2 海洋细菌

5.5 细菌鉴定的其它问题
平板分离获得单菌落 划线纯化和镜检 鉴定系统：以伯杰氏系统细菌学手册为主。 鉴定系统：以伯杰氏系统细菌学手册为主。 60年代英国的 年代英国的Shewan介绍的系统广泛应用， 介绍的系统广泛应用， 年代英国的 介绍的系统广泛应用 80年代初美国的 年代初美国的Oliver设计了海洋细菌鉴定到属的新方 年代初美国的 设计了海洋细菌鉴定到属的新方 案。 细菌快速鉴定系统： 系统， 系统， 细菌快速鉴定系统：API系统，Enterobube系统，micro 系统 系统 ID and Biologxitong 等，但不太适合海洋细菌。如 但不太适合海洋细菌。 API20E系统受盐度影响较大。 系统受盐度影响较大。 系统受盐度影响较大
3.5趋化性和附着生长 趋化性和附着生长
大多具有运动能力，可沿某种化合物的浓度梯度而移动， 大多具有运动能力，可沿某种化合物的浓度梯度而移动， 海洋中各种固体表面和不同性质的界面上却积聚着相对丰 富的物质， 富的物质，可为海洋细菌的生长繁殖提供较为优越的微环 境。
3.6发光性 发光性
少数海洋细菌具有发光的特性，主要是发光杆菌属和射光 少数海洋细菌具有发光的特性， 杆菌属。发光细菌只有在条件适宜时才发光。在含2-3% 杆菌属。发光细菌只有在条件适宜时才发光。在含 的氯化钠的培养基上才有可能发光。 的氯化钠的培养基上才有可能发光。
3.4 低营养性
在分离浮游性海洋细菌时忌用营养丰富的培养基。 在分离浮游性海洋细菌时忌用营养丰富的培养基。细菌多呈球 可通过0.45微米的滤膜，但在培养基上不能生长。 微米的滤膜， 形，可通过 微米的滤膜 但在培养基上不能生长。 贫营养细菌:也称寡营养菌 可在可溶性有机碳1-15mg/L的条 也称寡营养菌， 贫营养细菌 也称寡营养菌，可在可溶性有机碳 的条 件下生长的细菌。 件下生长的细菌。
（2）细胞组分水平 ） 细胞组成成分， 的组分， 细胞组成成分，CW的组分，脂类、醌类、光合色素和氨基 的组分 脂类、醌类、 酸库，通常用红外、气相色谱和质谱分析。 酸库，通常用红外、气相色谱和质谱分析。 （3）蛋白质水平 ） 氨基酸序列分析，蛋白质凝胶电泳和血清学反应等。 氨基酸序列分析，蛋白质凝胶电泳和血清学反应等。 （4）基因水平 ） 核酸分子杂交， 含量测定， 寡核苷酸分析， 核酸分子杂交，G+C含量测定，16S rRNA寡核苷酸分析， 含量测定 寡核苷酸分析 DNA或RNA的序列测定。 的序列测定。 或 的序列测定
Hale Waihona Puke Baidu
6 研究例子 ：琼胶降解菌的筛选 研究例子1：
采样环境 培养基： 培养基：海水合成培养基 采样----分散 分散-------稀释 稀释------涂布 涂布------培养 观察----培养---观察 采样----分散-------稀释------涂布------培养---观察-----筛选 筛选-------复筛 复筛-------确定目的菌株 筛选 复筛 确定目的菌株 细菌产酶能力测定 细菌鉴定 产酶条件优化 酶组分的提取 酶学性质的测定
佐贝尔(ZoBell)2216E培养基：好氧异养细菌 培养基： 佐贝尔 培养基 组分（ ， ）：蛋白胨 组分（%，W/ V）：蛋白胨 ，酵母膏 ，磷酸铁 ）：蛋白胨0.5，酵母膏0.1，磷酸铁0.01，琼 ， 毫升， 脂1.5，陈海水 ，陈海水100毫升，pH7.6-7.8。最常用 毫升 。 Simidu培养基；好氧异养细菌 培养基； 培养基 硫酸盐还原菌培养基 光合细菌培养基好氧异养细菌 发光细菌培养基 海洋弧菌选择性培养基 微藻培养基
近岸海水中存在着众多暂时生长在海洋环境中的陆生细菌。 近岸海水中存在着众多暂时生长在海洋环境中的陆生细菌。 陆生细菌 海洋细菌特指那些只能在海洋中生长与繁殖的细菌。一般来说， 海洋细菌特指那些只能在海洋中生长与繁殖的细菌。一般来说， 具有以下三个基本特征。 具有以下三个基本特征。
（2） 海洋微生物的主要特征 ）
