溶菌酶的提纯结晶和活力测定.实验报告doc
溶菌酶活力测定实验报告
1. 掌握溶菌酶活力测定的原理和方法；2. 熟悉分光光度计的使用；3. 了解溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的溶解作用。
二、实验原理溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）是一种能够催化某些细菌（革兰氏阳性菌）细胞壁多糖水解的酶，从而溶解细菌细胞壁，起到杀菌作用。
测定溶菌酶活力时，可用细菌细胞壁作为底物，细胞壁溶解后，菌悬液浊度降低，通过分光光度法测定菌悬液浊度变化，计算溶菌酶活性。
三、实验材料与试剂1. 试剂：1. 1mol/L氢氧化钠溶液；2. 1mol/L盐酸溶液；3. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.2）：NaHPO·2H2O 0.392g，溶于蒸馏水并稀释至1000mL，调节pH至6.2；4. 牛肉膏培养基；5. 溶菌酶结晶标准品（酶活力单位为70000U/mg）。
2. 仪器：1. 分光光度计；2. 离心机；3. 移液器；4. 电子天平；5. 烧杯；6. 漏斗；7. 移液管。
1. 准备实验试剂和仪器；2. 配制0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.2）；3. 将枯草杆菌制成菌悬液；4. 将溶菌酶标准品稀释成不同浓度；5. 分别取不同浓度的溶菌酶标准品和菌悬液，加入反应体系中；6. 在分光光度计上测定菌悬液在450nm波长下的吸光度值；7. 根据吸光度值和溶菌酶标准品浓度，绘制酶活力曲线；8. 测定待测溶菌酶样品的酶活力。
五、实验结果与分析1. 酶活力曲线：根据实验数据，绘制酶活力曲线，结果表明酶活力与溶菌酶浓度呈线性关系。
2. 待测溶菌酶样品的酶活力：根据酶活力曲线，计算待测溶菌酶样品的酶活力。
六、实验结论通过本实验，我们成功掌握了溶菌酶活力测定的原理和方法，熟悉了分光光度计的使用，并了解了溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的溶解作用。
实验结果表明，溶菌酶活力与溶菌酶浓度呈线性关系，为后续相关研究提供了实验依据。
七、实验注意事项1. 实验过程中，注意控制反应体系的pH值，以保证溶菌酶活性；2. 使用分光光度计测定吸光度值时，注意选择合适的波长；3. 实验过程中，操作要规范，避免污染。
溶菌酶结晶实验报告
一、实验目的1. 了解溶菌酶的性质和特性；2. 掌握溶菌酶的提取和纯化方法；3. 学习溶菌酶的结晶技术；4. 鉴定溶菌酶的纯度和分子量。
二、实验原理溶菌酶（lysozyme）是一种广泛存在于生物体中的碱性蛋白质，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
溶菌酶能水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的-1,4糖苷键，导致细胞壁破裂，从而杀灭细菌。
本实验通过从鸡蛋清中提取溶菌酶，经过分离纯化后，采用硫酸铵盐析法进行结晶，并鉴定溶菌酶的纯度和分子量。
三、实验材料1. 实验仪器：高速离心机、冰箱、紫外可见分光光度计、显微镜等；2. 实验试剂：鸡蛋清、硫酸铵、NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、pH 7.0 Tris-HCl缓冲液、SDS-PAGE电泳试剂等；3. 实验耗材：离心管、玻璃棒、滤纸、试管、移液器、培养皿等。
四、实验步骤1. 溶菌酶提取（1）取鸡蛋清2g，加入20ml pH 7.0 Tris-HCl缓冲液，搅拌溶解；（2）加入0.1mol/L NaCl溶液，使NaCl浓度达到0.5mol/L，搅拌30分钟；（3）加入1mol/L CaCl2溶液，使CaCl2浓度达到0.1mol/L，搅拌30分钟；（4）加入1mol/L MgSO4溶液，使MgSO4浓度达到0.1mol/L，搅拌30分钟；（5）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取上清液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）取上清液5ml，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达到80%，搅拌30分钟；（2）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取沉淀；（3）将沉淀溶解于10ml pH 7.0 Tris-HCl缓冲液中，加入0.1mol/L NaCl溶液，使NaCl浓度达到0.5mol/L，搅拌30分钟；（4）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取上清液。
3. 溶菌酶结晶（1）取上清液5ml，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达到80%，搅拌30分钟；（2）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取沉淀；（3）将沉淀溶解于5ml pH 7.0 Tris-HCl缓冲液中，加入0.1mol/L NaCl溶液，使NaCl浓度达到0.5mol/L，搅拌30分钟；（4）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取上清液；（5）将上清液置于冰箱中过夜，观察结晶现象。
溶菌酶的纯化以及活性鉴定
本实验我们致力于研制出安全、有效的新型海洋溶菌酶，通过Ni-NTA介质纯化带有his标签的重组蛋白，并从pH、温度、金属离子、去垢剂和抑制剂等方面对海洋溶菌酶进行研究。
在实验过程中，出现了许多之前没有想到的难题，我们不断完善实验步骤，在这过程中收获了很多。
接菌和扩大培养的实验中要确保无菌操作，保证自己的菌液不会被污染。
在保菌的时候要控制甘油的浓度在15%~20%之间，甘油浓度太高会诱使菌种产生变异。
诱导剂的量要严格把控，诱导剂的含量过低会使得扩大培养的菌液诱导不充分最后纯化出的蛋白含量低，诱导剂含量过高会使得菌液诱导过度导致最后纯化出的蛋白中含有很多杂蛋白。
配胶的时候玻璃板一定要清洗干净，否则配出的胶会有很多气泡，一定要先配分离胶再配浓缩胶，顺序不能颠倒，配好分离胶后要用蒸馏水或者乙醇液封，保证分离胶上边水平。
染色时开始用快染法发现效果不好，导致蛋白条带不清晰，换用考马斯亮蓝R-250染色会好很多。
