流式细胞术免疫分型基础
流式细胞术及其应用(1)
血小板检测指标：
质膜糖蛋白：CD41/CD61（gpⅡb/Ⅲa）、
CD42b(GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ)
颗粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP。
活化：gpⅡb/Ⅲa复合物—活化早期标志物
CD62P—活化后期的表面标志
血小ห้องสมุดไป่ตู้抗体（PAIgG）。
网织血小板计数：常用染料为TO。
应用 血小板无力症诊断：
而现代流式细胞术，更是由于结合 了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定 量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、 临床医学、药物学等众多研究领域的应 用将会越来越广泛。
五、流式样品的制备中应注意的几个问题
㈠荧光素和抗体的选择
⒈荧光素的选择：现在国内引进的大多数流式 细胞仪只装有一个激光光源，即488nm光源，所以 我们在选择荧光素时要选择能被488nm激光激发的 荧光素，常用的荧光素有：
选择纯度高的抗体、用同型对照抗 体或双标记排除非特异荧光
在细胞生长状态良好时测试、避 免反复吹打
彻底消化、在用酒精固定细胞时 加入终浓度为1.5-3％的小牛血清
一、 流式细胞术的概念
流式细胞术（FCM）就是对在高速 流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分 析和分选的技术，这种细胞或粒子是经 过特异荧光标记的。其特点是测量速度 快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞， 且可进行多参数测量，另一特点是在分 析的同时可把具有指定特征的细胞分离 出来，这就是分选技术。
FCM(Flow Cytomytry 流式细胞术)
流式样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题
原因
解决对策
细胞密度低 制备过程中细胞损失 增加离心时间、吸弃上清
非特异荧光强 碎片多
细胞聚集
荧光弱
流式细胞术基础知识
讲者：***
目录
1、流式细胞术基本定义 2、流式细胞仪介绍 3、荧光染料介绍 4、不同型号流式细胞仪简介 5、流式细胞仪应用
流式细胞术定义
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、 准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多 项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选
淋巴细胞亚群分析可以了解机体在不同条件下的免疫功能 状态，主要包括细胞免疫功能和体液免疫功能。在临床上，主要用 于对免疫系统造成明显干扰的相关疾病的辅助诊断，分析疾病的发 病机理，监控疾病的病程进展，观测疗效及监测预后等等。
流式细胞仪临床应用
临床意义 CD3+ CD3+ CD4+ CD3+ CD8+ CD4+ / CD8+ B细胞 NK细胞
FITC, PE,ECD,PC5 or PECy5.5,PE-Cy7
APC, APC-Cy7
国食药监械(进)字 2014第2403463号
FITC, PE,ECD,PC5 or PC5.5,PC7
红光:638nm 紫光：405nm
APC，APC-Cy5 or APCAlexa Fluor 700, APC-Cy7 or APCAlexa Fluor
谢谢！
部分演示内容来源于网络，如有侵权，请联系删除！谢谢！
APC, APC-Cy7
浙械注准 20192220121
流式细胞仪应用
临床研究
血液，肿瘤， 药理，免疫…
环境研究
湖泊，海洋 生态研究…
生物学研究
遗传，生殖， 微生物，细胞 生物，毒理， 分子生物…
食品制药工业
食品检测、药物筛 选，疫苗研究…
流式及分子诊断进展(崔巍)
崔巍 中国医学科学院肿瘤医院
背景 MDS诊断进展
细胞表面分子
流式细胞术免疫分型
单纯形态学 1976年FAB分型
细胞内部遗传物质
染色体核型 + 基因分子生物学
诊断标准
MDS 诊断需满足两个必要条件和一个确定标准 (⑴)必要条件： ① 持续一系或多系血细胞减少：红细胞 (HGB<110 g/L)、中性粒细胞 [中性粒细胞绝对计数 (ANC)<1.5×109/L]、血小板 (PLT<100×109/L)； ② 排除其他可以导致血细胞减少和发育异常的造血及非造血系统疾患 (2) 确定标准： ① 发育异常：骨髓涂片中红细胞系、粒细胞系、巨核细胞系中发育异 常细胞的比例≥10%； ② 环状铁粒幼红细胞占有核红细胞比例≥15%； ③ 原始细胞：骨髓涂片中达 5%～19%； ④ MDS 常见染色体异常。
正常造血过程中： 原始细胞向单核细胞分化：CD45增强（绿色箭头） 原始细胞向粒细胞分化：先是颗粒增多/SSC增强，早幼粒时SSC达到顶峰，后颗粒减少， CD45增强（橙色箭头） MDS时：粒细胞颗粒度减低/SSC减小，“Blast hole”被趋于成熟的粒细胞占据，单用 CD45/SSC射门时可能导致原始细胞计数不准确
SF3B1突变见于75.3%的RARS/RCMD-RS
Yoshida K, et al. Nature 2011; 478: 64-69.
K700E为SF3B1最常见突变位点
Papaemmanuil E, et al. N Engl J Med 2011; 365: 1384-1395.
