固定化细胞制备
酵母细胞的固定化(定)
作用： 将葡萄糖转化为果糖
如何改进？
特点： 酶稳定性好，可持续发挥作用
直接使用酶时的缺点： 酶溶于葡萄糖溶液后，就无法 从糖浆中回收，造成很大①反应柱能连续使用半 年，大大降低了生产成 本。
②提高了果糖的产量和 品质。
三、实验操作 （一）制备固定化酵母细胞 （二）用固定化酵母细胞发酵
（一）制备固定化酵母细胞 1、酵母细胞的活化：
1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放 置1h，使之活化。
〖思考〗活化是指什么？
在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化是指让 处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过 程。 操作提示
五、结果分析与评价
（一）观察凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色： 说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少； 如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形：
说明海藻酸钠的浓度偏高。 二者都说明制作失败，需要再作尝试。
（二）观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产 生了很多气泡，同时会闻到酒味
〖思考〗 1、发酵过程中锥形瓶为什么要密封？ 酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。
〖思考〗 2、锥形瓶中的气泡和酒精是怎么形成的？ 酵母菌进行无氧呼吸产生的
本请 并
节 结
完 成 习
做 好 复
束题 习
！
谢谢！
〖思考〗为什么要将海藻酸钠冷却至室温？
以免海藻酸钠温度过高杀死酵母菌
操作提示 海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分， 使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。
（5）固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加CaCl2 溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡 30min左右。
细胞的固定化方法
细胞的固定化方法
1. 凝胶固定化：将细胞悬浮液和凝胶混合，然后使其凝固。
凝胶可以是物理凝胶（如琼脂、聚丙烯酰胺）或化学凝胶（如明胶、半乳糖）
2. 微胶囊固定化：将细胞包裹在微小的胶囊中。
微胶囊可以是物理制备的（如油水混合法）或化学制备的（如酞菁染料-聚乙烯醇复合物制备法）
3. 纤维固定化：将细胞培养在纤维网上，使其附着在纤维上成为固定化细胞
4. 包埋固定化：将细胞嵌入固定化的基质中，如蜡、树脂、玻璃等
5. 电化学固定化：将细胞电化学固定化在电极表面，如金属电极或碳材料电极。
这种方法可用于微生物电化学反应和电生物学研究。
6. 3D打印固定化：使用3D打印技术将细胞固定化在支架上，构建细胞组织工程。
固定化细胞技术
固定化细胞技术（简称IMC），也称固定化微生物技术，是指通过 化学或物理手段，将微生物细胞固定在载体上使之成为不悬浮于水但仍保 留其固有的生物催化活性，在适宜条件下能被重复连续使用的生物工程技 术。最初主要用于工业微生物发酵中。70年代后期，由于水污染问题日 益严重，迫切需要开发高效废水处理技术。于是人们开始考虑将固定化细 胞技术引入废水处理领域。该技术可将筛选出的优势菌种或微生物加以固 定，从而构成一个高效的废水处理系统。
Thank you！
2、包埋法 包埋法的原理是将微生物细胞截留在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的
网络空间中或埋于半透膜聚合物的超滤膜内，通过聚合作用、离子网络形 成、沉淀作用，以及通过改变溶剂、温度、pH 值来阻止细胞的泄漏，同 时能让底物渗入和产物扩散出来。
目前应用最为广泛的是凝胶包埋法固定大肠杆菌细胞。与液体发酵 相比，包埋的大肠杆菌生产周期短、产物分离方便、能耗低、设备投资少 且大大改善操作条件。包埋法仍存在一些不足，如包埋材料对细胞的毒性 作用、材料本身阻碍大分子底物和氧的扩散、使用过程中的杂菌污染等， 这些还需要进行更深入的研究。