在测量酶活的实验过程中发现用溶壁微球菌菌粉配置菌液在后续的测量中会出现菌粉沉降影响实验结果的现象，后来换用LB培养基培养出来的溶壁微球菌菌液再测量的时候测量数值就比较稳定，没有在出现吸光度一直下降的现象。
实验中还发现虽然使用酶标仪测酶活的时候用的蛋白样品比较少且操作简单快捷，但是误差要比分光光度仪的误差大很多。
试验中出现过菌液加入溶菌酶蛋白后吸光度没有下降反而上升的现象，经过思考得知可能是由于自己的蛋白样品浓度较低，而且样品本身也有一定的吸光度，可能是由于一开始加入溶菌酶后溶菌酶与菌液反应时间过短所以导致菌液加入溶菌酶蛋白后吸光度没有下降反而上升，解决方法是把蛋白样品超滤提高样品浓度，并且增加菌液和溶菌酶的反应时间。
这次实验中我学习了很多相关的原理知识，学会了使用高速离心机、超声细胞波破碎仪、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳设备、干式恒温器、漩涡振荡器等之前很少接触到的仪器，也培养了团队协作的能力，更明白了科学研究更重要的是实践和领悟，不能只做试验而不思考，也不么能每天只看文献而不动手去做，应该思考过后再动手去验证自己的想法，这样才能有最大的收获。
溶菌酶的提取和活性测定
实验讲义溶菌酶的提取和活性测定南方医科大学药学院I 溶菌酶的提取和部分纯化【试验目的】掌握根据等电点的差异，用离子交换层析方法进行分离纯化蛋白质。
【试验原理】溶菌酶（lysozyme ）又称胞壁质酶，是一种具有抗菌作用的粘多糖酶，相对分子量为1.44×104，可以催化水解细菌细胞壁N－乙酰胞壁酸和N－乙酰氨基葡萄糖的ß－1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖成份分解成可溶性的糖肽，细菌细胞内容物溢出，使细菌溶解。
溶菌酶广泛存在于动植物中，比如鸡蛋、人的泪液、乳汁等等，其中以鸡蛋清中的含量最高。
下表是鸡蛋清中各种蛋白质的种类、含量和某些特性。
从表中可以看出，蛋清中大部分蛋白质的等电点在6.05以下，只有溶菌酶和卵白素的等电点在10以上，而溶菌酶的含量是卵白素的70倍。
在pH值7.0的缓冲液中，只有溶菌酶和卵白素带正电荷，其他蛋白质带负电荷，因此，可以通过阳离子交换层析，把溶菌酶和其他蛋白质分离，使溶菌酶得到部分纯化。
【仪器、材料和试剂】(一)、仪器分光光度计（二）、材料1、磷酸氢二钠（Na2HPO4）2、磷酸二氢钠（NaH2PO4）3、新鲜鸡蛋4、Amberlite阳离子交换树脂5、氯化钠（三）试剂1、PBS缓冲液：0.10M的磷酸盐缓冲液，pH7.0。
2、杂蛋白洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.05M。
3、溶菌酶洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.5M。
【实验步骤】（一）树脂的再生Amberlite阳离子交换树脂用0.5mol/L NaOH 浸泡30min，水洗至中性；再用0.5mol/L HCl 浸泡30min，水洗至中性。
在PBS缓冲液平衡12小时以上。
（二）蛋清样品的准备市售新鲜鸡蛋3个，破蛋壳取出蛋清，除去黏稠状物体，加入2倍体积的PBS 缓冲液（pH7.0），搅拌均匀。
八层纱布过滤，取30ml澄清液体，其中取0.5mL 置于EP管中，于-20°C冻存备用，标记为样品1。
溶菌酶的提纯结晶和活力测定.实验报告doc
一方面如流行感冒和腺病毒,可能它的蛋白质外壳具有溶菌酶的作用点,现已证明,腺病毒在人体内引起呼吸道炎症,在实验动物中引起肿瘤。因此,用溶菌酶可以治疗呼吸道疾患,抗动物肿瘤。另一方面溶菌酶作用的细菌产物可诱发产生干扰素,而干扰素主要功能是抗病毒。
(3)提高抗菌素疗效
因为抗菌素是微生物合成的代谢产物,通过抑制细菌细胞壁肤聚糖及核酸和蛋白质的合成,影响细胞膜,因而具有抑制或致死其他微生物的作用。而溶菌酶也作用于细胞膜,与抗菌素合用可提高疗效。
（3）本实验的酶活力单位定义为：每分钟A450nm下降0.001为一个活力单位（25℃，pH6.2）
P=(A0-A1)/m ×1000
式中 P：每毫克酶的活力单位（U/mg）；
A0：零时450nm处的吸光度；
A1：1min时450nm处的吸光度；
m：样品的质量（mg）；
1000：0.001的倒数，即相当于除以0.001。
(4)组织修复
一方面酞胺类溶菌酶已证明对细胞的生长、分裂起直接作用.另一方面溶菌酶作用的微生物细胞壁是含氮的多糖(叫粘多糖),它在组织生长和再生过程中起重要作用。日本学者在各种类型伤口的实验鼠中证明了溶菌酶的组织修复和临床治疗作用。
(5)促进血凝
实验证明:糖昔酶作用于鱼(节肢动物甲壳类),其分解产物一脂多糖具有凝胶化作用,通过激活凝血酶原,促进血凝,在人类临床上已用于牙科和泌尿科等小手术止血。
(6)微生物分类上的作用
如果两种不同的微生物细胞壁都能受同一种酶的作用,就说明这两种微生物细胞壁有相同成分,可以此作为微生物分类的依据。
(7)肤聚糖的免疫生物学活性
免疫是机体抵抗一切抗原异物的能力,已知作用于革兰氏阳性细菌上有三种酶:糖昔酶、肤链内切酶和酞胺酶,这些酶在体内或游离在玻璃容器内的检出体外用,会产生不同的免疫效应,其中肤链内切酶产生的胞壁酞二缩氨酸的作用尤为突出。最近日本学者研究发现溶菌酶可作为潜在检测金属免疫毒性的生物标志剂。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告
生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定名称实验目的和要求：实验材料：主要仪器：主要步骤：教师签名：时间：实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
提取溶菌酶实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握溶菌酶的提取和纯化方法。
2. 了解溶菌酶的生物学特性及其应用。
3. 培养实验操作技能，提高实验设计能力。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体中的酶，主要作用于细菌细胞壁的肽聚糖，将其分解，导致细菌细胞壁破裂，从而杀死细菌。
溶菌酶在医药、食品、生物工程等领域具有广泛的应用。
本实验采用鸡卵清为原料，通过提取、分离纯化等方法获得高纯度的溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡卵清、NaCl、醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铵、硫酸铜、氢氧化钠、硫酸锌、硫酸镁、EDTA、SDS、考马斯亮蓝、磷酸缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、分光光度计、电泳仪、凝胶成像系统、磁力搅拌器、超声波破碎仪、低温冰箱、恒温培养箱、移液器、容量瓶、烧杯、试管等。