SF3B1突变MDS表型特征
诊断——SF3B1突变
SF3B1: Splicing Factor 3B Subunit 1 (剪接因子3B亚基1) 其编码蛋白是剪切体中U2小核核糖核蛋白（U2snRNP）的核心成分,在RNA剪接 过程中发挥重要作用。 SF3B1基因突变引起的异常剪接与多种恶性血液病有关。
流式细胞术讲义
髓系细胞和单核细胞
7
CD20 FITC/CD22 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞及其分化程度
8
CD8 FITC/CD4 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞及其分化程度
9
CD3 FITC/CD16+56 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、NK细胞
10
CD36 FITC/GP-A PE/ CD45 PerCP
❖ T细胞相关标志：
CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8
常用白血病免疫分型荧光素标记单克隆抗体组合及其意义
管号 1
三色标记McAb
MouseIgG1/ MouseIgG1/CD45 PerCP
染色细胞及目的
阴性对照及设门
2
CD5 FITC/CD7 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、部分早期髓系细胞
样本要求：
➢ 肝素抗凝骨髓3ml(或外周血) ➢ 每天上午送检 ➢ 收费：
➢ 70元/每个单抗(临床常规检测12个单抗)
❖ 干/祖细胞标志：
CD34、CA133
❖ 髓系标志：
CD33、CD13、CD11b、CD15、MPO
❖ B细胞相关标志：
CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a、 CyIg、SmIg
3
CD10 FITC/CD19 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞
4
Anti-HLA-DA FITC / CD13 PE/ CD45 PerCP 髓系细胞、 B淋巴系细胞、部分T淋
巴系细胞
5
CD34 FITC/CD38 PE/ CD45 PerCP
反映细胞分化程度
流式细胞术(FCM)的工作原理及其在免疫学上的应用
流式细胞术（FCM）的工作原理及其在免疫学上的应用摘要：流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种可对单细胞进行快速定性、定量分析的新技术。
它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术，具有极高的检测速度与统计精确性，而且从单一细胞可以同时测得多个参数。
随着其分析技术和方法的日臻完善，流式细胞术在临床免疫及科学研究上发挥了非常重要的作用。
本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍，并对其在免疫学等方面的应用进行了综述，展示了FCM 在免疫学上应用的广阔前景。
关键词：流式细胞术；流式细胞仪；工作原理；免疫学；应用；应用前景流式细胞术(FCM)是70年代发展起来的一种快速对单细胞或微粒定量分析和分选的新技术。
其检测速度之快，统计学精度之高，是其他的方法无可比拟的，可同时从一个细胞中测得多种参数(如DNA、R N A、蛋白质、细胞体积等)进行多参数分析。
流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的结晶，在血液学、肿瘤学等学科尤其是在免疫学方面得到广泛应用[1]。
近年来，随着流式细胞免疫学技术的迅速发展，流式细胞术与单克隆抗体技术结合，使细胞表面和细胞内抗原，癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得了很大进展。
流式免疫技术克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足，形成了流式免疫学独特的科学分支，成为研究细胞免疫学的先进技术之一。
随着科学技术的发展，多种新的荧光探针的不断出现，使FCM技术的应用范围不断扩大，特别是各种各样的荧光探针标记的单克隆抗体和其他蛋白质的出现，为FCM 研究各种组织细胞膜和细胞内抗原、肿瘤性蛋白等开辟了新途径[2]。
1 .流式细胞术与流式细胞仪1.1流式细胞技术：流式细胞技术是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微球，测量其产生的散射光和发射荧光的强度；经染色的细胞或微球在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞或微球经过焦点时，发出一束散射光/或荧光；它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器光电倍增管或一个固态装置），光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析；并可能将感兴趣的细胞进行分选[3]。
四色流式细胞术用于急性白血病免疫分型的中国专家共识(完整版)
四色流式细胞术用于急性白血病免疫分型的中国专家共识（完整版）白血病免疫分型是利用不同单克隆抗体检测白血病细胞胞膜和胞质抗原，通过流式细胞术(FCM）分析其表型，实现对白血病细胞系列来源及其分化程度的诊断。
白血病免疫分型已成为诊断白血病的必要依据，同时也可为微小残留病（MRD)的检测以及白血病的治疗和预后提供重要信息。
