微生物纯培养的分离方法
实验二微生物的分离纯化_图文_图文
④真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干 燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活 时间长，是目前最好的保藏方法。 ⑤液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低 温冰箱中（ -196℃）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法。
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称
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内容提要
• 分离 • 纯化 • 形态观察
（1）接种
• 半固体培养基：穿刺接种 • 液体培养基接种 • 普通琼脂培养基：涂布平板，平板划线接种，斜
面划线接种 • 浅盘固体接种
划线接种注意要点
• 划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻接触, 以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂.
同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落
（4）菌种保藏
• 最常见的保藏方法：斜面 • 细菌的保藏：甘油保藏 • 真菌的保藏：石蜡油保藏、孢子保藏
菌种保藏的方法
菌 种 保 藏 方 法
连续在培养基上（内）移种
生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种
固体斜面
湿法 半固体琼脂柱
真菌分离
• 利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落 分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是 利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此 限制真菌的迁涉生长。
• 一般采用PDA培养基 • 改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分
离。 • 有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分
离培养时应加以考虑。
（2）纯化
2、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l 、2天。
3、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应 调节到与试样的生态系统参数值相近。
微生物纯种分离的5种方法
微生物纯种分离有5种方法，分别是：1.倾注平板法：首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40-50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。
单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。
2.涂布平板法：首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。
3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法。
用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。
4.富集培养法：富集培养法的方法和原理非常简单。
我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。
如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。
通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。
5.厌氧法：在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。
然后快速冷却，并进行接种。
接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。
另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。
有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。
微生物菌种的分离和纯化方法
微生物菌种的分离和纯化方法1.空气平板法空气平板法是一种常用的微生物菌种分离方法。
将待分离的微生物样品进行适当的稀释并均匀涂布在含有经过固化的琼脂平板上，然后放置在适宜的温度下进行培养。
微生物在平板上呈现为单个菌落，每个菌落都代表一个来自单一细胞的微生物。
通过挑取单个菌落，将其再次传代培养，最终可以得到纯净的菌种。