5.2 水样处理
加入少量的表面活性剂（吐温 ， ），降低介 加入少量的表面活性剂（吐温80，5*10-6 W/ V），降低介 ）， 系列稀释。 质表面张力，分散聚集的菌团分散。然后进行系列稀释 质表面张力，分散聚集的菌团分散。然后进行系列稀释。
5.3 培养基（参考文献：海洋生物技术原理和应用） 培养基（参考文献：海洋生物技术原理和应用）
5.4 细菌分类和鉴定依据
（1）细胞形态和习性水平 ） 细胞形态特征的观察： 细胞形态特征的观察：个体和群体形态 菌体的大小、形态、排列、鞭毛状态、革兰氏染色反应， 菌体的大小、形态、排列、鞭毛状态、革兰氏染色反应，芽 孢和荚膜等。菌落的大小、形态、 孢和荚膜等。菌落的大小、形态、颜色和在半固体和液体培 养基上的生长情况。 养基上的生长情况。 生理生化特征：生长所需要的培养基要求。 生理生化特征：生长所需要的培养基要求。 生态学需求：氧气、温度、酸碱度， 生态学需求：氧气、温度、酸碱度，致病性等 血清学反应：抗原-抗体反应 血清学反应：抗原 抗体反应 噬菌反应：噬菌体对细菌的分型 噬菌反应：
嗜压菌和耐压菌均为低温环境的细菌， 嗜压菌和耐压菌均为低温环境的细菌，耐压程度与其所处的温 均为低温环境的细菌 度有一定的关系。 度有一定的关系。现在分离到的海洋嗜压细菌都是革兰氏阴性 假单胞菌。 假单胞菌。 嗜热嗜压细菌：栖息在自深海海底喷出的、 嗜热嗜压细菌：栖息在自深海海底喷出的、处于还原状态的热 水中。大多为古细菌，最高生长温度在110度，80度以下不能 水中。大多为古细菌，最高生长温度在 度 度以下不能 生长。 生长。
6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 菌株编号
透明圈大小 透明圈大小(cm)
6.1最佳发酵条件 最佳发酵条件 温度为25℃、 培养基起始pH7.5、 250ml三角瓶中培养基装液量为60ml、 接种量为8%。 培养时间为36h
6.2 酶的分离纯化步骤 酶的分离纯化步骤:
3 海洋细菌的特性
3.1 嗜盐性 海洋细菌最普遍的特性；能耐受高渗透压。一般可以在2.0 2.0海洋细菌最普遍的特性；能耐受高渗透压。一般可以在2.04.0%的盐分浓度中生存 最适盐浓度为3.3 3.5%。 的盐分浓度中生存， 3.34.0%的盐分浓度中生存，最适盐浓度为3.3-3.5%。钠离子是海 洋细菌生长所必须的，镁具有维持细胞膜的功能的作用。 洋细菌生长所必须的，镁具有维持细胞膜的功能的作用。 3.2 嗜冷性 绝大多数海洋细菌具有在低温下生长的特性。中温细菌， 绝大多数海洋细菌具有在低温下生长的特性。中温细菌，虽然 其最适生长温度在20度左右，但可在0 度下缓慢生长， 20度左右 其最适生长温度在20度左右，但可在0-5度下缓慢生长，称耐 是指那些在0 冷细菌。嗜冷细菌是指那些在 度附近能够生长， 冷细菌。嗜冷细菌是指那些在0度附近能够生长，最适生长温 度不超过15 15度 最高生长温度不超过20度的细菌。 20度的细菌 度不超过15度，最高生长温度不超过20度的细菌。主要分布在 极地、深海和高纬度的海洋中。 极地、深海和高纬度的海洋中。 海洋细菌对温度的耐受程度， 海洋细菌对温度的耐受程度，同其所处环境的盐度可能存在着 一定的关系。 一定的关系。
1 海洋微生物的特征
1.1 海洋细菌的定义
一类细胞无核膜、核仁，DNA不形成染色体，无细胞器， 一类细胞无核膜、核仁，DNA不形成染色体，无细胞器， 不形成染色体 不能进行有丝分裂，以二等分裂为主的原核微生物。 不能进行有丝分裂，以二等分裂为主的原核微生物。 1.2 海洋微生物特征 一般特征：个体直径一般在1微米以下 呈球状、 以下， （1）一般特征：个体直径一般在1微米以下，呈球状、 杆状、螺旋状或分枝丝状；具有坚韧的细胞壁； 杆状、螺旋状或分枝丝状；具有坚韧的细胞壁；能游动 的种以鞭毛运动。是海洋微生物的一大类群， 的种以鞭毛运动。是海洋微生物的一大类群，是海洋微 生物学的主要研究对象。 生物学的主要研究对象。