白血病免疫分型是细胞形态学分型的重要补充和进一步深化，以荧光标记技术联合FCM检测并判定白血病免疫表型，具有准确、快速、客观、重复性好、特异性强等特点，提高了白血病诊断的准确性[1, 2]。
采用不同数量及组合的荧光标记免疫抗体处理白血病细胞并进行荧光检测及分型是免疫分型的关键环节。
准确诊断需要选择一定数量的抗体，白血病免疫分型涉及多个造血系列的抗原，但目前国内甚至国际上均无规范化的方案可以借鉴；国内不同的医疗单位所用的抗体数量和种类均有较大的异质性，有些单位由于应用的抗体数量较少或抗体选择不当，影响对疾病的诊断、分期和预后的判断。
鉴于国内的实际情况，中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组经过多次讨论，提出以CD45/侧向散射光（SSC）为基础的中国FCM急性白血病免疫分型四色方案，本方案以2组表面抗原作为筛查抗原，试图利用相对少的抗体，达到对各个类型白血病进行较全面的检测，具有快速、客观、准确的特点。
已在国内的多家医疗单位试用，证明此方案能够满足临床的需要[3, 4]。
目前，虽然国际上有八色甚至十色方案[5, 6, 7]，但对仪器及操作人员的技术要求较高。
鉴于国内的实际情况，我们首先提出中国FCM急性白血病免疫分型四色方案，供从事急性白血病免疫分型的实验室参考，以期促进我国急性白血病免疫分型诊断的规范化及整体水平的提高。
一、四色方案的基本要求理想的急性白血病免疫分型方案应满足以下几点要求：①识别白血病细胞，能将其与正常细胞或反应性细胞相区别；②鉴别白血病细胞的系列来源；③根据细胞的分化程度对疾病进行亚型分型；④鉴别用于检测MRD 的白血病相关免疫表型(LAIP) ;⑤帮助判断某些特异分子改变，即基因型检测；⑥提供预后相关及治疗靶点的免疫标志检测结果。
流式细胞技术
广泛应用
细胞免疫标志检测-细胞免疫分型
通过检测DNA含量分析细胞周期
细胞周期分析-PI染色
细胞凋亡
细胞凋亡-JC-1检测凋亡细胞线粒体电位
Ex=529nm Em=590nm
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性时间。
Ex=488nm Em=530nm
通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞 膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变 作为细胞早期凋亡的一个检测指标
非特异性染色：
抗体的Fc段可以与细胞表面的Fc受体非特异性结合； 抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色
对照的设置
阳性对照：为了检测荧光抗体是否有效，不必每次分析时均设置。
使用新的荧光素抗体时 使用储存时间较长的荧光素抗体时
设置阳性对照的方法：
用肯定表达该抗原的细胞来检测；
已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体
流式细胞仪数据分析
门（Gate，简写G）是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数
据分析过程实际上就是选门和设门的过程。
椭圆形 圆形 矩形 任意形状
十字门
线性门
R（Region，区域）。门可以使单一区域（G=R1），也可以是 几个区域组合在一起：G=R1+R2。
流式细胞仪数据分析
数据存储：标准的FCM数据采用列 常用分析软件： 表模式（list mode），记录了每个 细胞的所有参数的信息 CellQuest Diva FlowJO WinMDI FCS Express 数据显示： 直方图（Histogram） 二维点图（Dot Plot）
细胞凋亡-JC-1检测凋亡细胞线粒体电位
流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种利用流式细胞仪对细胞或其他生物颗粒进行快速、多参数、定量分析和分选的技术。
在免疫学领域，流式细胞术具有广泛的应用，为免疫学家提供了一种强大的研究工具。
1. 免疫细胞分型和计数：流式细胞术可以通过标记抗体与细胞表面或内部的特定抗原结合，从而对不同类型的免疫细胞进行分类和计数。
这对于监测免疫系统的状态、研究免疫疾病以及评估免疫治疗效果非常重要。
2. 细胞活化和功能分析：流式细胞术可以检测细胞表面标志物的表达水平，从而评估免疫细胞的活化状态和功能。
例如，通过检测 CD69、CD25 等活化标志物的表达，可以研究T 细胞的活化；通过检测细胞因子的表达，可以分析 Th1、Th2、Th17 等不同类型的 T 细胞亚群。
3. 免疫细胞凋亡检测：流式细胞术可以通过 Annexin V/PI 双染色法等技术，检测免疫细胞的凋亡情况。
这对于研究免疫细胞的生存和死亡调节机制、评估药物对免疫细胞的影响以及探讨免疫相关疾病的发病机制具有重要意义。
4. 免疫细胞分选：流式细胞仪可以根据细胞的物理或生物学特性，将目标细胞从混合细胞群体中分离出来。
这一技术在细胞培养、基因转染、单细胞分析等方面具有重要应用。
5. 高通量筛选：流式细胞术可以同时分析大量样本，实现高通量筛选。
这对于药物筛选、抗体发现以及寻找新的免疫治疗靶点等研究具有重要价值。
总之，流式细胞术在免疫学中的应用非常广泛，为深入了解免疫系统的结构和功能、探索免疫相关疾病的发病机制以及开发新型免疫治疗策略提供了重要的技术支持。
流式细胞术免疫分型基础
CML加速期(Accelerated Phase,AP)
原始细胞（Blast）
形态学上的原始细胞包括： • 干细胞 • 粒系：原粒+早幼粒细胞（有颗粒原粒？） • 单核系：原单+幼单 • 淋巴系统：原+幼淋 • 原始巨核
髓系幼稚细胞
