图位克隆基因研究进展

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第五章第四节：植物数量性状QTL图位克隆方法剖析

The advantages of the sequential QTL fine-mapping strategy
To reduce experimental errors caused by both environmental factors and genetic background noise
K.Fengler et al., in press, Plant Genome
QTL精细定位—性状的准确鉴定
➢ 通过控制群体结构和后代测定等手段来消除遗传背景的影响，同时增加重组机会。在目标 QTL区间建立高分辨率的分子标记图谱，分析目标QTL与标记的连锁关系。
➢ 主要采用近等基因系(Near-isogenic lines, NILs) , 染色体片段代换系(chromosome segment substitution lines，CSSLs)或导入系(introgression line, ILs), 及基于重组自交系衍生的杂合自交家系(heterogeneous inbred family, HIF)或剩余杂合体(residual heterozygous line, RHL) 。
➢ 染色体不同区域重组频率的高低与着丝粒位置、染色体结构、亲本在QTL区域的序列差异等均相关。
玉米染色体的重组频率和基因密度分布
MZA Count Genetic Distance (cM)
1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
0
0
300 250 200 150 100 50 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 Physical Distance (bands)

图位克隆-李金伟.

图位克隆技术原理
李金伟
2012215423
无论头上是怎样的天空，我准备承受任何风暴。
内容简要
1
图位克隆技术的基本原理图位克隆的一般步骤（考研）
图位克隆在植物基因分离中的应用图位克隆的现状和前景
2
3
4
图位克隆技术的基本原理
图位克隆(Map - based cloning) 又称定位克隆(positional cloning) , 1986 年首先由剑桥大学的Alancoulson 提出，是近几年来随着各种植物的分子标记图谱相继建立而发展起来的一种行的基因克隆的一种方法
图位克隆的一般步骤
最为常用的分子标记
SSLPs
SSLP是基于PCR的分子标记，检测比较直接，只需要通过设计引物便可检测鉴定的SSLP标记
SNPs
SNPs标记的检测也比较直接，它是不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差别，这些差别的核苷酸通常位于不编码区域，常见的检测 SNPs标记的方法主要是剪切扩增多态性序பைடு நூலகம்（ CAPS），它是基于PCR的
侧翼分子标记
混合样品作图
指在准确鉴定目的基因表型（单基因控制的隐性突变）的基础上，把大群体中单株突变体分成若干组，以组为单位提取DNA，形成一个混合的DNA池进行分析，根据所有池中分子标记与目的基因发生的重组数来确定与目的基因连锁最紧密的分子标记及目的基因附近所有分子标记的顺序
图位克隆的一般步骤
图位克隆的一般步骤
2.4目的基因的筛选和鉴定 2.4.1目的基因的筛选
筛选和鉴定目的基因是图位克隆技术的最后一个关键环节。当一旦找到与目的基因紧密连锁的分子标记并鉴定出分子标记所在的大片段克隆后，就可以利用该克隆为探针进行染色体步移，逐渐靠近目的基因。

植物基因的图位克隆

植物基因的图位克隆关键词：植物基因、图位克隆、基因功能、实验流程、挑战与解决方案引言随着生物技术的不断发展，对植物基因功能的研究已成为农业、生态学等领域的重要课题。

图位克隆技术作为一种前沿的基因克隆方法，已在许多植物基因的研究中发挥重要作用。

本文将详细介绍植物基因图位克隆的技术原理、应用及面临的挑战和解决方案。

主体部分一、植物基因图位克隆的技术原理和应用植物基因图位克隆是一种基于基因组图谱的基因克隆技术，其基本原理是在基因组图谱中找到与目标基因相关的DNA片段，然后通过分子生物学方法克隆出该基因。

该技术在植物基因功能研究中的应用主要体现在以下几个方面：1、揭示基因与表型特征之间的关系：通过图位克隆技术，科学家们可以克隆出与特定表型特征相关的基因，进而研究其功能和作用机制。

