蛋白质分离与纯化技术

化工学院生物工程一班胡冠南 3010207234

蛋白质分离与纯化技术

蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。所以研究蛋白质的结构与功能是研究生物科学的基础。蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。由于深入研究蛋白质的结构与功能需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业中的核心技术。然而该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。所以对该项技术的改良与创新在实际应用中具有重要意义。

一．蛋白质分离的准备

从正常生物基质中提取各种蛋白质均需要有特定的条件。如果不能满足这一条件，蛋白将很快失去生物学活性，其生物半衰期也将迅速降低。因此，在蛋白质的特性研究中，确定提取条件是一个关键问题。在不同的实验中所通到的困难各不相同，有的困难是如何抵抗外源性蛋白酶的作用而维持蛋白质的稳定，在有些实验中的困难是如何维持酶的活性。在不同的实验中要针对不同的情况来解决不同的问题。然而对蛋白质研究而言却有着一些共同的参数。缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变，选择合适的缓冲液对于维持—定pH 值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要。pH和pKa是描述缓冲液的两个重要概念。pH值是指溶液中氢离子浓度的负对数，pH＝-log(H+)。 pKa值是溶液中酸解离常数的负对数值。溶液的pH值与pKa值越接近表明溶液的缓冲能力越强，离pKa值越远则缓冲能力越弱。

表1 常用缓冲液的pKa值

a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-吗啉代）乙磺酸。

※一般原则

1）有条件时，应对pKa相近的一些缓冲液进行试验，以避免有的缓冲液与所研究的蛋白质之间发生不良的相互作用。

2）当选定一种缓冲液之后，一般使用其最低的浓度以避免非特异性的离子强度的影响，通常以50mmol/L的缓冲液浓度作为试验起始浓度。

3）当缓冲液pKa值的变化超过1个pH单位时其有效的缓冲能力明显降低。而许多酶在极限pH值时往住发生不可逆的变性。

4)大多数动物细胞在37℃的生理状况下的PH值为7.0~7.5，而在温度下降至接近0℃时可达8.0。

5)要根据所选用的分离方法选用缓冲液：凝胶过滤方法大多数缓冲液均可适用。阴离子交换层折，阳离子缓冲液首选Tris缓冲掖。阳离子交换和羟基磷灰石层析，阴离子缓冲液首选磷酸盐缓冲液。

6)混合缓冲液在一定的离子强度下往往具有更宽的缓冲范围。

7)所采用的化学试剂应达到试剂级或更高纯度。

二．蛋白质的分离、提纯一般程序

分离精制蛋白质开始时选择适当的原料，蛋白质的来源无非是天然的材料（动物组织、植物组织和微生物）和基因工程表达产物（大肠杆菌以及其他微生物和动植物细胞）。选择原料的原则是蛋白质含量较高，原料易得。应当注意的是蛋白质含量在种属间有意想不到的差别。当然，基因工程表达产品的原料是限定的，一般来讲，目的蛋白含量都比较高。

大多数蛋白质存在于细胞内，结合于细胞器上，所以必须先将细胞破碎，要根据不同情况采用不同的破碎方法。对动物组织可采用磨碎法、超声波破碎法和酶解法。对植物组织可用石英砂等适当的设备及酶解法即能达到目的。

生物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液中，可以不必经过抽提直接进行分离。一般的蛋白质需要在细胞破碎后用适当溶剂（如水、稀盐溶液、缓冲液等）将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物得到含有目的物的粗抽提液。从总体上来讲，分离纯化蛋白

质在对材料进行与处理后需要用沉淀法进行初步分离，之后再以层析或电泳法得到所需的蛋白质产物。

在蛋白质纯化过程中，从细胞破碎一步开始蛋白质就脱离了天然的环境，受到各种不同试剂的干扰，其结构和功能会受到不同程度的可逆或不可逆的损害。因此，在蛋白质纯化的各步骤都要小心地控制所采用的提纯条件，以避免蛋白质变性。

在提纯蛋白质过程中需要在每一步检测蛋白质（酶）的存在及提纯的情况，即建立蛋白质定量检测方法。

三．蛋白质分离提纯的具体方法

沉淀法

沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。

1、盐析法

盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。

2、有机溶剂沉淀法

有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其

二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。

3、蛋白质沉淀剂

蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。

4、聚乙二醇沉淀作用

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。

5、选择性沉淀法

根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。

吸附层析

1、吸附柱层析

吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。

2、薄层层析

薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。

3、聚酰胺薄膜层析

聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。

离子交换层析

离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。