四、实验步骤1. 溶菌酶粗提取（1）取一定量的鸡卵清，加入适量的磷酸缓冲液（pH 6.0），搅拌均匀。
（2）将混合液置于磁力搅拌器上，搅拌30分钟，使溶菌酶充分释放。
（3）将混合液在低温下（4℃）离心10分钟，取上清液作为粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）将粗提液用硫酸铵进行盐析，使溶菌酶沉淀。
（2）将沉淀用磷酸缓冲液（pH 6.0）溶解，再次离心去除杂质。
（3）将上清液用硫酸铜、氢氧化钠、硫酸锌、硫酸镁、EDTA等试剂进行亲和层析，进一步纯化溶菌酶。
（4）收集纯化后的溶菌酶，用SDS-PAGE进行电泳分析，鉴定溶菌酶的纯度。
3. 溶菌酶活性测定（1）取一定量的溶菌酶溶液，加入等体积的底物溶液，混匀。
（2）在特定波长下，测定溶菌酶催化反应产生的吸光度变化。
（3）根据吸光度变化计算溶菌酶的活力。
4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）将纯化后的溶菌酶进行SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质条带。
（2）通过凝胶成像系统对电泳图谱进行分析，鉴定溶菌酶的纯度。
（3）根据蛋白质分子量标准曲线，计算溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取实验过程中，鸡卵清中的溶菌酶被充分释放，粗提液呈现出淡黄色。
实验溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定报告
2.离子交换填料：
离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。
纤维素 - + —Na 琼脂糖 —O—CH2—COO 葡聚糖
载体 电荷基团 反离子
21
离子交换剂
--带有电荷基团的不溶性载体
CH2CH3
载 -O-CH2CH2N-H Cl体
CH2CH3
Diethylaminoethyl (DEAE)
阴离子交换剂
5. 酶活力及比活性计算：
U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2 C(mg/ml)=A280/13 6. 纯化回收率及纯化倍数计算 US2*V2 US1*V1 S2比活力 S1比活力
回收率＝ 纯化倍数＝
×100％
42
7. 完成下表
样品 S1 S2 体积 ml V1＝ V2＝ 蛋 白 浓 度 总蛋白 mg/ml mg 活力 u/ml 比活力 u/mg 总活力 U 回收率 提 纯 倍 数 % 100 1
10
高速离心机
6000〜 25000
超速离心机
>25000Fra bibliotek离心的形式
角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。
角式由低速到超速均有。
11
角式离心机和离心头（转子）
角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作 注意稳、盖、旋紧。
12
离心管
材质：玻璃， 塑料 强度：和离 心速度相配 大小：和转 子配套 高速超速管 要加盖
称为1标准单位。
2.酶的比活力：
每单位酶蛋白所含的活力单位数。
对固体酶：用活力单位/mg酶蛋白、或活力单位
/mg酶蛋白氮来表示；
对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。
溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取和纯化方法。
2. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定。
二、实验原理溶菌酶是一种胞壁质酶，具有分解细菌细胞壁的能力。
本实验通过提取鸡蛋中的溶菌酶，对其进行分离纯化，并测定其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋- 氯化钠- 醋酸铵- 酒精- 乙醚- 磷酸盐缓冲液- 离心机- 电泳仪- 超声波清洗器- 蛋白质定量仪- 分光光度计2. 实验试剂：- 氯化钠溶液- 醋酸铵溶液- 酒精溶液- 乙醚溶液- 磷酸盐缓冲液- 蛋白酶抑制剂四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取- 将鸡蛋打破，取出蛋黄和蛋白，混合均匀。
- 将混合液用氯化钠溶液调至pH 7.0，室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液，收集滤液。
2. 溶菌酶的分离纯化- 将滤液用醋酸铵溶液调至pH 4.5，室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液，收集滤液。
- 将滤液加入等体积的酒精溶液，室温下静置过夜。
- 用纱布过滤混合液，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤三次，收集洗涤液。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 将洗涤液用超声波清洗器处理30秒，使溶菌酶充分溶解。
- 用分光光度计测定洗涤液的蛋白浓度。
- 将洗涤液稀释适当倍数，进行酶活力测定。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 将洗涤液进行SDS-PAGE电泳，比较样品与标准蛋白的迁移率。
- 根据迁移率计算溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取- 滤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从鸡蛋中提取出来。
2. 溶菌酶的分离纯化- 酒精沉淀法可以有效地将溶菌酶与其他蛋白分离。
- 洗涤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从沉淀中分离出来。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 洗涤液的蛋白浓度为1.5mg/mL。
- 酶活力为100 U/mL。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 电泳结果显示，样品与标准蛋白的迁移率一致，说明溶菌酶已达到纯化。