2、发掘抗逆基因资源：植物在逆境条件下常常表现出独特的适应性，图位克隆技术可以帮助我们克隆这些抗逆基因，为作物改良提供宝贵资源。

3、解析植物发育过程中的关键基因：通过图位克隆技术，可以克隆出植物发育过程中发挥关键作用的基因，深入研究其调控网络和作用机制。

二、植物基因图位克隆的实验流程和操作植物基因图位克隆的实验流程包括以下几个主要步骤：1、样本采集：根据研究目标和实验需求，采集不同类型和不同发育阶段的植物组织样本。

2、基因的筛选：利用生物信息学方法和基因组图谱，筛选出与目标表型特征或生理特性相关的候选基因。

3、定位分析：对候选基因进行定位，可以通过比较基因组序列、染色体构象信息等手段，确定目标基因在染色体上的位置。

4、基因克隆：根据定位结果，设计特异性引物，采用PCR等分子生物学方法，克隆出目标基因的完整序列。

5、功能验证：通过转录组分析、蛋白表达及互作等实验手段，验证目标基因的功能及其在植物生长发育和抗逆过程中的作用。

三、植物基因图位克隆的挑战和解决方案尽管植物基因图位克隆技术已取得许多突破性成果，但在实际应用中仍面临一些挑战，如基因表达水平低、基因组规模大等。

基因的图位克隆ppt课件

• G. Zhang et al等利用IR24和IRBB13杂交，得到的F2分离群体，利用BSA法，找到了一个RAPD标记OPAC05，在抗病池和感病池之间有多态性。从而将 xa13定位于OPAC05附近。
•
G. Zhang et al. 1996 , Theor Appl Genet 93:65 70
常发挥。
优点：目的明确，对由基因家族控制的相关形状，抑制表达能同时降低此基因家族成员的功能；抑制表达和超表达是研究时空表达的有力工具。
缺点：抑制表达和超表达会使相关基因的功能紊乱，常常很难判断相关表型的改变是由于目标基因还是由于被紊乱的基因引起的。
葛莘. 高级植物分子生物学, 2004
•另外还有TILLING技术、芯片技术、比较基因组学、生物信息学……都被广泛的应用于基因的克隆。
如果在xa13两侧都检测到有来自IR24的标记基因型，则这个两个标记就是基因xa13的边界。
后来储朝晖博士，为了验证以上的结果，利用极端隐性分组分析法对来自IRBB13 和IR24杂交的250株极端抗病F2单株把 xa13 重新定位于S14003和RG163之间，同时一个新发现的CAPS 标记E6a定位于标记RG136和xa13基因之间，从而以Ea6和 S14003作为构建物理图谱的起点。
• 3. 图位克隆和以 xa13为例介绍图位克隆的详细过程
• 原理：在减数分裂︱时期，同源染色体之间配对，非姊妹染色单体发生交换，与目
标基因距离越远，发生交换的频率就越大，距离越近，发生交换的频率就越小（遗传学第三定律）。（王亚馥，戴灼华. 遗传学.1999，第三章：60-76）与基因发生最小交换频率的两侧分子标记，就是与基因最紧密连锁的分子标记，这两个分子标记之间的区段就是包含这个基因的目标区段。

拟南芥的图位克隆技术

拟南芥基因的图位克隆技术浙江大学生命科学学院徐冰浙江杭州3100291 国内外研究现状拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。

同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国ZF的重视。

从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。

正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。

虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。

图1 图位克隆所需努力的比较（1995年和2002年）（Jander等，2002）图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出（Coulson等，1986），用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。

它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。

近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。

目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。

在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。

这和反向遗传学的方法正好相反。

文档图位克隆原理及应用

位克隆技术的原理及其在分离玉米基因中的应用刘朝显2010.11.3 2 内容摘要图位克隆技术的基本原理1 图位克隆的技术环节 2 图位克隆在分离玉米基因中的应用 3 一. 图位克隆技术的基本原理 1. 图位克隆（Map-based cloning）: 定位克隆（position cloning）,1986 年首先由剑桥大学的Alan coulson 提出。

正常遗传学 2. 基本原理：根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，通过染色体步移(chromosome walking)逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)方法最后找到包含有该目的基因的克隆，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。

3 3. 图位克隆技术的优越性与局限性优点：不需要事先了解目的基因的表达产物，这为克隆许多有重要经济价值的农作物基因提供了有效的手段，因为这些基因的产物大多都是未知的。