• 幼稚细胞包括原粒、原单、原始巨核、幼单。 • 异常单核不能算幼稚单核，在鉴别急性粒单细
胞白血病、急性单核细胞白血病、慢性粒单细 胞白血病中有重要作用。
• 出现下述之一考虑CML AP： PB中嗜碱性粒细胞超过20%；（嗜碱性粒细
胞识别：位置：CD45/SSC图，原粒的左上， 表达CD9、CD123、CD203c、CD22dim）
PB或者BM中髓系幼稚细胞为10-19% 幼稚细胞克隆为非髓系。
CML急变期（Blast Phase, BP）
• 表现为下述之一： ①PB中原始细胞占白细胞20%以上，BM中原
+
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流式细胞术的基本原理及其应用
流式细胞术的基本原理及其应用流式细胞术的基本原理是通过将携带荧光标记物的细胞单个穿过一个经过纳米级微孔的流动细胞仪中，在仪器静止状态下，用激光束照射细胞，测量细胞散射光强度和荧光素（荧光标记物）发射光强度，并对荧光标记物进行定量和定性分析。
流式细胞术有多个功能模块来实现这些原理，包括样本处理和采集、检测光源、光学系统、示波器、计算机控制和数据分析软件等。
应用方面，流式细胞术在免疫学、细胞生物学和药物研发等领域具有广泛的应用。
以下是几个流式细胞术的应用举例：1.免疫细胞表型分析：可以通过流式细胞术对白细胞表面的特定抗体标记物进行检测和分析，了解免疫细胞的分布、组成和功能状态。
这种技术在临床用于诊断和监测疾病，例如血液肿瘤的分型和监测、感染和免疫疾病的诊断。
2.DNA细胞周期分析：流式细胞术可以通过染色体分析来检测细胞周期的不同阶段，并评估细胞的增殖和DNA损伤。
通过分析细胞周期，可以确定干细胞、肿瘤细胞和其他细胞类型的比例，从而研究生物学和疾病发展过程中的细胞生长和增殖。
3.细胞凋亡分析：流式细胞术可以用荧光标记物来检测和分析细胞凋亡（程序性细胞死亡）的过程。
凋亡是正常生理和病理过程中的重要事件，例如生长发育和肿瘤发生。
通过分析细胞表面和内部标记物的表达和活性变化，可以了解细胞凋亡的诱导和调控机制。
4.细胞分选和分离:流式细胞术可以通过荧光标记物和细胞大小、复杂性等参数来识别和分选特定类型的细胞。
这种细胞分选技术在基因表达、单细胞转录组学、干细胞研究等领域具有重要应用，可以帮助研究者对细胞进行单个细胞水平的分析。
5.离子指示染料测定：通过使用与细胞膜融合的离子指示染料，流式细胞术可以测定细胞内离子浓度和动态变化。
例如，钙离子（Ca2+）作为重要的细胞信号分子，流式细胞术可以实时监测细胞内钙浓度的变化，并研究其与细胞功能和相应生理过程的关联。
总之，流式细胞术作为一种高通量、高灵敏度和多参数的细胞分析技术，在免疫学、细胞生物学和疾病研究中起着至关重要的作用，不仅可以提供定量的细胞信息，还可以为深入理解细胞生命活动和机制提供有效的实验手段。
我国急性白血病免疫分型的四色方案
中国流式细胞术急性白血病免疫分型四色方案由于多参数流式细胞术(MFC)免疫分型具有客观、敏感、准确等特点，免疫表型已成为诊断急性白血病的重要依据之一。
因准确的诊断需要选择一定数量的抗体，涉及多个造血系列的抗原。
但目前国内甚至国际上没有规范化的方案可以借鉴。
而国内不同的医疗单位所用的抗体数量和种类均有较大的异质性，有些单位由于应用的抗体数量较少或抗体选择不当，影响对疾病的诊断、分期和预后的判断。
鉴于国内的实际情况，中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组经过多次的讨论，提出以CD45/SSC为基础的中国流式细胞术急性白血病免疫分型四色方案，供参考。
本方案不包括标本的采集、保存、制备、试剂和仪器的调整及急性白血病的诊断标准，这些对免疫分型同样重要，可参考相应的指南。
1．适应范围：1.1急性淋巴细胞白血病(ALL):z B系：早B前体-ALL(Pro-B), 普通-B-ALL(Common-B),前体B-ALL(Pre-B),及与Burkitt淋巴瘤进行鉴别z T系：早T前体-ALL (Pro-T), 前体T-ALL(Pre-T),皮质-T-ALL和髓质-T-ALL.1.2急性早幼粒细胞白血病（APL）1.3急性髓细胞白血病（AML）z AML微分化型（AML-M0）z AML伴粒系和单核细胞分化型（AML-M1/2和AML-M4/5）z急性红白血病（AML-M6）z急性巨核细胞白血病（AML-M7）1.4前体树突细胞肿瘤1.5急性嗜碱性粒细胞和肥大细胞白血病1.6 混合表型白血病1.7 对上诉急性白血病治疗后检测MRD的标志进行筛查2.抗体的选择：根据检测的目的，需要检测不同的抗体：2.1 鉴别急性、慢性白血病:对于急性髓细胞白血病，可以根据CD45/SSC图型进行初步判断。
髓系白血病细胞CD45的表达较弱，往往位于正常淋巴细胞下方，且多数白血病细胞SSC较低（除去大颗粒APL患者）。
再根据CD34、CD117、CD38、HLA-DR、CD123的表达进行判断。
免疫细胞分型鉴定
免疫细胞分型鉴定
免疫细胞分型鉴定是指对免疫系统中的不同细胞类型进行鉴定和分类。
免疫细胞是组成免疫系统的关键组成部分，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞等。
以下是一些常见的免疫细胞分型鉴定方法和指标：
1.免疫表型分析：利用流式细胞术（flow cytometry）等技术，
通过检测细胞表面的免疫标记物（抗原）来确定细胞的类
型。
例如，CD3、CD4和CD8用于T细胞的鉴定，CD19用
于B细胞的鉴定，CD56用于NK细胞的鉴定等。
2.细胞功能分析：通过测量细胞的功能，如细胞因子产生、
细胞毒性等，来鉴定细胞类型。
例如，T细胞可以通过检
测干扰素γ（IFN-γ）或白细胞介素-2（IL-2）产生来鉴定
Th1细胞；B细胞可以通过测量抗体产生来鉴定。