2.稀释平板法稀释平板法也是一种常用的微生物菌种分离方法，在空气平板法的基础上进行了改进。
先将待分离的微生物样品按一定比例稀释，然后将稀释后的样品均匀涂布在琼脂平板上。
由于稀释后的样品中菌落之间的距离更远，因此每个菌落代表的是来自更少数的微生物细胞，得到纯净的菌种的几率更高。
3.前体菌种法前体菌种法是一种通过选择性培养基将目标微生物分离出来的方法。
选择性培养基可以通过添加特定的抗生素、酸碱度调节和特定营养物等来抑制其他微生物的生长而促进目标微生物的生长。
将待分离的微生物样品进行适当的稀释后接种在选择性培养基上，利用培养基的选择性促使目标微生物生长并抑制其他微生物的生长，最终得到纯净的菌种。
4.形态学分离法形态学分离法是一种根据微生物在形态和结构上的差异进行分离的方法。
先选择合适的培养基和培养条件，将待分离的微生物样品进行培养。
在培养过程中，观察并挑选出形态和结构上有明显差异的微生物，然后将其进行单菌维持培养，并通过形态特征进一步分离和纯化菌种。
5.生理生化特性分离法生理生化特性分离法是一种根据不同微生物菌株在代谢和物质转化方面的差异进行分离的方法。
根据微生物菌株的生理生化特性，如生长速度、氨基酸利用能力、产酸产气等，将微生物菌株进行初步分离，然后通过进一步的生化鉴定和特性测试，最终得到纯净的菌种。
总结起来，微生物菌种的分离和纯化方法有很多种类，选择合适的方法依赖于待分离的微生物特性和研究目的。
这些方法在微生物学的研究中起到了关键作用，为了获得纯净的微生物菌种提供了有效的手段。
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
1、用固体培养基分离和纯化单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。
当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。
大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。
所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。
这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。
固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。
最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。
这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。
1.1 稀释倒平板法首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。
如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。
随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
1.2 涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
微生物菌种分离和鉴定技术
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征
遗传（基因型）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术 Polyphasic Identification
新型显色培养基：
利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物 的培养基 。
微生物快速分离、计数方法
Petrifilm Plate (3M)
微生物快速分离、计数方法
3M Petrifilm Plate
Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate
单细胞（孢子）分离
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标
本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长，
是较好的弱选择性培养基。 麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。 碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。 血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。 营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌
第2章微生物的分离与纯培养
培养物：在一定条件下培养、繁殖得到的微生物群体 ① 混合培养物：含有多种微生物的培养物 ② 纯培养物： 只有一种微生物的培养物 通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果
纯培养技术是进行微生物学研究的基础！
一、无菌技术