缺点：基因组中的重复序列导致染色体步移困难，甚至将步移引入歧途。

4 一. 图位克隆技术的基本原理 4. 图位克隆示意图 5 一. 图位克隆技术的基本原理M1 M2 Gene 连锁标记的筛选M1 M2 Gene 初定位M3 M2 Gene 精细定位M3 M4 M5 M6 M7 M8 合成探针筛选基因组文库转基因功能验证BSA，NIL 300左右5000左右二. 图位克隆的技术环节 6 1.定位群体的构建⑴亲本选择原则:选择高度纯合，遗传差异大，DNA多态性丰富的亲本（实现基因精细定位的重要前提）可选用多个亲本进行多态性筛选⑵定位群体的组配：基因的定位是基于分离后代中交换单株出现的频率大小而实现的，因此组配一个遗传信息多群体大小适中的分离群体尤其重要。

BC1,F2 非永久性群体群体类型RIL,DH，NIL 永久性群体 2. 初定位(玉米：100-350株) 近等基因系（near-isogenic line,NIL ）法: 近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体, 这可通过连续回交的途径获得。

分子生物学第五章课后思考题答案【修订版】

分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展？答：近半个世纪来，分子生物学主要取得了三大成就：第一，20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。

但事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。

其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。

DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下：1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。

