拟南芥雄性不育突变体ms1502的遗传及定位分析

拟南芥雄性不育突变体ms1502的遗传及定位分析

易君,高菊芳,张在宝,江华,周根余,杨仲南,张森

(上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234)

摘要:通过EMS诱变、背景纯化与遗传分析,从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中筛选到了一棵隐性单基因控制的雄性不育突变体ms1502。细胞学观察发现,突变体在小孢子从四分体释放出后花药绒毡层过早衰亡,小孢子的内容物不正常地凝聚,最终无法形成正常的花粉粒。利用图位克隆的方法对该基因MS1502进行了定位,结果表明MS1502位于第4条染色体上分子标记F25I24和T12H20之间105kb区间内。目前该区间内尚未见到花药发育必需基因(不育基因)的报道,因此MS1502是一个控制花粉发育的新基因。

关键词:拟南芥;花药发育;雄性不育突变体;图位克隆

中图分类号:Q943文献标识码:A文章编号:0253-2700(2006)03-283-06

Genetic and Mapping Analysis of Arabidopsis thaliana Male

Sterile Mutant ms1502(Cruciferae)*

YI Jun,GAO Ju-Fang,ZHANG Zai-Bao,JIANG Hua,ZHOU Gen-Yu,

YANG Zhong-Nan,ZHANG Sen**

(Life and Environment Science College,Shanghai Normal University,Shanghai200234,China)

Abstract:Molecular and genetic characterizations of mutants have led to a better understanding of many developmental processes in the model system Arabidopsis thaliana.However,the anther and pollen development that is specific to plants has been little studied.A large-scale screening of mutants with male sterility was performed in this study to dissect geneti-cally the anther and pollen development.An independent mutant line of male sterility controlled by a novel nuclear gene, designated MS1502,was generated and identified by ethyl-methae sulfonate(EM S)mutagenesis and genetic analysis. Genetics analysis indicated that the mutant was controlled by a single recessive gene MS1502.The phenotypic analysis in-dicated the MS1502gene plays important role during anther and pollen development.Cytological analysis showed that an-ther tapetum of mutant degenerated earlier that of wild type after microspores were released fro m the tetrads,and that cyto-plasm of microspores in mutant condensed abnormally,resulting in that mutant plant cannot produce viable pollens.With the further genetic analysis and the map-based cloning of gene MS1502,we have mapped it to a region of105kb between the molecular markers F25I24and T12H20on chromoso me4using map-based cloning technique.

Key words:Arabidopsis thaliana;Pollen development;Male sterile mutant;Map-based cloning

拟南芥(Arabidopsis thaliana)具有生长周期短,基因组较小的优势,因此成为了目前进行植物基因功能研究的一种重要的模式植物(黄娟和李家洋,2001)。花药及花粉的发育是植物功能基因研究的一个重要方向,花药及花粉发育异常通常会导致雄性不育。这种雄性不育现象大多与花药形态、体细胞与生殖细胞的发育、小孢子发生、花粉发育、花药的开裂、花粉粒的功能等相

云南植物研究2006,28(3):283～288

Acta Botanica Yunnanica

通讯作者:Author for correspondence.E-mail:senzhang@

收稿日期:2005-11-28,2006-02-13接受发表

作者简介:易君(1980-)女,在读硕士研究生,主要从事植物基因功能的研究工作。

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30470170),科技部重大基础研究前期研究专项(973预研)(2003CCA01100)

关(Sanders等,1999)。

在高等开花植物中,花粉花药发育是个复杂的过程,正常的花药和花粉发育过程包括14个时期,每个时期都有其特征性的细胞事件发生,这14个时期又被分为4个阶段(Sanders等, 1999)。许多的研究已经描述了花药和花粉发育过程(McConn and Browse,1996;Ishiguro等, 2001;Stintzi and Browse,2000;Sanders等, 2000;Park等,2002;Yang等,1999;Schiefthal-er等,1999;Sorensen等,2003;Sabine等, 2003;Zhao等,2002;Yang等,2003)。第1个阶段中,在花药原基中进行了细胞分裂从而形成花药全部组织;第2个阶段,小孢子母细胞经过减数分裂形成了含有小孢子的四分体,随后小孢子从四分体中释放出来;第3个阶段中,小孢子发育成含有三细胞的花粉粒;第4个阶段,成熟花粉释放。