3.基因和蛋白质分析：使用分子生物学技术，如PCR和免疫
组化等，检测特定基因和蛋白质的表达来确定细胞类型。
例如，通过检测T细胞特异性基因编码的T细胞受体
（TCR）来鉴定T细胞子群。
4.细胞形态学分析：通过显微镜观察和分析细胞的形态和特
征来鉴定细胞类型。
例如，T细胞通常具有细的胞质、圆
形或椭圆形的细胞形态。
通过免疫细胞分型鉴定，可以对不同种类的免疫细胞进行准确的鉴定和分类，从而更好地了解免疫系统的功能和调节机制。
这对于研究免疫相关疾病的发病机制、制定免疫治疗策略以及评估免疫疫苗效果等有重要意义。
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)
抗体的选择
PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原，适
用范围广 biotin-avidin不适合 弱抗原的检测
数据显示方式
单参数直方图 双参数二维点图 等高图 二维密度图 三维图
流式常见图形 (Histogram Plot)
流式细胞的主要信息:Fluorescence FL1 FL2 FL3 FL4
第四节 凋亡检测
1）FCM-DNA检测（DNA亚G1峰的检测）：利用PI染 色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡 细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释 放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的 固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解 的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少， 成为亚2倍体。注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡 细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影 响结果的准确性。 可参看文章： /content/cell/20040914791.htm /content/cell/20040914792.htm
2）CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于干 细胞移植及基因治疗方面的检测。 3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞 性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现 活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如 果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的 原因为血小板破坏过多所致。
4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH） 的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发 生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成 障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的 GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的 主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞 或WBC上出现CD55或/和CD59的减少， 可诊断为PNH。
急性白血病系别判断的流式细胞免疫分型
三、急性白血病系别诊断标准
• EGIL诊断标准缺点： • （1）关于阳性定义，因为影响因素众多，有时存在歧义； • （2）对于某些覆盖率低、特异性高的标志，给予分值低或者未纳入，如CD64、CD14； • （3）对某些常见伴系表达标志予以极低分值，如CD7，未考虑荧光强度的差异； • （4）对于相对特异、在某系别易于伴发的标志，未考虑差异对待，如cCD79a、CD10
三、急性白血病系别诊断标准
• 鉴于几乎没有任何标志是绝对敏感和特异的，做全标志有助于降低误诊风险，因此 在系别筛查时如果出现系别标志表达过多或者过少，或者伴系表达标志的强度超过 标本中残留的正常细胞时，首先应该做全两个诊断标准涉及的相关系别标志，必要 时甚至需要增加CD371等新的髓系标志。
• 在此过程中可以选择一步法或者两步法。选择一步法的实验室，以目前常用3激光8 色机型为例，可供参考的5管法见表3；选择两步法的实验室，第一步进行系别筛查， 包括髓系MPO（或者CD33）和CD117，T系CD7和cCD3、B系CD19和CD22，根据 采用仪器型号不同可能有差异，4色方案可以参考2015年4色流式细胞术中国专家共 识，3激光8色推荐方案见表3。
三、急性白血病系别诊断标准
三、急性白血病系别诊断标准
• 注意几个标志的FCM检测： • （1）MPO：使用克隆号8E6、MPO-7的抗体需要小心，因为均有在B-ALL表达的
报道；阳性阈值虽然大多数沿用10%，但是建议结合荧光强度，并且不典型病例应 该做全其他髓系标志，并结合细胞化学和免疫组化MPO检测结果；FCM破膜处理 可能会使粒细胞的侧向角光散射（side scatter，SSC）降低，从而影响CD45/SSC设 原始细胞门的精确度，导致假阳性结果，正确的方法应结合原始细胞标志修订设门。