从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，是研 究和利用微生物的第一步。
用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物； 在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染；
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二、用固体培养基分离纯培养
使微生物在固体培养基平板上形成单个菌 落的基本方法：
稀释！
1、涂布平板法（spread plate method)
使用较多的常规方法， 但有时涂布不均匀！
2、稀释倒平板法（pour plate method)
培养基类型
凝固剂含量 （以琼脂计）
主要用途
固体培养基
1.5%-2.0% 微生物分离、鉴定、计数
半固体培养基 0.5%-0.8% 观察微生物运动特征、鉴定菌种
液体培养基
大规模工业生产及在实验室进行
无
微生物的基础理论和应用方面的
研究
二、用固体培养基分离纯培养
菌落（colony）：
单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面 或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、 有一定形 态结构的子细胞生长群体
注意：
在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养 因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要
结合显微镜检测个体形态特征后才能确定 有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过
程和多种特征鉴定才能得到
二、用固体培养基分离纯培养
4、厌氧微生物的分离
获得微生物纯培养的方法
获得微生物纯培养的方法微生物纯培养是指通过分离和纯培养微生物细胞或菌体,获得所需微生物的纯品。
获得微生物纯培养的方法可以有多种,下面介绍其中两种常见的方法。
方法一:细胞分离法细胞分离法是获得微生物纯培养的常用方法之一。
该方法通常分为以下几个步骤:1. 培养基制备:将微生物所需的培养基制成浓度适宜的培养基,并加入适量的营养物质和抗生素等调节剂。
2. 细胞采集:将制备好的培养基进行细胞采集,通常采用离心技术或显微镜观察等方法。
3. 细胞分离:将采集到的细胞通过物理或化学方法进行分离,如过滤、洗涤、离心等,获得不同种类的细胞。
4. 纯培养:将分离得到的细胞进行纯培养,通常需要使用适当的技术和设备,如酒精沉淀、磁选、过滤等,确保获得纯品。
细胞分离法的优点在于操作简单、结果可靠,但需要选择合适的培养基和分离条件,对分离细胞的种类和数量有一定的要求。
方法二:化学分离法化学分离法是指利用微生物细胞或菌体表面的化学特征进行分离的方法。
该方法通常分为以下几个步骤:1. 培养基制备:将微生物所需的培养基制成浓度适宜的培养基,并加入适量的营养物质和抗生素等调节剂。
2. 添加化学分离剂:根据不同的化学分离剂,对培养基中的微生物细胞或菌体进行干扰,使它们分离出来。
常用的化学分离剂包括酸碱、盐、有机溶剂等。
3. 细胞分离:将添加化学分离剂的培养基进行细胞分离,通常采用离心技术或显微镜观察等方法。
4. 纯培养:将分离得到的细胞进行纯培养,通常需要使用适当的技术和设备,如酒精沉淀、磁选、过滤等,确保获得纯品。
化学分离法的优点在于能够精确地控制分离条件,分离出不同种类的微生物,但需要选择合适的化学分离剂和分离条件,对分离细胞的种类和数量有一定的要求。
1 如何获得微生物纯培养
1 如何获得微生物纯培养？为什么说获得微生物的纯培养仍然是一个挑战？首先要把微生物分散开，方法有：1破碎、碾磨、超声2 离心法分离3 稀释法分离4 单细胞分离5 选择性分离然后进行培养，获得微生物菌株，方法分为：1.固体培养法：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的细胞生长群体。
再通过平板划线法进行分离培养2厌氧稀释摇管法:针对厌氧菌进行厌氧稀释摇管 3.液体培养法：静置培养法；震荡培养法最后对获得纯培养的微生物进行保藏微生物发展到今天，只有大约5%的数量得到了纯培养，人们对一些微生物的生命活动，理化指标还不够了解，而且研究微生物的纯培养需要大量反复的实验，微生物的种类又有如此庞大的数量，如果不能在纯培养方面有质的飞跃，很难实现对一些不常用微生物的纯培养，因此说获得微生物的纯培养仍然是一个挑战。
2微生物的营养物质类型与营养类型有哪些？营养物质类型有：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源营养类型分为：按照碳源划分自养型以CO2 为唯一或主要碳源异养型以有机物为碳源按照能源划分光能营养型以光为能源化能营养型以有机物氧化释放的化学能为能源按照电子供体划分无机营养型以还原性无机物为电子供体有机营养型以有机物为电子供体3如何设计一种培养稀有放线菌的培养基？1首先要了解培养目的：培养什么菌？获何产物？实验室研究还是生产？一般研究还是生理、生化、遗传等紧密研究？做种子还是做发酵？2了解这种放线菌的生活习性：通过查阅文献以及参照前人的实验经验，对所要培养的放线菌有一个初步的了解。