1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。

1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。

1970 年H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。

H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。

1972-1973 年H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。

1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。

1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。

1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。

影响番茄果实大小相关基因的研究进展

影响番茄果实大小相关基因的研究进展刘洪岩;岳淑婷;张琳;赵文静;包颖【摘要】果实作为被子植物的一种特殊器官,形态变化非常丰富,但其大小变异的分子机制却相对保守.目前,以番茄作为模式体系的研究已经识别出对果实大小具有调控作用的4个基因:fw2.2、fw3.2、FAS 和WUS,这些基因分别隶属CNR、CYP 78A、CLA和WOX 基因家族,并且从细胞分裂次数和子房室数目改变等两个方面来调控果实大小.这些基因及其各自的基因家族在各类植物中广泛存在,起源古老,甚至可以追溯到陆生植物的祖先,并且每个家族成员在功能上均享有高度的特异性,即均可以对植物果实的大小产生影响.%As a special organ,fruit possesses an important function on plant reproduction,plant fruit mor-phology is highly diverse,the molecular mechanism of regulating fruit size is conserved.Currently,in tomato four genes,fw 2.2,fw 3.2,FAS,and WUS that belongs to CNR,CYP P 78A,CLA,and WOX gene family,respec-tively,have been identified and considered to affect fruit size by regulating cell division or changing locule number. The orthologues of the four genes and their gene family members exist pervasively in plants kingdom.These genes have ancient origins that could be traced to the ancestor of land plants and shared highly conserved functional char-acteristics,i.e,they all play essential roles in regulating fruit size.【期刊名称】《曲阜师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(025)002【总页数】5页(P81-85)【关键词】果实大小;基因;细胞分裂;子房室数目【作者】刘洪岩;岳淑婷;张琳;赵文静;包颖【作者单位】曲阜师范大学生命科学学院,273165,山东省曲阜市;曲阜师范大学生命科学学院,273165,山东省曲阜市;曲阜师范大学生命科学学院,273165,山东省曲阜市;曲阜师范大学生命科学学院,273165,山东省曲阜市;曲阜师范大学生命科学学院,273165,山东省曲阜市【正文语种】中文【中图分类】Q941果实作为被子植物的一种特殊器官，不但可以为胚珠和种子提供保护，还可以在繁殖期协助种子的传播，利于物种的繁殖.植物果实大小并不一致，重达数千克，轻至几克的植物果实已经屡见不鲜.如此多样的表型，其背后的遗传机制是否相同？本文基于前人的研究，将聚焦模式植物番茄，对控制果型大小有重要影响的功能基因的研究进展进行总结.1 控制果实大小的重要功能基因以往研究证明，正常条件下，影响果实大小的主要内因在于细胞分裂次数和子房室数目改变等两个方面[1,2].细胞，特别是果皮细胞的分裂次数增多或子房室增加都会产生大果实，反之则会产生小果实.当然，细胞大小和倍性变化也会不同程度上引发果实大小改变[3,4].目前，探究果实大小表型变化背后遗传因素的研究在番茄、甜瓜、南瓜、葡萄[5-9]等众多植物中广泛开展，其中以番茄研究最为深入.基于早期的遗传图谱技术[10-12]以及后来的转录组[7-9,13,14]和基因组等比较[1,15]，目前有4个数量性状位点(Quantitative trait loci,QTLs)被认为和“果实大小”这种表型密切相关，其分别是控制果实重量的fw2.2和fw3.2，以及控制子房数目FAS和WUS，下面就这4个基因的研究情况进行简单汇总.1.1 fw基因——控制果实的重量fw是英文“Fruit Weight”的缩写，以其为前缀的基因包括一系列和果实重量相关的基因位点.最早在番茄的研究中，大约有30个QTLs被认为和果实大小的性状相关[16]，但目前比较公认的主效QTL为fw2.2和fw3.2[2,17].1.1.1 fw2.2fw2.2基因是细胞数目调控子(Cell Number Regulator,CNR)基因家族的一个成员，是由Alpert等人[18]在番茄2号染色体的No.2位置上识别的1个控制果实大小的QTL，也是第一个被识别和克隆的与数量性状相关的基因[19].早期的研究表明，该QTL对于野生和栽培番茄鲜果重量差异贡献率高达30%[16,18,19].