（5）在反应器内长时间运转过程中，固定化系统具有良好的机械稳定性 和化学稳定性； （6）用于制备固定化细胞的载体对细胞来说是惰性的，不损伤细胞； （7）固定化系统使底物、产物和其他代谢产物能够自由扩散，因为产物 和其他代谢产物常常能抑制细胞的酶反应，更需要能够尽快扩散，以消 除抑制作用； （8）单位体积的固定化系统拥有尽可能多的细胞，以更后，氧和底物的传质速率也发生了变化，尤其是采用多 孔载体时，由于载体的作用，使得反应系统中主体的底物浓度及氧浓度与 微生物所处区域的底物及氧浓度发生差异，从而引起固定化后传质效果的 变化。通常，固定化后氧传质收到的阻碍更为明显，因此在好氧条件下， 由于氧传质的限制，固定化微生物处理的废水中的有机物浓度不能过高， 以免限制高密度的微生物活性的充分发挥；在厌氧条件下，由于不存在氧 传质供应的问题，废水中有机物的浓度可以大大高于好氧情况。所以，固 定化微生物的高处理能力可以得到充分体现，而且可以长时间地保持较高 的生物量和活性，充分显示出固定化微生物的优越性。
高中生物酵母细胞的固定化 (3)
↓ 冲洗：将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗 2～3 次
↓ 发酵：将 150 mL 质量分数为 10%的葡萄糖溶液转移至 200 mL 的锥形瓶中，加入固定好的酵母细胞，25 ℃下发酵 24 h
3．用包埋法固定化细胞是将微生物细胞均匀地包埋于 不溶于水的多孔性载体 中，常用的包埋载体有
明胶 、 琼脂糖 、 海藻酸钠 、 醋酸纤维素 和 聚丙烯酰胺 等。 4．固定化酶的应用实例——高果糖浆的生产 固定化酶技术已经应用于高果糖浆的生产中，生产 高果糖浆所需要的酶是 葡萄糖异构酶 ，所使用的反 应柱上的孔应满足 酶颗粒 不能通过筛板上的小孔， 而 反应溶液却可以自由出入。
(3)影响实验成败的关键步骤是________________。 (4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是______________。 (5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞 数目_____。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形 ，说明 ______。 (6)该实验中CaCl2溶液的作用是__________。
解析 (1)酵母细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵 母菌恢复到生活状态。酵母细胞活化后体积会增大。(2)固定 化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是 配制海藻酸钠溶液，得到凝胶珠。(4)海藻酸钠溶化过程要小 火加热(小火间断加热)不断搅拌，使海藻酸钠完全溶化，又 不会焦糊。(5)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母菌就过少；海 藻酸钠浓度过高，不易与酵母菌混合均匀。(6)氯化钙能使海 藻酸钠形成聚沉。
反应物不易 与酶接近， 尤其是大分 子物质，反 应效率下降
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶作为生物体内的催化剂，具有高效性和高特异性的特点。
但在工业生产中，酶稳定性差、易流失，造成成本过高，限制其广泛应用。
因此将酶采用固定化技术，使酶在发挥其高效、专一性同时，还能增强酶的贮存稳定性，提高了生产效率，节约了成本。
本文对酶和细胞的固定化技术进行综述。
【关键词】酶细胞固定化载体应用酶及细胞固定化技术是生物技术的重要组成部分。
20世纪60年代出现了固定化酶技术，60年代末固定化酶技术用于工业生产，70年代出现了固定化细胞技术，80年代又发展了固定化增殖细胞技术以及包括辅助因子在内的固定化多酶反应体系技术。
工程技术日益成熟，成为近代工业生产中不可缺少的组成部分。
所谓固定化技术，是指利用化学或物理手段将游离的酶或细胞（微生物），定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术，包括固定化酶技术和固定化细胞技术。