3然后要选择培养基的营养成分：可以通过对放线菌生长环境的分析；放线菌的物质组成；以及培养其他放线菌的经验来选择适宜的营养成分4然后选择适宜的理化环境：1. pH 值2.渗透压和水活度3.氧化还原电势4.氧气浓度4原核细胞与真核细胞有哪些相同与不同？细菌细胞的特殊结构有哪些？它们有什么功能？细菌和真菌的细胞壁组分分别是什么？有何药学意义？。
常用的微生物分离纯化方法[整理版]
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(一) 常用的微生物分离纯化方法菌种分离纯化的方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。
其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备, 分离纯化效果好, 现分别简述如下1. 稀释混合倒平板法平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中, 冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。
该法是先将待分离的含菌样品, 用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当), 然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。
待琼脂凝固后, 即成为可能含菌的琼脂平板。
于恒温箱中倒置培养一定时间后, 在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。
每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。
挑取单一个菌落, 一般再重复该法1-2次, 结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。
若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。
图4 混合倒平板操作法示意图图5 涂布平板操作法示意图2. 稀释涂布平板法采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。
在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。
该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。
待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面, 再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面, 倒置温箱培养后挑取单个菌落。
另一种简单快速有效的涂布平板法, 可省去含菌样品悬液的稀释, 直接吸取经振荡分散的样品悬浮液l滴加入1号琼脂平板上, 用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布, 用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用，涂布平板数视样品浓度而定), 翻转此涂棒再涂布5号、6号平板, 经适温倒置培养后挑取单个菌落。
微生物纯种的分离方法
微生物纯种的分离方法自然界中的微生物总是杂居在一起，即使一粒土或一滴水中也生存着多种微生物。
要研究其中的某一种微生物，首先必须将它分离出来。
下面介绍几种纯种微生物的分离方法。
平板划线分离将已经熔化的培养基倒入培养皿中制成平板，用接种环沾取少量待分离的材料，在培养基表面平行或分区划线(图5-5)，然后，将培养皿放入恒温箱里培养。
在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。
液体稀释法将待分离的样品经过大量稀释后，取稀释液均匀地涂布在培养皿中的培养基表面，培养后就可能得到单个菌落。
利用选择培养基进行分离不同的微生物对不同的试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特点可配制出适合某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择培养基。
用这种培养基来培养微生物就可以达到纯种分离的目的。
菌丝尖端切割这种方法适于丝状真菌。
用无菌的解剖刀切取位于菌落边缘的菌丝的尖端，将它们移到合适的培养基上培养后，就能得到新菌落三、细菌的分离与计数（一）背景知识介绍1.细菌的分离与纯化自然界的细菌总是以杂居的方式存在，如土壤、水、空气等都分布着种类繁多的细菌。
我们如何知道这些杂居的细菌是哪种细菌呢？这就需要将这些带菌的材料中混杂的细菌，经过稀释，使其分散成单个存在的菌体，在固体培养基平板上，长成肉眼可见并具有一定特征的菌落。
这些菌落分离出来，进行纯培养。
所谓纯培养即在一个培养物中，所有的细菌都是由一个细菌分裂繁殖而产生的后代。
这种获得单一菌株纯培养的的方法称为细菌的分离。