4 海洋细菌的分布
外海：表层海水中因含有大量的有机物，细菌密度增加， 外海：表层海水中因含有大量的有机物，细菌密度增加，随 深度增加，水温降低，压力增加，细菌密度逐渐增大，在水、 深度增加，水温降低，压力增加，细菌密度逐渐增大，在水、 泥交界面，细菌数目又有回升。 泥交界面，细菌数目又有回升。 水平分布：沿岸因营养盐丰富而数量多些， 水平分布：沿岸因营养盐丰富而数量多些，随离岸距离的增 而菌数减少。 大，而菌数减少。内湾和河口密度最大 垂直分布：随深度的增加而逐渐减少。 垂直分布：随深度的增加而逐渐减少。 培养法： 万个， 培养法：约100-1000个，有时超过 万个，在深海海水中有 个 有时超过10万个 时一个也分离不到。底泥中约100到10万个， 时一个也分离不到。底泥中约 到 万个， 万个 直接计数，一般为1百万个 毫升。 百万个/毫升 直接计数，一般为 百万个 毫升。
粗酶液制备 8000r/min 盐析80% 盐析 饱和硫酸 铵
透析
浓缩 PEG600
凝胶照 相分析
SDSPAGE
检测活性成分 大量收集
凝胶 层析
SDS-PAGE电泳
图4-3 琼胶酶电泳图
7 研究实例 生物检测 研究实例2
7.1 近代化学污染的复杂性
化学物成分复杂与多元化 物成分复杂与多元化 复杂与 难分解 学与物理法分析困 物理法分析困难 化学与物理法分析困难 不易鉴定毒性物质对生物之加乘效应 不易鉴定毒性物质对生物之加乘效应 鉴定毒性物质对生物之加乘效
至少在开始分离或初期培养时要求生长于海水培养基中； 至少在开始分离或初期培养时要求生长于海水培养基中； 生长环境中需要氯或溴或其中之一元素存在； 生长环境中需要氯或溴或其中之一元素存在； 需要生活于镁含量较高的环境中。 需要生活于镁含量较高的环境中。
2 种类组成
最常见的海洋细菌有假单胞菌属、弧菌属、无色杆菌属、 最常见的海洋细菌有假单胞菌属、弧菌属、无色杆菌属、 黄杆菌属、螺菌属、微球菌属、八叠球菌属、芽孢杆菌属、 黄杆菌属、螺菌属、微球菌属、八叠球菌属、芽孢杆菌属、 不动杆菌属和发光杆菌属。 不动杆菌属和发光杆菌属。 海洋细菌生长慢。对糖的分解能力弱， 海洋细菌生长慢。对糖的分解能力弱，对蛋白质的分解能 力强；产生色素的较多。 力强；产生色素的较多。 一般来说，在海水中革蓝氏阴性杆菌占优势。 一般来说，在海水中革蓝氏阴性杆菌占优势。在远洋沉积 物中革蓝氏阳性球菌占优势。芽孢杆菌在海水中少见，但 物中革蓝氏阳性球菌占优势。芽孢杆菌在海水中少见， 在大陆架沉积物中常见。球菌在海水中少见， 在大陆架沉积物中常见。球菌在海水中少见，能游动的杆 菌和弧菌在海洋细菌中占优势。 菌和弧菌在海洋细菌中占优势。
5 海洋细菌的采集和分离
5.1 采样器： 采样器：
击开氏采水器：适用于 米以内的海区。 击开氏采水器：适用于500米以内的海区。 米以内的海区 Niskin采水器： 采水器： 采水器 无专用的采泥器：大洋型采泥器、小型底栖柱状采泥器和 无专用的采泥器：大洋型采泥器、 地质取样管。 地质取样管。可用无菌解剖刀采集其中的目的成分
3.3 嗜压性
水深每增加10米 其静水压力约增加 水深每增加 米，其静水压力约增加1kg/cm2。深海海底要承 受约380-1100 kg/cm2的压力。压力增加导致一系列物理化学 的压力。 受约 的复杂变化，包括pH值 水的结构和气体溶解度的变化， 的复杂变化，包括 值、水的结构和气体溶解度的变化，防碍 了浅海和陆源细菌在深海中的生长。 了浅海和陆源细菌在深海中的生长。 嗜压细菌：具有适应高压并生长代谢的能力，高压下可保持酶 嗜压细菌：具有适应高压并生长代谢的能力， 系稳定，正常压力下失活。核糖体具有独特性， 系稳定，正常压力下失活。核糖体具有独特性，脂肪酸对于生 长是必要的。细胞的形态在高压下可发生变化。 长是必要的。细胞的形态在高压下可发生变化。 耐压细菌，可在常压和高压（ 均能生长的细菌。 耐压细菌，可在常压和高压（600 kg/cm2 ）均能生长的细菌。