溶菌酶的提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取方法。
2. 掌握溶菌酶的分离纯化技术。
3. 了解溶菌酶的性质及其应用。
二、实验原理溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的胞壁质酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖的活性。
本实验通过利用溶菌酶在特定条件下的溶解度差异，对其进行提取、分离和纯化，并对其性质进行初步研究。
三、实验材料1. 鸡蛋2. 醋酸3. 硫酸铵4. 氯化钠5. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）6. 透析袋7. 旋转蒸发仪8. 超速离心机9. 分光光度计10. 紫外-可见光分光光度计四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）将鸡蛋打破，取蛋清，加入适量的醋酸，搅拌均匀，室温下静置30分钟。
（2）用滤纸过滤混合液，收集滤液。
（3）向滤液中加入硫酸铵，使蛋白质盐析，室温下静置30分钟。
（4）用滤纸过滤沉淀，收集滤液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）向滤液中加入适量的氯化钠，使蛋白质复溶，室温下搅拌30分钟。
（2）用透析袋将溶液进行透析，去除小分子物质。
（3）将透析后的溶液进行超速离心，收集沉淀。
（4）向沉淀中加入适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0），使蛋白质复溶。
（5）用旋转蒸发仪将溶液浓缩至一定体积。
3. 溶菌酶性质研究（1）测定溶菌酶的蛋白浓度。
（2）测定溶菌酶的酶活性。
（3）测定溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取通过实验，成功从鸡蛋清中提取出溶菌酶，得到淡黄色的粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化通过盐析、透析和超速离心等步骤，成功将溶菌酶从粗提液中分离纯化，得到淡黄色的纯化液。
3. 溶菌酶性质研究（1）蛋白浓度：根据比色法测定，溶菌酶的蛋白浓度为1.5 mg/mL。
（2）酶活性：根据溶菌酶对革兰氏阳性菌的溶解作用，测定酶活性为100 U/mL。
（3）分子量：根据SDS-PAGE电泳结果，溶菌酶的分子量为14.3 kDa。
六、实验讨论1. 本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的来源，具有良好的可行性和经济性。
2. 在溶菌酶的提取过程中，醋酸和硫酸铵的加入有助于提高溶菌酶的提取率。
溶菌酶的结晶实验报告
一、实验目的1. 掌握溶菌酶的提取和纯化方法。
2. 学习溶菌酶的结晶技术。
3. 鉴定溶菌酶的纯度和分子量。
二、实验原理溶菌酶是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
本实验采用硫酸铵盐析法从鸡蛋清中提取溶菌酶，通过调节溶液的pH值和离子强度，使溶菌酶在适宜条件下结晶。
三、实验材料1. 鸡蛋清2. 硫酸铵3. 氯化钠4. 乙二胺四乙酸（EDTA）5. 考马斯亮蓝G-2506. 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0）7. 紫外可见分光光度计8. 离心机9. 实验室用具：烧杯、移液管、滴定管、玻璃棒、滤纸等四、实验步骤1. 溶菌酶的提取（1）取一定量的鸡蛋清，加入适量的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）进行稀释。
（2）将稀释后的鸡蛋清溶液置于4℃冰箱中过夜。
（3）次日，取上清液，加入适量的硫酸铵，使硫酸铵浓度达到50%。
（4）充分搅拌，使溶菌酶沉淀。
（5）离心，收集沉淀，并用适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤沉淀。
2. 溶菌酶的纯化（1）将洗涤后的沉淀溶解于适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。
（2）加入适量的EDTA，使EDTA浓度达到0.5mol/L。
（3）用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度。
（4）将溶液加入适量的氯化钠，使氯化钠浓度达到0.5mol/L。
（5）调节溶液的pH值至6.0，观察溶菌酶的溶解情况。
3. 溶菌酶的结晶（1）将纯化后的溶菌酶溶液置于4℃冰箱中过夜。
（2）次日，观察溶菌酶结晶情况。
（3）收集结晶，并用适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤结晶。
4. 溶菌酶的鉴定（1）采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度。
实验三_溶菌酶的提取和结晶
实验三溶菌酶的提取和结晶一、实验目的学习从鸡蛋清中提取和纯化溶菌酶的方法。
二、实验原理溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。
活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。
在280nm的消光系数[ ]为13.0。
该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。
三、实验器材仪器：冰箱，pH计，pH试纸，冷冻离心机，恒温培养箱，恒温摇床，分光光度计，水浴锅，滤网（150目），滤纸，电子天平，漏斗，移液器。
试剂：新鲜鸡蛋清，1mol/L NaOH，溶菌酶，5%NaCl,无水丙酮四、实验步骤（1）选择新鲜鸡蛋，蛋清的PH值不能低于8.0。
（2）清洗：用水洗掉蛋壳表面的不洁之物。
（3）破壳分离蛋清。
（4）鸡蛋清均质：搅拌10 分钟，将蛋清搅拌稠度均匀即可，以不引起泡沫为宜，防止蛋白质变性。
（5）过滤：用3 层纱布将稠度均匀的蛋清液过滤，滤去残存的蛋壳及卵带。
（6）加盐：搅拌下，向蛋清液中缓缓加入5%（100ml蛋清中加入5g氯化钠）氯化钠细粉，加料速度以氯化钠及时溶解为宜。
（7）结晶：用1M 氢氧化钠溶液调PH 至9.5-10.0，边加边搅拌均匀，避免过碱引起蛋白质变性。
溶菌酶的提取纯化及纯度测定
溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定实验者：钟吴宇豪绿药1501班 201530360127 同组者：连学帆韩家鑫实验地点：东配302 实验日期：2017年5月26日-5月27日报告完成日期：2017年5月28日指导老师：易喻【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质，工业上通常以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得到，在医学及食品商具有广泛应用。
本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取，然后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白，提纯所得的溶菌酶粗品，并且通过紫外分光光度计检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定，确认得到了纯化倍数较高但产率较低的溶菌酶产品。
Lysozyme is a protein of bacterial cell wall hydrolysis ability, the industry usually with egg white as raw material, 732 exchange resin adsorption with weakly acidic cation under the condition of pH6.5, with ammonium sulfate was dialyzed after freeze drying, is widely used in medicine and food business. In this paper we by isoelectric point precipitation method for crude extraction of lysozyme, followed by ion exchange chromatography to remove impurity protein, lysozyme crude purified, and the measured absorbance of the purity and yield of the final product identification of UV spectrophotometry, confirmed the purification factor was high but low yield the lysozyme product.【关键词】溶菌酶，等电点沉淀法，离子交换层析，酶活，提纯【引言】对溶菌酶的研究始于20 世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。
溶菌酶蛋白结晶实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取和纯化方法。
2. 掌握溶菌酶蛋白结晶技术。
3. 了解结晶样品的鉴定和表征。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于人体和动物组织中的碱性蛋白质，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
本实验通过从鸡蛋清中提取溶菌酶，并利用硫酸铵盐析法进行纯化，最后采用硫酸铵饱和溶液进行蛋白结晶。
三、实验材料与仪器1. 材料：鸡蛋清、硫酸铵、氯化钠、氢氧化钠、硫酸铜、硝酸银、无水乙醇、正己烷等。
2. 仪器：冰箱、离心机、超速离心机、紫外-可见分光光度计、显微镜、结晶棒、玻璃棒等。
四、实验步骤1. 溶菌酶提取（1）取新鲜鸡蛋清，用无菌生理盐水稀释10倍，混匀。
（2）取稀释后的鸡蛋清溶液，加入1/10体积的1.0 mol/L氢氧化钠溶液，搅拌均匀。
（3）室温下静置1小时，使蛋白质充分溶解。
（4）将溶液转移至离心管中，以4 000 r/min离心10分钟，取上清液。
2. 溶菌酶纯化（1）取上清液，加入1/5体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀。
（2）室温下静置30分钟，使蛋白质充分沉淀。
（3）以4 000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（4）将沉淀用少量蒸馏水溶解，加入1/10体积的1.0 mol/L氢氧化钠溶液，搅拌均匀。
（5）加入1/5体积的饱和硫酸铵溶液，重复上述步骤，以去除杂质。
3. 溶菌酶结晶（1）取纯化后的溶菌酶溶液，加入1/5体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀。
（2）室温下静置30分钟，使蛋白质充分沉淀。
（3）以4 000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（4）将沉淀用少量蒸馏水溶解，加入1/5体积的硫酸铵饱和溶液，搅拌均匀。
（5）将溶液转移至结晶棒上，置于冰箱中过夜。
4. 结晶样品鉴定（1）取结晶样品，加入少量无水乙醇，观察其溶解性。
（2）取结晶样品，加入少量硝酸银溶液，观察其反应。
（3）取结晶样品，加入少量硫酸铜溶液，观察其反应。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶提取：成功从鸡蛋清中提取出溶菌酶，紫外-可见分光光度计检测结果显示蛋白质含量约为1.0 mg/mL。
药用溶菌酶提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握药用溶菌酶的提取方法。
2. 了解溶菌酶的性质及其在医药领域的应用。
3. 通过实验操作，提高实验技能和科学思维。
二、实验原理溶菌酶是一种能够水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶，具有广谱抗菌作用。
本实验采用酶法提取药用溶菌酶，通过优化提取条件，提高溶菌酶的提取率和纯度。
三、实验材料与仪器材料：1. 鸡蛋（新鲜）2. 0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0）3. 1mol/L的NaCl溶液4. 5mol/L的醋酸溶液5. 95%乙醇6. 10%的硫酸铵溶液7. 0.1%的吐温-80溶液8. 2%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液仪器：1. 研钵2. 电子天平3. 电动搅拌器4. 离心机5. 超声波清洗器6. 药用溶菌酶纯度鉴定仪7. 分光光度计四、实验步骤1. 粗提取1. 将新鲜鸡蛋打入烧杯中，加入等体积的0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0），充分搅拌。
2. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质充分溶解。
3. 将混合液以3000r/min离心10分钟，取上清液即为粗提取液。
2. 分离纯化1. 向粗提取液中加入等体积的1mol/L的NaCl溶液，充分搅拌，使蛋白质盐析。
2. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质沉淀。
3. 将混合液以3000r/min离心10分钟，取沉淀。
4. 向沉淀中加入5mol/L的醋酸溶液，使蛋白质溶解。
5. 向溶液中加入95%乙醇，使蛋白质沉淀。
6. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质沉淀。
7. 将混合液以3000r/min离心10分钟，取沉淀。
8. 向沉淀中加入10%的硫酸铵溶液，使蛋白质沉淀。
9. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质沉淀。
10. 将混合液以3000r/min离心10分钟，取沉淀。
11. 向沉淀中加入0.1%的吐温-80溶液，使蛋白质溶解。
12. 向溶液中加入2%的PVP溶液，使蛋白质沉淀。
13. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质沉淀。
溶菌酶分离技术实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握溶菌酶的提取和分离纯化方法。
2. 了解溶菌酶的生物学特性及其应用。
3. 熟悉实验室基本操作，提高实验技能。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖结构，导致细胞壁破裂而使细菌死亡的作用。
本实验通过提取鸡蛋清中的溶菌酶，运用盐析、透析、凝胶过滤等方法对其进行分离纯化，并测定其酶活性。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 鸡蛋清- 盐酸、氢氧化钠、硫酸铵、氯化钠、硫酸铜、氢氧化钠、乙醇、丙酮、乙醚等- 溶菌酶标准品- 酶活性测定试剂盒2. 仪器：- 电子天平- 恒温水浴锅- 离心机- 漏斗、滤纸、烧杯、量筒、移液管、滴定管等- 紫外分光光度计- 显微镜四、实验步骤1. 溶菌酶粗提取（1）取新鲜鸡蛋清10g，加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
（2）加入10ml 0.1mol/L盐酸，调节pH至4.5。
（3）室温下搅拌30min，使溶菌酶充分溶解。
（4）加入10g硫酸铵，搅拌溶解，静置过夜。
2. 溶菌酶分离纯化（1）取沉淀物，加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
（2）加入10ml 0.1mol/L氢氧化钠，调节pH至7.0。
（3）透析：将溶液置于透析袋中，放入500ml蒸馏水中，室温下透析过夜。
（4）凝胶过滤：将透析后的溶液上柱，柱材料为Sephadex G-25，洗脱液为0.05mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）。
（5）收集洗脱峰，用乙醇沉淀，室温下静置过夜。
（6）离心，收集沉淀物，加入适量蒸馏水溶解。
3. 溶菌酶酶活性测定按照酶活性测定试剂盒说明书进行操作，测定溶菌酶的酶活性。
4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）SDS-PAGE电泳：将分离纯化的溶菌酶样品与蛋白质marker混合，进行SDS-PAGE电泳。
（2）凝胶成像分析：用凝胶成像仪观察电泳结果，计算溶菌酶的纯度。
（3）分子量测定：将溶菌酶样品与蛋白质marker混合，进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白质marker的分子量计算溶菌酶的分子量。
溶菌酶的提取,分离纯化,产物纯度鉴定及活性测定精选全文
可编辑修改精选全文完整版溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定实验目的：1、学习和掌握溶菌酶的制备过程2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度5、测定所提取的溶菌酶的活性试验原理：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。
可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
2.1、离子交换层析离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。
离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。
由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。
该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。
实验溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定报告
13
离心机操作
平衡、定温、定速、定时。
14
实验一、 溶菌酶的粗提取——略
15
酶精纯化常用技术
透析
膜分离技术
超滤
凝胶过滤（分子筛/排阻）层析 离子交换层析 疏水层析 吸附层析
柱层析技术
亲和层析
蛋白质结晶
反相层析
16
Principles of Operation for Chromatography Techniques
45
1.原理
SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合
后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因
而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白 质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋 白质分子量成正比。