常用的分离方法有稀释法和划线法。
（二）课题提出：我们的身体和周围的环境有大量的细菌，细菌与我们的生活和健康密切相关。
但是，自然存在的细菌都混杂在一起，我们要想研究和了解各种细菌的形态结构和功能，就要对其进行分离纯化，才能进行深入的研究。
如对一些致病菌的研究，食品卫生的研究，微生物工业的研究等。
在研究过程中，有时需要调查和检测细菌密度，则需要统计细菌的数量。
微生物分离原理
微生物分离原理
微生物分离是一种常用的实验方法，用于分离和培养单一的微生物菌株。
其原理主要包括以下几个方面。
1. 稀释法：通过将微生物污染物或样品进行一系列的稀释，依靠概率的随机分布，使微生物个体分散在培养基上。
然后，通过无菌的针筒或平板涂布法将其分散均匀后进行培养。
2. 针对性分离法：针对自然样品中特定的微生物，根据其特性选择特定的培养基，包括特异的生理反应、生长因子等，并结合不同的温度、pH等环境条件，使目标微生物菌株生长而其他的微生物不能生长。
3. 选择培养基法：针对特定微生物的特异性要求，设计配制一种特定的培养基，只有特定的微生物能够在该培养基上生长而其他的微生物不能生长。
4. 纯化分离法：通过连续传代培养，将混合培养物中的微生物不断分离纯化，直至获得单一的纯培养物。
5. 涂布法：通过将微生物样品均匀涂布在培养基表面，利用微生物的生长特点形成独立的菌落，从而分离出单一的微生物。
6. 降温法：依靠微生物的生长特性和温度敏感性，通过一定的温度处理，使目标微生物因为生长受到抑制而其他微生物得到排除。
通过以上不同的分离方法，可以有效地从混合的微生物中获取纯净的单一微生物菌株，为后续的实验研究提供可靠的基础。
微生物纯培养 方法
微生物纯培养方法微生物纯培养是一种将微生物从混合群体中分离出来并在无害的实验室条件下进行单一菌种的培养和研究的方法。
纯培养对于研究微生物的形态、生理、代谢、遗传等方面具有重要意义。
下面将详细介绍微生物纯培养的方法及步骤。
1. 选择合适的培养基和条件选择合适的培养基和条件对微生物的纯培养非常重要。
培养基的选择应根据微生物的特性、需求和研究目的来确定。
常用的培养基包括富含养分的肉汤、琼脂等。
另外，培养基的pH、温度、氧气和二氧化碳含量等条件也需要注意调节。
2. 样品的采集和消毒样品的采集应注意卫生消毒，避免外界微生物的污染。
常用的消毒方法包括用酒精或火焰对工具进行灭菌处理。
样品采集完毕后应立即送至实验室进行处理。
3. 稀释培养和平板分离将样品进行逐级稀释，然后通过平板分离的方法将微生物分离出来。
首先将样品加入适量的稀释液中，进行混合均匀。
然后取出一部分稀释液进行再次稀释，直到得到适宜的微生物数量。
接着，将适量的稀释液均匀涂布在培养基平板上，用细菌铲将液体均匀平铺开来。
待液体固化后，将平板倒置放在培养箱中，进行培养。
4. 单菌种的选择和分离通过观察，可以选择出与其他菌落不同的单个菌落，将其重新接种到培养基上进行培养。
取一根消过毒的铂丝球，沾取单个菌落然后在培养基上划线。
5. 温度调控和培养根据微生物的特性和生长条件，调整培养箱的温度和湿度。
不同的微生物对温度要求不同。
将培养好的微生物放入恒温培养箱中，进行培养。
6. 微生物纯种的筛选和保存通过观察微生物在培养基上的生长情况和形态特征，可以初步筛选出纯种菌株。
然后，将纯种菌株进行存储和保存。
常见的保存方法包括冷冻保存、冷冻干燥以及酒精保存等。
7. 纯种菌株的鉴定和性质研究通过生理生化和遗传学等方法，对纯种菌株进行鉴定和性质研究。
这些研究可以揭示微生物的生态学行为、生产能力以及其与环境的相互关系。
微生物纯培养的关键是选择合适的培养基和培养条件，并保持无菌操作。
微生物的分离和纯培养
一、微生物的分离和纯培养•混合培养物：含有两种以上微生物的培养物。
•纯培养技术：把特定微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的技术。
•纯培养（pure culture）：微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。
1.平板划线分离法（Streak Plate）将纯菌或含菌材料用微生物接种针在固体培养基表面进行划线，使微生物的单个细胞能分散在平板上。
2.倾注平板分离法（pour plate）将待分离的材料用无菌生理盐水进行一系列稀释,然后取不同稀释液少许(一般是1ml)分别置于无菌平皿中，而后倾入熔化并冷却到50℃左右的琼脂培养基，均匀混匀，冷凝后进行培养.3.涂布平板分离法（spread plate）先用固体培养基制成无菌平板,然后将一定稀释度的少量样品(一般是0.2-0.5ml)加到平板上,并用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布到整个平板表面,经过培养后挑取单个菌落。
4.液体稀释法待分离材料→接种于培养液中→培养→测定或估计单位容积中的含菌数目→稀至两、三滴液体中只含有一个微生物个体→每次取一滴至另一盛有新鲜培养基的试管中→摇匀，培养→观察→大多数试管无微生物生长，少数管底有一菌落，可能由一个细胞繁殖而来。
5.选择性培养分离法为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。