白血病流式免疫分型
白血病流式免疫分型白血病是一种造血系统恶性肿瘤，由于白细胞数量和质量的异常增加，导致机体免疫功能下降，造成多种系统和器官功能异常。
白血病的治疗首先需要确定其类型和分型，以便制定有效的治疗方案。
流式免疫分型作为一种先进的白血病诊断技术，已被广泛应用于临床实践中。
白血病流式免疫分型是将细胞标记物与荧光标记结合，通过流式细胞术对细胞进行定量、定性的分析，进而确定白血病的类型、分型。
它可以快速、灵敏地检测单个细胞，检测出极低浓度的异常白细胞，并对相关疾病进行准确的诊断和分类，特别是对淋巴瘤和白血病的鉴别诊断。
流式免疫分型在白血病治疗诊断中的应用既可以确定疾病的类型，也可以指导治疗方案的制定。
对于急性白血病的治疗而言，流式免疫分型可以评估化疗药物敏感性、预测预后，以及指导骨髓移植的实施，从而提高治疗的效果和疗效。
对化疗失败的慢性淋巴细胞白血病患者进行流式免疫分型，可以确定其恶性程度、预测预后及制定诊断治疗方案，如靶向药物治疗等新的治疗手段。
不过，需要指出的是，流式免疫分型虽然是一种有效的白血病诊断技术，但其存在一定的局限性。
例如，对于某些罕见的白血病类型，目前流式免疫分型无法完成准确的分类，需要结合其他诊断手段进行综合判断。
同时，由于流式免疫分型涉及大量的细胞学和生化实验，其实验成本也比较高，还需要一定的技术开销和专业操作的知识。
综上所述，白血病流式免疫分型作为一种先进的白血病诊断技术，已经逐步成为临床实践中的标准操作。
它可以对白血病患者进行准确的分类和疾病诊断，指导治疗方案的制定，同时也为临床科研提供了有力的手段和工具。
但需要注意的是，流式免疫分型还需要不断探索和深入，结合其他先进技术和诊疗方法，共同提高白血病治疗的水平和效果。
流式细胞术在成熟淋巴细胞肿瘤诊断中的应用
01 引言
03 参考内容
目录
02 实验方法
引言
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在医学领域中广泛应用的技术， 具有高效、快速、敏感等优点。它通过将细胞悬浮在流水中，并利用特定的抗体 对细胞进行标记，从而对细胞进行种类、功能等方面的分析和检测。在淋巴细胞 肿瘤诊断中，流式细胞术能够通过对成熟淋巴细胞的表面标志物进行检测，为临 床提供更准确、更快速的诊断结果。
参考内容三
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测细胞特性的 技术。它已经成为免疫学研究中的重要工具，并被广泛应用于免疫细胞的分型、 功能和活性测量。
1、细胞分型：流式细胞术可以用来对免疫细胞进行精细的分型。通过使用 不同的抗体标记，可以识别和区分各种类型的淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细 胞等。同时，对于细胞亚群的识别和计数，流式细胞术也具有高灵敏度和高精度 性。
4、疾病诊断：流式细胞术在免疫学中的应用也扩展到了临床诊断。例如， 流式细胞术可以用来检测自身免疫疾病、癌症和感染等疾病中的异常免疫反应。
5、疫苗开发：流式细胞术可以帮助科学家们研究免疫反应的机制，从而为 疫苗开发提供重要的信息。例如，通过流式细胞术，科学家们可以跟踪疫苗接种 后免疫细胞的反应，以便优化疫苗设计和接种方案。
1、免疫分型：流式细胞术能够通过对细胞表面抗原的检测，对淋巴细胞、 白血病、骨髓瘤等免疫相关疾病进行分型和诊断。例如，通过检测T细胞亚群的 分布和功能，可以对自身免疫性疾病、感染性疾病等进行诊断和鉴别诊断。
2、感染诊断：流式细胞术能够快速准确地检测病毒、细菌和其他微生物等 感染引起的特异性免疫反应。例如，通过检测抗原特异性抗体水平，可以快速诊 断流感、肺炎等感染性疾病。
流式细胞术系列之-白血病免疫分型
门位置处出现
白血病流式免疫分型举例
T-ALL
在CD45/SSC点图中，幼稚细胞群体低SSC信号，与成熟 淋巴细胞比较CD45弱表达
Ta ng ca i xi a.00 1
R3
R4
R5 100
R1 R2
101
102
103
CD4 5 PerCP-Cy5.5
104
CD5、CD7、 cCD3、 CD34阳性
• 幼稚细胞群体的FSC和SSC信号与M0相似，Blasts >90%。
免疫分型 基础介绍
近年来白血病得免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少得重要标准之一、早年曾用过得荧光显微镜或APAAＰ方法基本被废弃。
国际上公认得通用得方法就是流式细胞术(FCM)。
流式细胞术白血病免疫分型就是利用荧光素标记得单克隆抗体(McAb)作分子探针,多参数分析白血病细胞得细胞膜与细胞浆或细胞核得免疫表型,由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。
ﻫ1、流式细胞仪诊断白血病得依据⑴FＣM能快速,多参数,客观得定性又定量测定细胞膜、浆、核得抗原表达ﻫ⑵至今尚未发现白血病得特异抗原。
ﻫ⑶能用正常血细胞得单抗来进行免疫分型就是基于白血病形成得分化阻断学说。
即白血病细胞基因异常,分化受阻于某阶段形成不同亚型得白血病、这群细胞充盈于骨髓。
正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞得过程中,细胞膜、细胞浆或胞核抗原得出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞得分化发育阶段密切相关,而且表现出与细胞系列及其分化程度相关得特异性。
因此,这些抗原得表达与否可作为鉴别与分类血细胞得基础。
白血病就是造血系统得恶性肿瘤,在形态上变化虽相当大,但仍能表达正常血细胞所具有得抗原,因而仍可依据其抗原得表达谱对白血病进行免疫分型。
