结晶紫与碘的复合 物保留在细胞内而 不被脱色，复染后 不着色，不留结晶 紫的颜色；
-细菌的革兰氏染色观察ppt课件
结晶紫初染2min
碘液媒染1min
细水冲洗
细水冲洗 蕃红复染 1~2min
95%酒精脱色 20s
油镜操作规程
1. 先用低倍镜和高倍镜观察涂片，待看到目的物后，将其移到 视野中央。 2. 在涂片上滴一滴香柏油，转动换转器使油镜针对通光孔。 3. 使油镜与香柏油接触，这时油镜头几乎与载玻片相接触，切 记不能使用粗调，以免压碎载玻片。 4. 用细调旋钮慢慢提升镜头高度，直至物像清晰。切勿拧反方 向。 5. 观察完毕后，使镜筒远离载物台。取下载玻片。用擦镜纸擦 去镜头上的香柏油：先用干的擦镜纸擦1～2次，把大部分油去 掉，再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦2次，最后再用干擦镜纸擦1次。 擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。擦拭要细 心，动作要轻 。
（三）革兰氏染色 革兰氏染色法于1884年由丹麦医生Gram创立，是延用
至今的经典染色法。 经革兰氏染色后可以把全部细菌分为G+和G-两大类。
染色机制：与细菌细胞壁的结构和组成有很大关系。 G+细菌：肽聚糖层厚，含量多，经乙醇处理后使之发 生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细 胞内而不被脱色，复染后不着色，保持结晶紫的颜色； G-细菌：肽聚糖层很薄，含量少，脂肪含量高，经乙醇 处理后部分细胞壁脂类可能被溶解并改变其组织状态，细 胞壁孔径变大或通透性增加，不能阻止溶剂透入，酒精将 结晶紫与碘的复合物洗脱，细菌被脱色，经复染后染成红 色。
微生物学基础实验
细菌的染色观察
微生物(Microorganism) 形体微小、结构简
单，须借助于光学显微镜或电子显微镜进行观
察。
病毒(包括噬菌体)； →非细胞型微生物
细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣
细菌的简单染色(Simple stain)和革兰氏染色(Gram stain)(1
细菌的简单染色（Simple stain）和革兰氏染色（Gram stain）（1虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。
由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。
当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。
而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其他的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。
一、目的要求1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。
2．巩固显微镜的使用方法。
二、基本原理1.简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。
在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。
碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。
例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。
常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。
细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。
2.革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
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微生物实验报告
细菌的革兰氏染色及形态观察
一、目的要求：
1、熟悉光学显微镜的使用方法。
2、掌握革兰氏染色法。
3、掌握大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的染色结果和形态特征
二、器材和器皿：
1、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌
2、革兰氏染色液、香柏油、二甲苯
3、显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环等
三、实验原理：
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram 创立。
未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别很小，在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
革兰氏染色属复染法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。
四、实验步骤：
1、取载玻片用纱布擦干，涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2、涂片：
液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。
4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
5、染色：在菌膜上滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
6、水洗：用蒸馏水轻轻冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。
简单染色结束可观察细胞形态。
7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。
8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。
9、复染：滴加蕃红复染约2min，水洗。
至此，革兰氏染色结束。
五、实验现象：
1、大肠杆菌：显微镜下革兰氏染色后大肠杆菌呈现红色，属于阴性菌。
两端钝圆的短小杆菌，周生鞭毛，无芽孢，能运动。
2、枯草芽孢杆菌：显微镜下革兰氏染色后枯草芽孢杆菌呈现紫色，属于阳性菌。
椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，无荚膜，周生鞭毛，能运动。
3、金黄色葡萄球菌：显微镜下革兰氏染色后金黄色葡萄球菌呈现紫色，属于阳性菌,排列葡萄球状,无芽胞,无荚膜。
六、思考题：
1、用油镜观察标本时应注意哪些问题？
答：（1）油不要滴太多
（2）在调节焦距的时候要特别注意与载玻片之间的距离不要弄坏工具
（3）调节时应该从下往上调节
(4)在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。
（5）用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。
如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。
在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。
（6）油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。
2、哪些因素会影响革兰氏染色结果的正确性？
答：菌龄、涂片厚薄均匀度、媒染时间、乙醇脱色程度，老化的细菌容易产生假阴性。
（2）酒精脱色时间过短造成假阳性，时间过长造成加阴性
3、在实验报告上画出在显微镜下观察到的三种细菌的形态结构。
姓名：黄鹏飞
班级：环境14325班
时间：2015.11.10。