5.单细胞（单孢子）分离法采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。
该方法要在显微镜下进行。
毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。
显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。
小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。
微生物分离的方法
微生物分离的方法微生物分离是指将微生物从复杂的微生物群体中分离出来，单独培养和研究的过程。
微生物分离的方法有很多种，根据不同的目的、微生物类型和样本来源，可以选择不同的分离方法。
1. 纯培养法纯培养法是最常用的微生物分离方法，常用于培养细菌、真菌和酵母等微生物。
首先，需要从样本中制备适量的稀释液，然后取适量的稀释液分别均匀涂布在不同的培养基上。
在合适的培养条件下（如温度、pH值等），通过单菌落的形成，筛选出单个微生物菌株，并进行进一步的纯化和鉴定。
2. 过筛法过筛法是利用不同的筛孔大小来筛选微生物的方法。
主要可以分为通过粗糙的筛网和细孔的纱布进行筛选。
首先将样品溶于适当的溶剂，然后通过筛网或纱布过滤。
微生物细胞会被截留在筛网或纱布上，而溶液则通过筛孔流出。
将筛得的微生物脱落至培养基上，进行纯化和鉴定。
3. 稀释落数法稀释落数法是将样品稀释成一系列不同浓度的稀释液，然后取适量的稀释液均匀涂布在培养基上。
采用这种方法不仅可以分离出单个微生物菌落，还可以计算微生物的含量，如细菌菌落数量。
通过在不同浓度上形成不同的菌落形态，可以用于鉴定微生物的生长特性和生理功能。
4. 筛选富营养培养基法筛选富营养培养基法是通过调整培养基的成分，选择特定条件下生长特定微生物的方法。
例如，根据微生物对碳源、氮源、矿物质、酸碱度等因素的要求，选择不同类型的培养基，使特定菌株优先生长。
这种方法可以筛选特定的微生物群体，有助于深入研究微生物群落结构和微生物的代谢特性。
5. 抗生素抑制法抗生素抑制法是利用抗生素的选择性杀菌作用，从样品中分离出特定微生物的方法。
根据不同微生物菌株对抗生素的抗性差异，可以选择适当抗生素制备培养基，将样品接种于含有抗生素的培养基上。
抗生素会抑制非目标微生物的生长，而目标微生物则能够原样分离出来。
6. 过滤法过滤法是将样品通过微孔滤膜过滤，将微生物分离出来的方法。
根据滤膜的孔径大小，可以选择性地分离出不同大小的微生物。
细菌分离培养的方法
细菌分离培养的方法细菌分离培养是一种将混合菌群中的单一菌株分离出来的方法，广泛应用于微生物学领域。
它可以用于筛选天然产生的生物活性物质、研究菌株的基因组信息、以及了解不同位置和环境下菌群变化规律等。
本文将会介绍几种微生物学领域中常用的细菌分离培养方法。
1. 纯培养法纯培养法是一种将混合物中的单一菌株分离出来并进行纯化的方法。
该方法需要在无菌环境下操作，并且无菌操作的条件需要在培养过程中得到维持。
具体操作步骤是：1）将待分离的混合菌液定量传到无菌琼脂平板上，用平板法进行涂布。
2）在温度控制、湿度适宜的条件下在恒温箱中进行培养。
3）待出现典型的克隆扩散现象后，单独挑选出一株细菌，进一步进行鉴定和纯化。
纯培养法在微生物分离培养中应用广泛，但缺点是操作时间长，操作技术要求高，且部分微生物无法进行纯化。
2. 砖红色菌法砖红色菌法是一种利用菌落色素差异对微生物进行按色分类和分离的方法。
具体操作步骤是：3）待菌落颜色出现明显的不同后，通过菌落色素差异挑选出特定细菌。
砖红色菌法的优点是操作简单，操作时间短，但缺点是该方法只能将菌落色素差异大的细菌进行分离，色素差异小的细菌无法进行分离。
3. 抑制法抑制法是一种将目标菌株从混合菌中分离出来并持续生长的方法。
具体操作步骤是：3）通过抑制剂对目标微生物的特异性选择，将目标微生物从混合菌中分离出来，并进行纯化培养抑制法的优点是操作简单，效率高，但缺点是适合性较低，只能选择特定的细菌进行分离。
4. 染色法染色法是一种通过对目标菌落进行染色以及形态特征的观察来区分细菌种类的方法。
该方法广泛应用于快速区分和分离肠道致病菌和常规致病菌。
具体操作步骤是：2）将涂布后的菌落进行瓶装液制备后加入到体液中。
3）通过菌落形态、细胞的颜色和形态特征等方面进行区分和分离。
染色法的优点是操作简单，操作时间短，但缺点是仅适用于某些特定性的细菌株。
需要通过多种方法进行分离和鉴定。
5. 双层琼脂平板分层法1）将待分离的混合液加入到浸入双层琼脂平板基层的上层琼脂中。
微生物纯培养的方法精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版微生物纯培养的方法一、固体培养基分离1、稀释倒平板特点：菌落分离较为均匀，进行微生物计数结果相对准确。
但操作相对麻烦，热敏感菌有时易被烫死，而严格好氧菌也可能因被固定在培养基中生长受到影响。
2、涂布平板法特点：操作相对简单，是较常使用的常规方法。
但有时会因涂布不均匀使某些部位的菌落不能分开，进行微生物计数时需对稀释和涂布过程的操作特别注意，否则不易得到准确的结果。
3、平板划线法特点：操作简单，多用于对已有纯培养的确认和再次分离。
应用：这三种方法可用于所有能在固体培养基表面形成菌落的微生物的纯培养分离。