在花粉发育的第3个阶段(9～12期),花药继续扩大,小孢子从四分体中释放以后,开始形成外壁并且细胞核从中央移到与花粉萌发孔相对的细胞边缘位置。随着小孢子的生长,其细胞质发生液泡化,逐渐形成一个大液泡,并把细胞质挤压到与萌发孔相对的一个小区域内。随后花粉开始进行不对称有丝分裂,产生两个命运不同的细胞、其中体积大的是营养细胞,另一个体积小的为生殖细胞,生殖细胞之后会嵌人营养细胞的细胞质中。与此同时,绒毡层细胞开始衰退,随后药室内壁与连接层细胞开始纤维增厚、衰退,第12期时绒毡层细胞完全降解并且隔膜细胞开裂,花药分为两个药室(Bedinger,1992)。在已研究发表的雄性不育基因中,DEX1、NEF1、MS2、MS1等基因都在这一时期表达。其中DEX1和花粉初生壁的积累有关(Paxson-Sowders 等,2001),NEF1调控脂类和花粉外壁的形成(Ariizumi等,2004),MS2的编码产物主要与雄配子体的发育有关(Aarts等,1997),而MS1 (Wilson等,2001)则同时调控雄配子体和花药的发育。然而,在花粉发育的这一阶段这些突变体并没有出现绒毡层过早衰退从而导致小孢子发育异常的现象。

本文通过EMS(ethyl-methae sulfonate)诱变处理野生型拟南芥群体,分离得到一棵雄性不育株ms1502。遗传分析表明该突变体的性状是单个隐性基因控制的。该突变体花药发育的细胞学观察表明,突变体花药绒毡层提早衰退,导致小孢子发育异常,最终不能形成正常的花粉粒。为了进一步研究ms1502突变体的雄性不育现象并最终克隆该基因,我们利用图位克隆的方法对突变基因进行了定位。结果表明,MS1502基因位于第4条染色体分子标记T12H20和F25I24之间105kb的区间内。这些结果为基因的克隆及研究功能奠定了基础。

1材料与方法

1.1植物材料

拟南芥(Aarbidopsis thaliana)分别以Landsberg erecta (Ler)和Columbia(Col)为遗传背景。种子播种于用PNS (Plant Nutrition Solution)培养液(Estelle and So merville, 1987)浸湿的蛭石中。置于人工培养室中培养,培养条件,20～22℃,16h光照,8h黑暗,光照强度120 molm-2s-1(Zhang等,2003)。突变体已经和野生型(Ler)回交了3次。

1.2方法

1.2.1遗传分析以野生型Ler为父本,突变体为母本进行杂交得到F

1

代,F

1

代自交得到F

2

代。种植F

2

代,观察F2代表型,统计F2代中可育植株与不育植株的比例。

1.2.2雄性不育基因的定位收集用野生型(Col)作为父本与突变体杂交所得到的F2遗传群体中的突变体用于基因定位。随机选10个样品分别提取D NA然后取等量混合,构建一个D NA池,用5个D NA池为模板,用覆盖基因组的20对分子标记(表1)进行PCR扩增,同时扩增两野生型Ler和Col D NA作为对照,通过凝胶电泳分析可以看出,与突变基因连锁的分子标记所扩出的条带的遗传背景偏向突变体来源的亲本Ler,而用于杂交的另一亲本Col条带没有或弱于对照。一旦找到了连锁的分子标记,就在该分子标记附近设计新的分子标记(表2),用高通量提取DNA的方法(Xin等,2003)提取

大批F

2

遗传群体中突变单株DNA,对这些植株进行基因型分析,对目的基因进行精细定位。

1.2.3DNA提取拟南芥基因组DNA的提取参照Sun 等(2000)的方法。

1.2.4PCR反应PCR反应参照Sun等(2000)的方法,其中有几个分子标记是不同的(表1)。其中分子标记nga111,nga6,nga8和nga139已经发表(Bell and Ecker, 1994),其余分子标记的设计是根据网站w 上公布的拟南芥基因组多态性数据库,采用软件Primer5.0操作的。用2.5%的琼脂糖凝胶进行电

482云南植物研究28卷