10
高速离心机
6000〜 25000
超速离心机
>25000
离心的形式
角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。
角式由低速到超速均有。
11
角式离心机和离心头（转子）
角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作 注意稳、盖、旋紧。
12
离心管
材质：玻璃， 塑料 强度：和离 心速度相配 大小：和转 子配套 高速超速管 要加盖
实验1-3 溶菌酶的提取分离及鉴定 （酶活力、纯度及分子量测定）
1
实验内容
1. 溶菌酶的粗提取 2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定 3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定
2
背景知识
溶菌酶（lysozyme）：胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质
溶菌酶实验报告
1. 学习溶菌酶的提取方法；2. 掌握溶菌酶的分离纯化技术；3. 了解溶菌酶活性的测定方法；4. 熟悉实验操作及数据处理。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于动物、植物和微生物细胞中的胞壁质酶，能够特异性地水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质，从而破坏细菌细胞壁，导致细菌死亡。
本实验通过提取、分离纯化溶菌酶，并测定其活性，以了解溶菌酶的性质和应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋- 酶解缓冲液- 离心机- 超声波清洗器- 萤光分光光度计- 玻璃器皿2. 实验试剂：- 酶解缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0）- 氯化钠- 磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0）- 标准溶菌酶溶液- 破菌剂1. 溶菌酶的粗提取- 将鸡蛋打破，取出蛋黄，加入适量的酶解缓冲液，搅拌均匀； - 将混合液用超声波清洗器处理5分钟，使溶菌酶充分释放；- 将处理后的混合液离心（3000r/min，10分钟）；- 取上清液，即得溶菌酶粗提液。
2. 溶菌酶的分离纯化- 将溶菌酶粗提液加入适量的氯化钠，使蛋白质沉淀；- 将沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，调节pH至7.0；- 将溶液离心（3000r/min，10分钟）；- 取上清液，即为分离纯化的溶菌酶。
3. 溶菌酶活性的测定- 将分离纯化的溶菌酶溶液用磷酸盐缓冲液稀释至一定浓度；- 准备标准溶菌酶溶液，以确定溶菌酶活性；- 取一定量的稀释后的溶菌酶溶液，加入破菌剂，观察破菌效果； - 通过比较不同浓度溶菌酶溶液的破菌效果，计算溶菌酶活性。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取- 超声波处理后的混合液呈现乳白色，说明溶菌酶已充分释放； - 离心后，上清液中含有溶菌酶，下清液中含有蛋白质等杂质。
2. 溶菌酶的分离纯化- 加入氯化钠后，蛋白质沉淀；- 调节pH后，蛋白质溶解，溶菌酶得到纯化。
3. 溶菌酶活性的测定- 通过比较不同浓度溶菌酶溶液的破菌效果，得出溶菌酶活性为XX U/mg。
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8.底物悬液：溶菌小球菌（Micrococcus lysodeik Licus）的细胞壁
三、实验步骤
1．底物悬液的制作
将菌种接种于液体培养基扩大培养（28℃,24h），离心（4000rpm，20min），倾去上清液，沉淀为菌体。加入少量蒸馏水，用玻璃棒搅成悬液，离心，倾去上清液，如此反复洗涤菌体数次，最后用少量蒸馏水制成悬液，冷冻干燥。亦可将菌体铺于玻板上吹干，刮下，置干燥器中。
活力测定的基本原理是用一种细菌悬液作为基质,加入待测标本后保持一定时间,如样品中含有溶菌酶则细菌被溶解,即其细胞壁不溶性多糖变成可溶性粘肤。测定方法很多:如平皿测定法、光电比浊法、粘度测定法、分解产物测定法(因为底物往往过量,通常不用底物)、化学滴定法、分光光度法及同位素技术,其中以平皿测定法和比浊法最为常用。
(6)微生物分类上的作用
如果两种不同的微生物细胞壁都能受同一种酶的作用,就说明这两种微生物细胞壁有相同成分,可以此作为微生物分类的依据。
(7)肤聚糖的免疫生物学活性
免疫是机体抵抗一切抗原异物的能力,已知作用于革兰氏阳性细菌上有三种酶:糖昔酶、肤链内切酶和酞胺酶,这些酶在体内或游离在玻璃容器内的检出体外用,会产生不同的免疫效应,其中肤链内切酶产生的胞壁酞二缩氨酸的作用尤为突出。最近日本学者研究发现溶菌酶可作为潜在检测金属免疫毒性的生物标志剂。
（4）结晶用布氏漏斗滤得，用0℃丙酮洗涤数次，置真空干燥器干燥。
3.活力测定
（1）酶液的制备：准确称取干酶粉5mg，用0.1mol/L pH6.2磷酸缓冲液溶解成1mg/ml酶液。用时稀释20倍，则每毫升酶液酶量为50ug。
（2）将酶液和底物悬液分别置25℃水浴中保温10-15min，然后吸底物悬液3.0ml置比色杯中，比色测定A450nm，此为零时读数。然后加入酶液0.2ml（10ug酶），迅速摇匀，从加入酶计时，每隔30s测一次A450nm，共测3次。
2.实验目的
学习溶菌酶的提纯方法和酶活力的测定
3.实验原理
鸡蛋清内含有丰富的溶菌酶（lysozyme），向蛋清中加入一定量的中性盐，并调节pH至溶菌酶的等电区，溶菌酶即可结晶析出。如结晶不纯，可重结晶。
溶菌酶之所以溶菌，是因为它能催化革兰氏阳性细菌细胞壁黏多糖水解。测定溶菌酶活力，可用某些细菌细胞壁作底物，以单位时间内被它水解的细胞壁的量表示酶活力的大小。
(l)抗菌
溶菌酶不但作用于革兰氏阳性细菌,而且它作为一种非特异性免疫,即对所有的病原微生物都有一定程度的抵抗力,没有特殊的选择性,对身体的自然防御起很大作用.如鼻粘膜,口腔中含有一些溶菌酶,临床用于治疗副鼻窦炎和龋齿;眼泪和白血球中溶菌酶含量最高,因此在干燥综合症诊断上,认为泪液溶菌酶值的下降可以提供敏感可靠的指标,并能反映泪腺受损程度;在白血病患者的尿中,含有大量溶菌酶,临床上可有效地诊断白血病。白血球中的溶菌酶在脱颗粒过程中被排列到噬菌体内,噬菌体感染宿主(抗原)后,诱导产生溶菌酶(抗体),这种溶菌酶是噬菌体染色体组,通过细胞壁分解酶和膜多糖分解酶的作用而表现,其主要功能一是使噬菌体产生吸附作用,二是使噬菌体向宿主菌体内注入DNA,溶菌酶在噬菌体侵入宿主菌细胞和溶菌的整个过程中都起着重要作用,此溶菌酶(抗体)和补体共同作用,使某些微生物敏感,因此,溶菌酶可能和噬菌体内其他抗微生物系统有协同作用,主要作用是消化细菌,而不是杀死细菌。普遍认为,这种白细胞具有抗肿瘤作用和治疗由细菌、病毒引起的炎症。以上这种抗原—抗体反应也可以在体外进行溶菌反应,即血清学反应,可解析细菌表层结构和作为研究分子生物学的材料,通过它寻找新酶类,也可用做病毒性传染病的诊断。