2、流式细胞仪诊断白血病得意义ﻫ⑴骨髓血细胞就是形态学分型得基础,FCＭ白血病免疫分型就是对形态学分型得重要补充与进一步深化,国际白血病MIＣ分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都就是必不可少得,对下列情况意义更大:①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源得白血病。
②形态学为急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性未分化白血病(AUL)但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。
③混合性白血病。
④部分髓系白血病。
目前,免疫分型对粒细胞与单核细胞白血病得鉴别尚有一定困难。
⑤慢性淋巴细胞白血病。
⑥微小残留白血病、⑵临床预测;可根据抗原得表达情况预测病情得预后:如白血病患者有ＣD7+与CＤ3４+共表达,预后不好。
⑶疾病监测:可监测病程得发展,疗效,可进行微小残留白血病得检测。
免疫分型标准
免疫分型标准免疫分型是指根据免疫系统的特定指标对个体的免疫状态进行分类和评估。
免疫分型标准通常基于免疫细胞的数量、功能、表面标志物等因素，以及体液免疫指标，如抗体水平。
这有助于更好地了解个体的免疫功能，为疾病预防、诊断和治疗提供有针对性的信息。
免疫分型的主要标准包括以下几个方面：免疫细胞数量和比例：淋巴细胞计数：包括T细胞、B细胞、NK细胞等。
通过流式细胞术等技术检测。
CD4+/CD8+T细胞比例：正常范围通常在1.0-2.5之间。
该比例可反映T细胞的免疫调节状态。
免疫细胞功能：淋巴细胞功能检测：如T细胞的增殖能力、B细胞的抗体产生功能等。
这些功能可以通过体外实验室技术进行评估。
免疫球蛋白水平：IgG、IgA、IgM水平：通过血清学检测，评估体液免疫的状况。
特定抗体水平：如疫苗接种后特定病原体的抗体水平，反映对该病原体的免疫记忆。
炎症标志物：C反应蛋白（CRP）、血沉等：反映机体炎症状态，对于炎症性疾病的评估有一定意义。
HLA分型：人类白细胞抗原（HLA）分型：通过检测HLA基因，了解个体对抗原的免疫反应差异，对器官移植、免疫相关疾病的研究有重要意义。
免疫功能评估：免疫球蛋白亚型：了解IgG的亚型分布，对免疫功能的细致评估提供信息。
细胞因子水平：如干扰素、白介素等，反映机体对病原体的免疫应答状态。
过敏和自身免疫标志物：IgE水平：过敏体质的评估。
自身抗体检测：检测自身抗体水平，帮助诊断自身免疫疾病。
免疫分型的意义：免疫分型有助于了解个体的免疫状况，为疾病的早期预防、诊断和治疗提供科学依据。
在移植手术前，免疫分型也对移植的配型和免疫抑制治疗方案的制定具有指导作用。
免疫分型的发展不仅在免疫学研究领域有着广泛应用，同时也推动了个体化医疗的发展。
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-：<10%的病例阳性；+：25-75%的病例阳性；++：>75%病例阳性。 *：约5%的Pre B-ALL为过渡型pre B-ALL，定义为胞浆和胞膜IgM，但是不 表达成熟κ、λ轻链。 #：PE标记或者胞浆CD22。
表2 T-ALL/LBL免疫表型分类
最简单的急性白血病抗体组合
髓系 CD13或者CD33、CD117、MPO B/浆系 CD19、c/m kappa、c/m lambda、CD20、
cCD79a或者CD22、CD138 T 系 CD2、CD4、CD5、CD7、CD8、CD56、cCD3 单核 CD14、 CD64 其他 HLA-DR、CD10 干细胞 CD34
髓系和淋系肿瘤 – MDS/MPN – MDS
• 急性髓系白血病和急性未定系列白血病 • 前体淋巴肿瘤 • 成熟淋巴增殖性疾病
– B细胞淋巴瘤 – T或者NK细胞淋巴瘤 – 何杰金氏淋巴瘤 – 免疫缺陷病 • 组织细胞和树突细胞肿瘤
MPN（髓系增殖性肿瘤）
• BCR-ABL1阳性慢性髓系白血病（chronic myelogenous leukemia,CML)
原粒以外，有分化阶段粒细 胞， POX,SBB,CE+
M4 原幼粒+成熟粒≥ 20% 原幼单+成熟单≥ 20%
粒单两系原始加分化细胞， POX,CE, NAE+NAF抑制
M5 单核系≥ 80%
单核系为主，NAE+NAF抑制
M6 20%以上，有核红占有核细 红系和粒系原幼+分化细胞， 胞50%以上或者红系80%以 红系PAS阳性 上
CD22-PE/胞浆CD22） 7、T-ALL： • 原始细胞标志：CD34、胞浆TdT • T系标志：CD1a 、CD2、胞浆/胞膜CD3、CD4、CD5、
CD7、CD8、CD56
一个完整的免疫分型做多少抗体？
普通免疫分型： • 1步法建议做20个抗体 • 2步法做15个抗体。
复杂的免疫分型，如罕见疾病、混合白血病、 T细胞淋巴瘤、异常细胞群比例较低的疾病 等，可能需要增加抗体种类，有些抗体需 要重复使用。
最低检测抗体2
5、AML： • 原始细胞标志：CD34、CD117、HLA-DR • 髓系标志： CD11b、CD13、CD14、CD33、CD64、
胞浆MPO • 伴系表达标志：CD7、CD56、CD19 6、B-ALL： • 原始细胞标志：CD34 • B系标志： CD10、CD20、CD19、胞浆CD79a（或者
始细胞占有核细胞20%以上， ②原始细胞髓外增生。 70%的病例BP是急髓变，包括中性粒、嗜酸
性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核系、巨核系 或者红系急变，或者上述组合，20-30%为淋 系急变。
MDS/MPN
• CMML • aCML, BCR-ABL1• JMML • MDS/MPN, U