固定化细胞的制备方法是多种多样的，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用于制备固定化细胞。
一般来说，固定化技术大致可以分成吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等4大类，其中以包埋法使用最为普遍。
一、固定化技术分类1.吸附法很多细胞都有吸附到固体物质表面的能力，这种吸附能力可以是天生具有的，也可以是经过处理诱导产生的，依靠这种吸附能力，人们发展起许多廉价而又有效的固定化方法。
吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂将细胞吸附到表面上使之固定化，是一种最古老的方法，操作简单、反应条件温和、载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞易脱落。
后者根据细胞在解离状态下可因静电引力（即离子键合作用）而固着于带有相异电荷的离子交换剂上，如DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex、CM-纤维素等。
2.共價结合法共价结合法是细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。
固定化细胞技术综述
固定化细胞技术综述及其应用张弘扬1401024103 高娟丽1401024122天津农学院农学与资源环境生物技术（1）班摘要固定化细胞是将动植物或微生物细胞固定于合适的不溶性载体上的一种技术，它既可以提高生产效率和生产能力、延长生产周期，又易于细胞的分离和回收。
在生物、医药、环境保护、食品工业等方面得到了广泛应用。
本文主要介绍了固定化细胞技术的方法，载体的选择与应用，综述了固定化细胞技术在工业、环境中的应用，并对其发展前景进行展望。
关键词细胞固定化固定化方法细胞固定载体生物反应器酒精发酵环境治理固定化技术包括固定化酶技术与固定化细胞技术。
固定化细胞技术起步较晚，在20世70年代后才从固定化酶技术发展而来，它是指通过物理或化学的方法将分散、游离的微生物细胞固定在某一限定空间区域内，以提高微生物细胞的浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。
相对于固定化酶技术，该方法不需把酶从细胞中提取出来，且无需纯化，酶活力损失小。
目前，固定化细胞技术的应用范围涵盖生物学、生化工程、有机化学、合成化学、高分子化学、食品与发酵工业、环境净化、能源生产等多个领域，已经成为生物技术中十分活跃的跨学科研究领域。
本文主要对该技术及其应用进行了简单介绍，并对其发展前景进行展望。
一、生物细胞固定化技术1、细胞固定化的原理及方法固定化技术是使生物催化剂更广泛、更有效应用的一种重要手段，任何一种限制生物催化剂自由流动的技术都可以用于制备固定化生物催化剂。
由于细胞的种类多种多样，大小和特性各不相同，故此细胞固定化的方法有很多种。
Karel 等人将其归纳为表面吸附、多介质包埋、隔离和自凝集4大类；王建龙把目前常用的固定化方法分为吸附法、包埋法、胶联法和截留法；杨文英等介绍了吸附法、包埋法、共价结合法、胶联法、多孔物质包络法、超过滤法、多种固定化方法联用等7种常用方法；成庆利等按有无外加载体将细胞固定化方法分为有载体固定化法和无载体固定化法2种；张磊等按照固定化载体与方式的不同将其分为吸附法、包埋法、共价结合法和胶联法。
固定化细菌细胞的制备流程
固定化细菌细胞的制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!固定化细菌细胞的制备流程一般包括以下几个步骤：1. 细菌细胞的培养和收集。
固定化酶与固定化细胞
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O
固定化细胞生物催化制备(S)-苯基乙二醇的研究
（ ． ｅ ａｏａ ｒ ｆ ｎｕｔａ Ｂｏ ｃｎ ｌ ｙ ｉｉｒ ｆ ｄ ｃｔ ｎ ｏｔｅｎＹ ｎｔ ｎｖｒｉ ， ｘ ２ ４ ２ ， ｈ ａ １Ｋ ｙＬ ｂｒｔ ｙｏ ｄ ｓｉｌ ｉｔ ｈ ｏ ｇ ，Ｍ ｎｓ ｏ ｕ ａ ｏ ，Ｓｕｈｒ ａｇｚ Ｕ ｉｅｓｙ Ｗｕｉ １ １２ Ｃ ｉ ； ｏ Ｉ ｒ ｅ ｏ ｔ ｙ Ｅ ｉ ｅ ｔ ｎ ２ ｈｊ ｚｕｎ ｏｇｈ ｎ ａ ｉｇＬｑ ｉ Ｃ ｓ ｌ ｏ ｔ． Ｓ ｉａｈ ａｇ００ ６ ， ｈｎ ） ．Ｓ ｉａｈ ａｇ￣ ｎｓｅｇＨｕｔｎ ｉｕｄ ｒ ｔ ．Ｌｄ ， ｈ ｉｚｕｎ ５ ０ １ Ｃ ｉａ ｉ ｓ ｙ ａＣ ｊ