并且，通过选用适当的选择平板及培养条件，可直接分离各种具有特定生理特征的微生物。
和厌氧罐或厌氧手套箱技术结合，这3种方法也可用于获得各种厌氧菌的纯培养。
4、稀释摇管法特点：稀释倒平板法的一种变通形式，但由于菌落形成在琼脂柱的中间，观察和挑取都相对困难。
应用：在缺乏专业的厌氧操作设备的情况下对严格厌氧菌进行分离和观察。
二、液体培养基分离1、稀释法特点：工作量大，是否获得纯培养需依靠统计学的推测。
应用：不能或不易在固体培养基上生长的微生物进行纯培养分离或数量统计。
2、富集培养特点：一般不能直接获得微生物的纯培养，在通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，需再通过平板法进行相应微生物纯培养的分离和检测。
应用：（1）根据某种微生物的特殊生长要求，按照意愿从自然界中对这种微生物进行有针对性的有效分离；（2）分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。
三、显微操作单细胞（孢子）挑取特点：分离过程直观，可靠，但对仪器和操作技术要求较高，多限于高度专业化的科学研究。
而挑取的微生物单细胞或孢子需经固体或液体培养基培养后才能获得其纯培养物。
应用：从样品中直接分离所需的微生物细胞或孢子，获得其纯培养。
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富集培养
选择培养基分离
目的菌验证
涂布棒
弹簧接种枪
1.接种针 2.接种环 3.接种钩 4.接种锄 5.接种铲 6. 接种匙 7.接种刀 8.接种刀 9.剪刀 10.钢钩 11. 镊子 12.弹簧接种枪 13.接种、枪（日本式）
接种工具
接种环的灭菌
接种环烧红
接种环稍冷却
挑选单个菌落
划线
环境条件
1、实验台 2、空气
2、富集培养法
人为创造一些条件只让所需的微生物生长， 在这些条件下，所需要的微生物能有效地与 其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远 超过其他微生物。
富集培养是分离微生物菌种最强有力的技术之一
营养选择因子和生理条件选择因子可无穷尽组 合，可从自然界选择分离各类特异微生物
例：从土壤中分离能产生ß－半乳糖苷酶的微生物
第五单元 微生物分离纯化及鉴定技术
模块一 微生物纯培养的分离方法
微生物纯种分离
❖ 将多种混杂微生物，经某种技术或方法 分离成纯种的过程
纯培养（pure culture）
❖ 将在实验室条件下从一个细胞或一种 细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。
微生物纯种分离的原理和方法
微生物样品
分散成单个微生物
某种方法
只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其 他微生物生长的培养基
1、利用选择培养基进行直接分离
土壤 选择培养基 单细胞 直接分离
37℃ 培养
目的菌优势 非目的菌
选择培养基平板 （含牛奶或酪蛋 白唯一C、N源）
目的菌落 菌落周围有透明 蛋白水解圈
例一：分离筛选蛋白酶产生细菌
例一：分离 筛选蛋白酶 产生细菌
1、稀释倾注分离法
2、稀释涂布分离法
涂布平板法 稀释倒平板法
采用显微分离法从混杂群体中直接分离单 个细胞或单个个体进行培养以得到纯培养， 称为单细胞（单孢子）分离法。
❖ 营养琼脂平板上不能形成菌落 ❖ 分离难度与细胞或个体的大小成反比
三、单细胞挑取法
个体较小的微生物需采用显微操作仪
五、小滴分离法
含牛奶选择培养基目的菌生长平板
营养选择因子：牛奶或酪蛋白
只允许分解利用蛋白质的目的菌生长，淘汰非目的菌 长出的目的菌并不一定是同种细菌，但皆产蛋白酶
例二：分离筛选产高温淀粉酶（65℃）细菌
单细胞
65℃培养
淀粉水解透明圈 目的菌菌落
选择培养基平板 （淀粉为唯一C源）
选择因子：营养选择因子淀粉 环境选择因子65℃高温
较大的微生物可使用毛细管提取
Each colony was examined microscopically
四、选择培养基分离法
原理
❖ 创造适于目的微生物生长条件 ❖ 促使目的微生物快速生长呈优势菌 ❖ 抑制非目的微生物生长 ❖ 从混杂微生物中分离目的微生物
1、利用选择培养基进行直接分离
选择培养基
培养
单菌落多种混杂平板每个菌落为纯种（纯培养）
单菌落转接培养
纯种（纯培养）
菌落
单个微生物在适宜的固体培养基表面或内 部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可 见的、有一定形态结构的子细胞群体，称 为菌落。
一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养； 单个微生物只在固体培养基上形成菌落； 在液体培养基中不会形成菌落
谢谢观看！ 2020
同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落
一、划线法
分区划线法（蛇形线法）操作图
第一区划线 第二区划线 第三区划线
分区划线法适用范围： 适用于浓度较大的样品
连续划线法操作图
连续划线法适用范围： 适用于浓度较小的样品
二、稀释平板法
104/ml
103/ml
102/ml
101/ml
从土壤中分离纯微生物