CMML诊断标准
• BM或者PB中：髓系原始细胞≥20%，或者有髓外侵 润。
• 特例： 1、重现性遗传学异常，髓系幼稚细胞<20%也可以
诊断。 2、骨髓有核红细胞50%以上，见鉴别诊断。 • 主要标准根据BM涂片、PB涂片、BM活检。 • 分类标准仅适用于化疗前。
红系前体细胞>=骨髓有核细胞的50%时的 可能诊断
最低panel
不按照疾病类别，所有疾病采取一致 panel的： • MPO/cCD79a(CD22)/CD45/cCD3 • CD34/CD10/CD45/CD19 • ckappa/clambda/CD19/CD138 • CD4/CD8/CD45/CD2 • CD7/CD117/CD45/CD56 • CD14/CD64/CD45/CD13(33） • CD20/HLA-DR/CD45/CD5
1、持续性PB单核细胞增多>1X109/L（>20%) 2、无Ph染色体或者BCR/ABL1基因 3、无PDGFRA或者PDGFRB重排（尤其是伴嗜酸性粒细
胞增多的病例） 4、PB和BM中幼稚细胞<20% 5、至少1个髓系增生不良，如果没有或者只有轻微
髓系增生不良，需要其它条件：①造血细胞中存 在获得性、克隆性细胞或者分子遗传学异常，或 者②单核细胞增多至少持续3个月和③排除其它所 有导致单核细胞增多的原因。
BM中红系前 体%
≥50%
红系前体 ≥80%
≥50%
≥50%
PB/BM发现
其它表现
诊断
BM中和/或PB中幼稚 符合MDS相关
细胞>20%
AML标准
幼稚细胞少见
粒系成分少
MDS相关AML 纯红白血病
BM中和/或PB中幼稚 细胞<20%
BM中和/或PB中幼稚 细胞<20%
幼稚细胞≥骨髓 中非红系的 20%
CD10 -
CD20 -
cIgM -
sIg
-
CD19 ++
CD22# ++
cCD79a ++
Common BALL (EGIL B-II) ++ + ++ + ++ ++ ++
Pre B-ALL (EGIL B-III)
+ + ++ + ++ ++ ++ ++
Transitional Mature B-ALL pre-B-ALL* 现Burkitt样白 (无EGIL编码) 血病/淋巴瘤
（CD1a、CD99str) • 泛B：CD19、cCD79a、CD22 • 泛T：胞浆CD3、CD7、CD2、CD5 • 不表达成熟标志：B系胞膜轻链；T系CD4、
CD8、CD3
2008 WHO分类
• 偏成熟髓系疾病 –髓系增殖性肿瘤(MPN)（包括肥大细胞增多症） –伴有嗜酸细胞增多和PDGFRA、PDGFRB、FGFR1异常的
• 如果局部和PB/BM都有，分类比较武 断，有的以25%为界，一般骨髓幼稚 细胞<20%不考虑ALL，而为LBL。
淋巴肿瘤的定义
累及范围
成
髓外为 BM、 都有BM、 都有BM、
熟
主 PB PB>25% PB<20%
度 幼稚 LBL ALL
ALL
LBL
成熟
NHL
成熟 淋巴 白血 病/淋 巴瘤
成熟淋巴 白血病/淋
• 慢性中性粒细胞白血病(CNL) • 真性红细胞增多症(PV) • 原发性骨髓纤维化(PMF) • 特发性血小板增多症(ET) • 慢性嗜酸性粒细胞白血病，NOS(CEL) • 肥大细胞增多症(mastocytosis) • 髓系增殖性肿瘤，不能分类的(MPN.U)
CML加速期(Accelerated Phase,AP)
急性白血病(acute leukemia)诊断标准
• BM：建议用瑞氏染色，计数500个分化细胞，PB计 数200个
• 如果有明显的细胞减少，可以使用棕色层（buffy coat）涂片。
• 如存在骨髓纤维化，不能涂片，如果blast表达 CD34,活检片子CD34+≥20%也可以诊断。
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)诊断标准
• 小的异常增生巨核和微巨核不能算幼稚细胞。 • 在APL中，异常早幼粒也算幼稚细胞。
• 原红一般不计在内，除非罕见的急性纯红细胞 白血病。
髓系幼稚细胞免疫标志
• 原粒、原单：CD34、CD117、HLA-DR、CD13、 CD33、MPO+/-
• 原始巨核:CD61、CD41a、CD9、CD36（不特异） • 幼单：CD15dim、HLA-DRstr、CD64、CD11c、
原始细胞（Blast）
形态学上的原始细胞包括： • 干细胞 • 粒系：原粒+早幼粒细胞（有颗粒原粒？） • 单核系：原单+幼单 • 淋巴系统：原+幼淋 • 原始巨核
髓系幼稚细胞
• 幼稚细胞包括原粒、原单、原始巨核、幼单。 • 异常单核不能算幼稚单核，在鉴别急性粒单细
胞白血病、急性单核细胞白血病、慢性粒单细 胞白血病中有重要作用。
M7 原始巨核20%以上
原始巨核，PAS粗 干祖+全 髓标志 界限不 清，出现 分化标志 3群细胞
单核标志 R6明显
巨核标志
LBL/ALL定义
• 定义：以局部团块为主，没有或者很 少PB、BM侵润，为淋巴瘤。根据细 胞成熟阶段分为成熟淋巴瘤或者淋巴 母细胞淋巴瘤(LBL)
CD64 2、成熟B系肿瘤：CD5、CD10、CD19、CD20、CD23、
kappa、lambda 3、成熟T/NK系肿瘤：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、
CD8、CD56（如果CD4/CD8双阳，要求做CD1a） 4、浆细胞肿瘤/疾病：CD19、CD38、CD56、CD138、
胞浆kappa、胞浆lambda
临床表现 贫血 白细胞减少 血小板减少 全血细胞减少 中性粒细胞增多 单核细胞增多 淋巴细胞增多、肝脾大 嗜酸性粒细胞增多
评价的细胞系 B、T、M、P B、T、M、P B、T、M、P B、T、M、P M M B、T T、M