ｔ ｈｇ ｏ ｉｈ（＞９ ％ ）ｗｔ ｈ ｈｙｅ （＞８ ％ ） ａｅ ｎ ｒｓｌ ｆｃｍ ａ ｓｎ ｏ ｅｐ ｙｉｏｈｍｉ ｌ ５ ｉ ｉ ｉｌ ｈ ｇ ｄ ５ ．Ｂ ｓｄ ｏ ｅｕｔ ｏ ｏ ｐ ｒ ｏ ｆ ｈ ｈｓ ｃ ｅ ｃ ｓ ｉ ｔ ｃ ａ
ｃ ａ ａ ｔｒｓｉｓ ｏ ｉ ｕ ｄ ｃ ｙ ｔｌｄ ｐ ｎ １ ｍａ ｅ ｂ ｈ ｍ ｉａ ｙ ｔ ｅ ｉ ｎｄ ｔ ｅ ｐ ｏ ｕ ｔｍａ ｅ ｂ ｉ — ｈ ｒ ｃ ｅ ｔｃ ｆｌｑ ｉ ｒ ｓａ ｏ ａ ｔＳ－ ０１ ｄ ｙ ｃ ｅ ｃ ｌｓ ｎ ｈ ｓｓ ａ ｈ ｒ ｄ ｃ ｄ ｙ ｂ ｏ ｉ １
的稳定 性 ， 在优 化 反 应 条件 下 ， 固定 化 细胞 催 化批 次 由游 离细胞 的 ２次提 高至 ６次 ， 物 可保持 高光 学纯 度 产 （＞ ５ ） 高产率 （ ５ ） ９％ 、 ＞８ ％ 。与化 学合 成液 晶掺杂 剂 Ｓ１ １ －０ １的理化 特性对 比结 果表 明， 生物催 化法制备 获得 的 （ ）Ｐ Ｄ能够替代化学法制备的相 同产品 。 ｓ －Ｅ
固定化细胞制备及应用事例
固定化细胞制备及应用事例固定化细胞是将活细胞固定在材料上，以实现其在生物反应或工业生产中的应用。
利用固定化细胞可以提高细胞的稳定性和生物活性，延长其寿命，并简化细胞分离和生产过程。
下面将介绍固定化细胞制备及应用的一些事例。
一、酶固定化1. 葡萄糖异构酶固定化：葡萄糖异构酶（GI）是一种重要的酶，用于将葡萄糖转化为果糖。
将GI固定在聚丙烯酸酯(PVA)凝胶中，可以实现连续和稳定的果糖生产。
此外，还可以将GI固定在金属氧化物纳米粒子上，以提高反应速率和酶稳定性。
2. 乳酸脱氢酶固定化：乳酸脱氢酶（LDH）是一种用于乳酸生产的重要酶。
将LDH固定在Ca2+交换树脂上，可以实现连续乳酸生产。
固定化LDH不仅具有较高的稳定性和重复使用性，还可以避免产物污染。
二、生物传感器1. 葡萄酒品质传感器：利用固定化酵母细胞制备的生物传感器，可以检测葡萄酒中的氨基酸和糖分等物质，以评估葡萄酒的品质。
固定化酵母细胞可以提高传感器的灵敏度和稳定性。
2. 环境污染物传感器：将大肠杆菌等细菌固定在传感器的电极表面上，可以实现对环境中污染物的实时监测。
固定化细菌可以与特定的污染物发生反应，并产生电流信号，从而实现环境污染物的快速检测。
三、药物传递系统1. 肿瘤靶向治疗：将抗癌药物固定在载体上，并加上靶向配体，可以实现对肿瘤细胞的选择性靶向治疗。
固定化药物可以提高药物的稳定性和生物利用率，减少药物对正常组织的毒性。
2. 糖尿病治疗：将胰岛素固定化在高分子材料上，并用于制备胰岛素缓释系统，可以实现糖尿病的长期治疗。
固定化胰岛素可以延长药物的作用时间，减少频繁注射的需要。
四、废水处理1. 有机废水处理：将具有降解有机物能力的细菌固定在废水处理装置中，可以高效降解废水中的有机物。
固定化细菌可以在较宽的温度和pH范围内工作，减少对环境的影响。
2. 污水氨氮去除：将氨氧化细菌固定在生物反应器中，可以实现对污水中氨氮的高效去除。
固定化细菌可以提高氨氮去除速率和稳定性，减少传统处理方法所需的空间和时间。
酵母细胞的固定化技术
酵母细胞的固定化技术学习目标：1.简述固定化酶、固定化细胞的应用、原理和意义；2.说出制备固定化酶、固定化细胞的一般方法；3.尝试用包埋法制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行发酵。
课前导学：一、固定化酶技术的应用1．固定化酶：是指用物理学或化学的方法将___________与_______________结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。
2. 制备固定化酶的方法主要有：______________、交联法、______________等。
二、固定化细胞技术1．固定化细胞：通过各种方法将________与_________结合，使细胞仍保持原有的生物活性。
2. 固定化细胞的方法：吸附法和两大类。
3．直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点比较(一)制备固定化酵母细胞1．活化酵母细胞：活化就是处于________状态的微生物重新恢复正常的生活状态。