取干菌粉5mg，置匀浆器中，加入少量pH6.2磷酸缓冲液，研磨数分钟，倾出，用少量缓冲液洗匀浆器，一并稀释至20-25ml。比色测定A450nm 。此悬液吸光度应在0.5-0.7范围内。
2.溶菌酶的提纯结晶
（1）将2只鸡蛋的蛋清置于小烧杯中（蛋清pH不得低于8.0），慢慢搅拌数分钟，使蛋清稠度均匀，然后用两层纱布滤去卵带或碎蛋壳，量记蛋清体积。
（3）本实验的酶活力单位定义为：每分钟A450nm下降0.001为一个活力单位（25℃，pH6.2）
P=(A0-A1)/m ×1000
式中 P：每毫克酶的活力单位（U/mg）；
A0：零时450nm处的吸光度；
A1：1min时450nm处的吸光度；
m：样品的质量（mg）；
1000：0.001的倒数，即相当于除以0.001。
(4)组织修复
一方面酞胺类溶菌酶已证明对细胞的生长、分裂起直接作用.另一方面溶菌酶作用的微生物细胞壁是含氮的多糖(叫粘多糖),它在组织生长和再生过程中起重要作用。日本学者在各种类型伤口的实验鼠中证明了溶菌酶的组织修复和临床治疗作用。
(5)促进血凝
实验证明:糖昔酶作用于鱼(节肢动物甲壳类),其分解产物一脂多糖具有凝胶化作用,通过激活凝血酶原,促进血凝,在人类临床上已用于牙科和泌尿科等小手术止血。
溶菌酶的提纯结晶和活力测定
姓名： 学号：
班级： 指导老师：
一、实验前言
1.实验背景
溶菌酶（lysozyme）是一种能够水解细胞壁成分中N- 乙酰胞壁酸与N- 乙酰葡萄糖胺之间的β- 1，4 糖苷键的酶，被广泛应用于医药、食品工业、生物工程等方面，现从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶已达到工业化生产水平。蛋清中的溶菌酶含量越高，酶活力越强，越有利于鸡蛋的保存，因此测定鸡蛋蛋清中的溶菌酶对我国溶菌酶生产、禽蛋产品加工有重要的指导作用，也为蛋品质评定提供了一个重要参数。
(8)在分子遗传学方面的研究进展
搞清溶菌酶基因的结构、诱导、表达及定位,对于开发和利用溶菌酶起很重要的作用,这正是现代分子生物学的发展方向。美国学者〔,3,研究昆虫的溶菌酶基因的结构和诱导,用CDNA进行Norhtern杂交证明脂肪含量最高。还有学者〔,们搞清了水牛中溶菌酶基因的染色体定位。美国学者还在转基因鼠乳腺中成功地表达了人溶菌酶mRNA。
四、实验结果分析
1.晶形
2.比色测定结果
五、注意事项
1.鸡蛋清的搅拌速度切忌不能起泡，搅拌方向不得改变，搅棒应光滑，这些都是防止蛋白变性的措施。
2.氯化钠细粉应慢慢加入，并边加边搅，防止因局部盐浓度过高而产生大量白色沉淀。
3.调pH时，氢氧化钠应随加随搅匀，避免局部过碱。
4.底物悬液中加入酶液后应迅速摇匀并从加入酶液开始计时。
二、主要仪器设备及试剂
1.主要仪器设备
可见分光光度计 离心机
恒温水浴锅 匀浆器
烧杯 布氏漏斗
真空干燥器 纱布
吸管 量筒
抽滤瓶 电子天平
2.主要试剂
1.氯化钠（C.P）：应研细
2.五氧化二磷
3.1mol/L NaOH溶液
4.丙酮（无水，C.P）Байду номын сангаас
5.0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.2）
6.溶菌酶晶种
六、参考文献
1.《溶菌酶的提纯结晶和活力测定》ppt
2.《溶菌酶及其应用》——张秀华王琳
3.《测定鸡蛋蛋清中溶菌酶含量和活力标准方法的建立》——侯启瑞，王金玉，谢凯舟，戴国俊，刘大林（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009）
七、致谢
感谢组员的配合和老师的指导
总之,溶菌酶是研究细胞学、生物化学、微生物学、遗传学、医学、药学、卫生学等方面的一种重要的水解酶。
对溶菌酶的研究始于20 世纪初，英国细菌学家弗莱明在1922 年发现人的鼻涕、唾液、眼泪有强大的溶菌活性，并把其溶菌作用的因子命名为溶菌酶。此后研究者在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在，其中鸡蛋蛋清的溶菌酶含量最高（约含0.3%）。鸡蛋蛋清已成为溶菌酶生产的主要原料，但是蛋清中溶菌酶的定量测定还没有一个较便捷的方法，传统的方法是先提取蛋清中的溶菌酶，再测定提取液中的蛋白含量。由于不可能完全提取出蛋清中的溶菌酶，这种方法计算出的蛋清溶菌酶含量往往比实际的数值小。溶菌酶活力的测定方法很多，目前，国内常用的有琼脂板扩散法、比色法、高效液相色谱法等，而国外多用比浊法测定溶菌酶活力。测定鸡蛋蛋清中的溶菌酶含量的传统途径是先提取再测定，从蛋清中分离纯化溶菌酶已有不少报道，虽然正交试验的酶回收率可达94%，但是再精确的提取途径也无法完全提取出蛋清中的溶菌酶。
溶菌酶分布很广,而且不是单独存在的,往往是和许多因子共同作用、相互协调。同时,可以直接或间接地通过酶的分解产物而起作用。在这里许多问题正处于摸索阶段,有些方面通过特定的实验,预测其应用。而这些特定的实验往往对某种或某一个动物而言,还有其局限性。未定论的问题很多,许多应用尚未大面积使于临床,但是溶菌酶必将越来越引起人们的重视,特别是其广布于人体,在医药、科研方面的作用尤为重要.
(2)抗病毒
一方面如流行感冒和腺病毒,可能它的蛋白质外壳具有溶菌酶的作用点,现已证明,腺病毒在人体内引起呼吸道炎症,在实验动物中引起肿瘤。因此,用溶菌酶可以治疗呼吸道疾患,抗动物肿瘤。另一方面溶菌酶作用的细菌产物可诱发产生干扰素,而干扰素主要功能是抗病毒。
(3)提高抗菌素疗效
因为抗菌素是微生物合成的代谢产物,通过抑制细菌细胞壁肤聚糖及核酸和蛋白质的合成,影响细胞膜,因而具有抑制或致死其他微生物的作用。而溶菌酶也作用于细胞膜,与抗菌素合用可提高疗效。
（2）按100ml蛋清加5g氯化钠的比例，向蛋清内慢慢加入氯化钠细粉，边加边搅，使氯化钠及时溶解，避免氯化钠沉于容器底部，否则将因局部盐浓度过高而产生大量白色沉淀。
（3）加完氯化钠，用1mol/L NaOH调节pH至9.5-10.0，随加随搅匀，避免局部过碱。加入少量溶菌酶结晶作为晶种，4℃放置数天。当肉眼观察有结晶形成后，吸取晶液一滴，置载玻片上，用显微镜观察（100×），记录晶形。