2．配制CaCl2溶液：3．配制海藻酸钠溶液：溶解海藻酸钠，最好采用酒精灯的方法，直至海藻酸钠完全融化。
如果加热太快，海藻酸钠会发生。
4．海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合：一定要将溶化好的海藻酸钠溶液________，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器。
5．固定化酵母细胞：以的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，逐渐形成凝胶珠。
(二)用固定化酵母细胞发酵1．制备麦芽汁：2．将固定好的酵母细胞用冲洗2-3次。
3．将固定好的酵母细胞凝胶珠加入无菌麦芽汁中，温度为℃。
（三）实验结果的观察：利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。
质疑讨论：1．在固定化酶时，一般宜采用什么方法？固定化细胞时，又适宜采用什么方法？2．海藻酸钠溶液的浓度对实验有什么影响？3．怎么判断凝胶珠制作是否成功？例题精讲：1．固定化酶的优点是 ( ) A．有利于增加酶的活性 B．有利于产物的纯化C．有利于提高反应速度 D．有利于酶发挥作用2．酶的固定化常用的方式不包括 ( ) A．吸附 B．包埋 C．连接D．将酶加工成固体3．固定化细胞常用包埋法而不用吸附法固定化，原因是 ( ) A．包埋法固定化操作最简便 B．包埋法对酶的活性影响最小C．包埋法固定化具有普遍性D．细胞体积大，难以吸附或结合4．如下步骤是制备固定化酵母细胞的实验步骤，请回答：酵母细胞的活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞（1）在状态下，微生物处于休眠状态。
固定化酶和固定化细胞的制作方法
固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。
是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。
4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。
多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。
（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。
(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。
第十一章 基因工程菌与固定化细胞
二）影响质粒稳定的因素
工程菌的稳定与否，取决于重组质粒本身的分子 组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件3个方面
1、与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳
定性的影响
例如： 质粒pSC101的Hind II片段有复制功能，并证明该片段上 还含有与质粒稳定性有关的序列 （0～0.27kb间； 被称为 分配定子 par ）
缺失有3种情况：
A）缺失发生在质粒复制起始区及选择性标记以外 往往使工程菌仍带有选择性标记但不能正常表现目 的基因的表型 B）缺失发生在质粒的选择性标记区域
e.g. pVC102(amy+ NmR CmR ) → amy – NmR CmS
如果重组质粒只有单一的选择性标记，这种情况会 被误认为质粒丢失 C）缺失可能发生在质粒复制的起始区 这种情况会导致整个质粒丢失
Par座位的功能类似于真核细胞染色体上的着丝点，在细 胞分裂时促进质粒分配，从而使质粒能稳定地传给子代细胞。
质粒pAcyc18 4在无选择压力下培养100代时丢失质粒的细 胞占32%；而由pAcyc184构建的含par座位片段的质粒pPM31 在同样条件下未测得有丢失质粒的细胞 Par座位可使与其无关的par-质粒稳定传代。 如将par座位插入到pBR322-trp上可使其质粒稳定性提高3-30 倍。
2、常用的基因工程宿主
1）大肠杆菌
2）枯草芽孢杆菌
3）酿酒酵母
特点： 生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长， 遗传学及分子生物学背景十分清楚
三、工程菌构建过程简介
克隆 PCR 合成
etc.
启动子
选择性基因
目 的 基 因
复制子
重组质粒
受 体 菌 表达产物
1）目的基因的获得 2）载体的选择与准备
7细胞固定化技术
例如将多孔陶瓷颗粒洗净和灭菌后臵悬浮细胞中
进行振荡培养，一段时间后细胞就会吸附在多孔 陶瓷的孔洞内，并在其中生长繁殖和新陈代谢
细胞工程 黄林彬 lbhuang@
根据吸附剂的特点分:
1）物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、 硅胶、羟基磷灰石、纤维素等 2）离子结合法（ion binding） 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM纤维素
细胞工程 黄林彬 lbhuang@
聚丙烯中空纤维膜
细胞工程 黄林彬 lbhuang@
此法近似于植物体内物质的传递与交换形式，有
利于细胞生长和新陈代谢的进行
中空纤维作为固定化载体的缺点 有时纤维管会阻塞而影响物质传递 中空纤维成本较高，难以大规模生产利用
细胞工程 黄林彬 lbhuang@
角叉菜胶具有一定的凝胶强度、对细胞无毒害 通透性较好，是一种良好的固定化载体 应用广泛
细胞工程 黄林彬 lbhuang@
④明胶包埋法
明胶是一种蛋白质，易受蛋白酶的分解 高压蒸汽灭菌，105℃，1.05 MPa，15分钟 冷却至35℃以上
机械强度高，孔径与丙烯酰胺浓度相关 但丙烯酰胺单体对细胞有一定的毒害作用，应尽
量缩短聚合时间
细胞工程 黄林彬 lbhuang@
⑥光交联树脂包埋法
在光的作用下分子间发生交联反应，生成不溶性
网状聚合物——光交联树脂
作用原理：在一定波长的光引发下，带有可以发
生光交联反应官能团高分子之间发生加成性交联 聚合反应，生成不溶性交联产物
培养细胞的组织化水平越接近整体植株水平，就
2017-2018学年高中生物选修一教材用书：专题4酶的研究与应用课题3酵母细胞的固定化含答案
课题3酵母细胞的固定化 固定化酶和固定化细胞技术 [自读教材·夯基础]1．概念利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
2．方法(1）包埋法：多适于细胞的固定化；（2） ｝化学结合法物理吸附法多适于酶的固定化。
3．载体包埋法固定化细胞常用的是不溶于水的多孔性载体材料,如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
1．固定化酶常采用化学结合法和物理吸附法，而固定化细胞则常采用包埋法。
2．制备固定化酵母细胞的基本步骤是：酵母细胞的活化―→配制CaCl 2溶液―→配制海藻酸钠溶液―→海藻酸钠与酵母细胞混合―→固定化酵母细胞。
3．配制海藻酸钠溶液浓度过高，则难以形成凝胶珠;若浓度过低，则固定的酵母细胞少，影响实验效果。
4．配制海藻酸钠溶液应小火加热或间断加热。
5．固定化酶和固定化细胞技术既实现了对酶的重复利用，降低了成本，又提高了产品质量.4．优点(1)固定化酶既能与反应物接触,又能与产物分离，可以反复利用.(2）固定化细胞技术制备的成本低，操作容易。
5．实例-—高果糖浆的生产（1）原理：葡萄糖错误!果糖。
(2）生产过程:①将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入.②使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触。
③转化成的果糖，从反应柱的下端流出.（3）反应柱：酶固定在一种颗粒状的载体上，再将其装入反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板.酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由通过。
(4）优点：反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。
1．酶能加快化学反应速率，但溶液中的酶难以回收，不能利用。
要想既降低生产成本,又不影响产品质量，该如何解决这一问题?提示：将酶固定于不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触,又能与反应物分离，还可重复利用。
2．固定化酶和固定化细胞一般采用什么方法？为什么?提示:固定化酶常用化学结合法或物理吸附法。
因酶分子小，易从包埋材料中漏出,故一般不用包埋法进行固定。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。
• 用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定化。
•
•
葡萄糖异构酶
• 葡萄糖
果糖
果葡糖浆（是由植物淀
粉水解和异构化制成的淀粉糖晶）
固定化酶在工业生产中的应用
• 聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌菌体， 制得固定化延胡索酸酶。工业化生产L-苹果酸
三 酶解注意要点
• 2 酶系选择：
• 细菌和放线菌-肽聚糖-溶菌酶 • 霉菌-纤维素、几丁质-蜗牛酶 • 酵母菌-葡聚糖、几丁质- β葡聚糖酶 • 植物-纤维素、半纤维素、果胶-纤维素酶和果胶酶
• 3 酶浓度选择（0.5%-1%）
三 酶解注意要点
• 4 酶解温度和pH • 5 酶解终点确定
• 低渗爆破法-显微镜下观察原生质体在低渗溶液中吸水膨胀、破裂的 过程，反应终点应没有残骸。
细胞固定化方法
• 吸附法 • 包埋法
吸附法
• 它主要通过载体与细胞间的静电引力， 即细胞表面与载体之间范德华作用力， 离子键和氢键作用力，才使细胞固定 在载体上的。
影响吸附法的主要因素
• （1）Z-电位： Z-电位能近似地代表表面电荷 密度的大小
• （2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的 电荷性质
除去啤酒中的溶解氧和瓶颈氧，
葡萄糖氧化酶 阻止啤酒的氧化变质。
LLS催代酶
•加快双乙酰形成和还原 •降低双乙酰含量、缩短啤酒生产周期 •避免包装后双乙酰的回升。
固定化酶在工农业生产上的应用
产物
L-氨基酸 果糖浆
6APA L-门冬氨酸 L-苹果酸 低乳糖牛奶 乳糖 干蛋白 果汁脱苦 啤酒 植物白脱 脂肪酸
• 微生物、植物和动物细胞固定化
• 细胞特性比较
细胞种类 细胞大小/um 倍增时间/h
营养要求 光照要求 对剪切力
植物细胞 20-300 >12 简单
大多数要光照 敏感
微生物细胞 1-10 0.3-6 简单
不要求 大多数不敏感
动物细胞 10-100 >15 复杂 不要求 敏感
主要产物
色素、药物、香 精、酶等
• 常用凝胶包埋法 • 通过多价离子使高分子电解质形成凝胶的包埋
法，其中尤以海藻酸钙包埋法最为常用，由于 所用的试剂没有毒性，包埋的细胞易于增殖， 故常被优先选用于生长细胞，以及某些敏感细 胞（如植物细胞）和原生质体的包埋。
举例海藻酸钙包埋法
• 基本原理是：称取一定量的海藻酸钠配成水 溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或 孢子悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管 将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中（常用 CaCl2 溶液），形成球状固定化细胞
要点：如何保护细胞内部的结构完整性，防止制备得到的原生质体 的破裂
策略： 专一的酶
加入适当的渗透压稳定剂
三 酶解注意要点
• 1 酶解前要预处理：主要是为了使酶渗透到细胞器中去。 • 采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细胞壁的成分
合成，可以使酶插入。 • 一般加入：巯基乙醇，Triton-100,甘氨酸、青霉素。
• 采用聚砜中空纤维膜反应器固定淀粉酶可控制淀粉水 解，制备糊精。
反应器选择
• 酶的形式： 溶液酶
•
颗粒状或片状固定化酶
•
膜状和纤维状固定化酶
• 底物的物理性质：溶解性、颗粒物质和胶体物质
• 反应操作要求
• 酶的稳定性
• 应用和可塑性和成本
酶反应器的应用-控制液态流动方式
• 反应器中流动方式的改变会使酶与底物的接触不 良，造成反应器生产能力降低。
醇、有机酸、氨基 酸、抗生素、核 苷酸、酶
疫苗、激素、 抗体、酶
固定化细胞的特点
• 类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞
• 生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器）
•
活细胞（增殖细胞、静止细胞）
• 形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。
•
最多使用：颗粒状珠体
• 使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞 原有的全部活性， 只要载体不解体，不污染就可以
• 荧光染色：发出红色则为完全原生质体，发出绿光还有细胞壁成份。
四 稳定剂（高渗溶液）要求
• 1 加入的化合物对细胞和原生质体无毒性 • 2 不会影响水解酶的活性 • 3 对代谢产物无不良影响
四 稳定剂加入操作注意点
• 1 一定pH （酶和菌体质体易脱水皱缩）
损失。
填充式反应器
床内用颗粒状或片状 固定化酶填充，运转 时，底物按一定方向 以恒定速度通过反应 床。使用最普遍.
流化床反应器
底物溶液以足够大的流速 向上通过固定化酶床层， 使固体颗粒处于流化状态。 混合程度高，故传热、传 质情况良好。可用于处理 粘性强和含有固体颗粒的 底物，或用于需要供应气 体或排放气体的反应。
糖化酶： 将淀粉水解为葡萄糖，提高发酵度， 生产干净爽快的干啤酒
3、发酵过程中添加的酶制剂
真菌淀粉酶
•将未分解的 部分淀粉和 糊精降解
•提高发酵度 •降低冷浑浊
溶菌酶
α-乙酰乳酸脱羧酶
•破坏细菌胞壁
•对酵母等真核 细胞没有影响
•降低双乙酰 峰值
•缩短发酵时间
4、
后 酵 过 程 中 添 加 的 酶 制 剂
酶反应器和固定化酶（细胞）的应用
• • 酶反应器介绍
• 酶反应器的选择和应用
• 固定化酶和细胞的应用
生物催化反应器工程
通过反应器型式、操作方式的改变能 否使生物催化反应效率最大化？
将反应与传质紧密相关
实验室酶反应器
固定化酶反应器
一．酶反应器。
•
分批搅拌反应器
• 搅拌罐型
•
连续流搅拌桶反应器
植物细胞（组织）培养
悬浮细胞培养 收集细胞
提取纯化 产物
药物制剂
动物细胞（组织）培养
生长特点：
（1）贴壁生长：培养瓶中的悬浮液细胞，紧 贴培养瓶内壁才能生长
（2）接触抑制：当培养瓶中内壁生长细胞彼 此紧密接触时，细胞不再分裂
比较动植物细胞培养
原理
细胞来源
状态
培 养
成分
基 组成
器皿 过程
生长特点
• 一 原生质体固定化的方法
• 制备原生质体——将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲 液中配成原生质体悬浮液——包埋法固定化原生质体。
• 优点： 除去细胞壁-增加细胞膜的通透性
•
增加载体-较好的操作稳定性和保存稳定性
•
利于产物的分离纯化
• 关键：原生质体如何制备？
二 原生质体的制备
• 将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压稳定剂 的高渗缓冲液中——去细胞壁——分离纯化——得到原 生质体-活性鉴定
• （3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机 材料
包埋固定法
• 包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生 化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合 物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。
• 包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内 多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行 产物的发酵生产。
包埋法分类
• 常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、 聚丙烯酰胺
长期使用。
固定化细胞的优点：
1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密 集而体积小的生产菌集合体。
2、发酵稳定性好，可以较长时间反复 使用或 连续使用
3、发酵液中含菌体较少，有利于产品 分离纯化。
4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进 行的反应。
概念：
固定化细胞是指直接将细胞固定 在水不溶性载体上，在一定的空 间范围内进行生命活动（生长、 繁殖和新陈代谢）的细胞。
诱导形成愈伤组织，细胞增 殖分化
细胞进行异养需氧代谢
恒温、无菌、无需光照
常温、无菌、光照条件
细胞株→细胞系
愈伤组织→植株
固定化细胞的目的
• 微生物菌体：不需多次培养、扩大，从而缩短了发 酵生产周期，细胞密度大，可增殖。
• 植物细胞：减轻剪切力，避免聚集成团 • 动物细胞：贴壁的优势
固定化原生质体
培养条件 培养结果
动物细胞培养
植物细胞培养
细胞的增殖
细胞的全能性
胚胎或幼龄动物组织或器官 离体植物器官、组织或细胞
液体
固体
天然培养基
合成培养基
葡萄糖、氨基酸、无机盐、 矿质元素、蔗糖、维生素、
维生素、动物血清
植物激素、有机添加物
培养瓶
锥形瓶
原代生长，传代生长
更换培养基，细胞增值分化
贴壁生长，细胞增殖不分化
原料
乙酰-DL-氨基 酸 葡萄糖 青霉素G 反丁烯二酸 反丁烯二酸 牛奶 牛奶 蛋白 桔类果汁 生啤酒 植物油 植物油
产物
类固醇 L-丙氨酸
酶或细胞
氨基酰化酶 葡萄糖异构酶或含该酶之菌体 青霉素酰胺酶 含有门冬氨酸的菌体 含有反丁烯二酸酶的菌体 乳糖酶 碱性蛋白酶 葡萄糖氧化酶和氧化氢酶 柚苷酶 木瓜蛋白酶 脂肪酶 脂肪酶
固定化方法
载体结合法 载体结合法或交联法 载体结合法 胶格包埋法 胶格包埋法 载体结合法 载体结合法 胶格包埋法 载体结合法 载体结合法或包埋法 胶格包埋法 载体结合法
• 流动方式改变造成反混程度的变化，会发生程度 不同的反应或副反应。
• 物料粒子进入反应器后所经历的时间称为粒子的 年龄。粒子离开反应器时的年龄称为停留时间。
• 反应器内不同年龄的粒子间的混合称为返混。
酶反应器的应用
• 保持酶反应器的稳定性： • 防止酶变性、中毒、自溶或载体磨损。
• 防止酶反应器中微生物污染 • 向底物中加入杀菌、抑菌物质，或有机溶剂 • 底物物料预先除菌 • 在45度以上环境中或酸、碱缓冲液中进行反应 • 酶反应器每次用后消毒