为验证其功能,Cong等[20]通过基因表达情况的比较,发现fw2.2在具有小果实的野生番茄中比具有大果实的栽培番茄具有更高和更持久的表达量,因此推测该基因在影响细胞数目变化过程中应该承担负调控子的作用.此后，利用酵母双杂交、体外结合以及基因枪轰击等技术，Cong等再次对fw2.2在果实发育中的作用机制进行了探究，结果发现fw2.2是植物特有的蛋白，它和分布在质体膜上的CKII激酶的β亚基互作，参与控制细胞分裂周期的信号转导途径[21].另外一些学者也研究了该基因在其他植物中的功能，如Guo等在转基因玉米中使该基因异位超表达，结果使玉米整株植物变小，而下调或沉默该基因则使玉米植株和器官均明显增大[22].此外，根据叶表皮细胞的计数比较，Guo等也进一步发现，该基因所引发的植物或器官大小的改变是由于细胞数目的变化而非细胞本身大小的改变.后续的系列研究证明，fw2.2基因的功能在植物中是高度保守的，目前在大豆[23]、酸浆[24]、水稻[25]、鳄梨[26]等多种植物中均发现该基因具有对植物组织或器官尺寸的负调控作用.1.1.2 fw3.2fw3.2基因是番茄中发现的另外一个对大小有重要控制作用的基因[17].这个基因具有和拟南芥的KLUH基因直系的ORF区，因此又被命名为KLUH(SIKLUH)，属于P450 78A(CYP78A)亚基因家族的成员[27].Chakrabarti等[28]的研究证明，fw3.2转录起始点上游512bp处的一个单核苷酸多态(SNP)和果实质量变化密切相关，这个SNP可能造成了一个顺式元件的突变，并进而提升了fw3.2的表达[28].从功能上看，fw3.2在番茄果实增重中的作用主要是促进受精后果实的果皮和隔膜区域的细胞数量增加.同时，该基因的高表达也会使种子膨大和果实成熟期延迟.另外，Chakrabarti等也发现，和fw2.2影响整株植物不同，随着fw3.2基因的表达增强，每株植物的总重量并不会发生改变，但当利用RNA干扰技术抑制fw3.2基因的表达时，植物的侧枝数目和长度却较对照组有增高趋势.为此，Chakrabarti等推测，fw3.2可能通过平衡侧枝和果实重量来控制植物总量不变，因此，fw3.2可能同时对侧枝生长具有多效性.作为调控植物重量的重要基因，fw3.2及其CYP78A基因亚家族的其他成员在植物中均具有高度的功能保守性.目前，研究人员在拟南芥[29]、大豆[30]、小麦和水稻等被子植物[31-33]；甚至葫芦藓[34]等苔藓植物中均发现了它们的踪迹，并且这些直系同源基因在各类植物的生长发育中同样起着重要的调控作用.一些基于全基因组的分析也揭示出此类位点在植物内的保守性，例如Monforte等[1]在甜瓜基因组中识别了6个基因家族的74个与果实表型变异相关的直系同源基因，发现这些基因中凡是与果实重量相关的QTLs无一例外的会和fw2.2以及fw3.2及其基因家族成员在染色体上的定位相互重合.1.2 控制心室数目改变的基因控制心室数目的QTL目前研究较为深入的为FAS和LC，二者均通过调控分生组织的生长、分化并最终在花和果实的发育中扮演重要角色.1.2.1 FAS(FASCIATED)FAS位点最早被认为隶属于YABBY基因家族，该家族基因可以通过影响远轴细胞的分化，以一种极性的形式促进侧生器官发生[4，35].在番茄中，Cong等[4]通过分析11号染色体上的FAS位点的基因分布和结构，推测YABBY基因最可能是引发心室数目发生变化的功能基因，并认为正是该基因在花发育时期的下调表达促进了番茄多心室的发生.通过和野生番茄的比较，Cong等进一步指出，该YABBY基因在栽培番茄中的下调表达可能和其在第一内含子内插入了1个6-8 kb的DNA 片段有关.但是，随后，Huang等对FAS位点基因组结构和所涉及基因进行了更为细致的研究和精细定位，结果发现，除了Cong等提到的片段插入之外，FAS 位点在11号染色体上还包括一个294-kb片段的倒位[36]，该倒位发生在YABBY 基因的第一内含子和SlCLV3基因上游的1-kb区域之间(图1).图1 番茄FAS表型的遗传变异通过比较YABBY基因两侧重组子的频率，Huang等[36]认为FAS表型突变正是这个倒位造成的[36].随后,Xu等[37]证实,造成FAS表型变化的遗传原因并不是YABBY,而是SlCLV3,染色体片段的倒位引起后者启动子上发生了小的调控突变,使得其功能部分丧失,因此对心皮室的数目产生了影响[37].从功能上看,SlCLV3是配体基因CLV家族的重要成员[37],该基因的突变可以使干细胞过度增值,从而引起分生组织增大,导致器官的发育缺陷[36-38].1.2.2 WUS在番茄中，首次被发现可以通过影响子房小室的数目，来改变果实的大小的位点并不是WUS基因本身，而是利用图位克隆技术在番茄中获取的、被称为LC的1个QTL位点[6].研究证明，此位点的突变将会使番茄子房增加2-4个小室，从而使果实变大[39,40].严格的说，最初的LC位点[6]并不是一个功能基因，而是位于2个功能基因间的1个长达1.6kb的非编码序列.对LC两端基因的研究表明，其上游基因WUSCHEL是拟南芥WUS基因的直系同源基因，隶属WOX基因家族，编码一个在植物顶端分生组织中保持干细胞特性的转录因子；而其下游的基因则编码一个具有WD40基序的蛋白，该类蛋白隶属一个大的蛋白家族，其功能包括信号转导和转录调控等[40].但是，二者中仅有WUS基因与花果发育相关.来自拟南芥的实验进一步证实，WUS表达水平与花器官数目增多呈正相关，并且相应的表型变化和LC缺失突变体产生的表型变化吻合[41,42].因此，研究者推测WUS最可能是LC转录因子调控的目标基因.就功能而言，WUS编码一个同源结构域转录因子可以维持部分顶端分生组织和花部干细胞的特性[43].MADS-box转录因子AGAMOUS(AG)和编码C2H2型锌指蛋白的KNUCKLES(KNU)基因均可以抑制WUS的表达.AG既可以直接绑定到WUS上，也可以通过促进KNU的表达，利用KUN来抑制WUS的表达.另外，也有研究证明，WUS基因表达水平的下调是受其下游的2个CArG顺式元件调控的，该元件和AG转录因子结合会导致WUS 的表观沉默[2].Mnous等的研究[43]发现，在具有大小不同果实的番茄间，LC位点存在2个单核苷酸多态(SNP).通过对这段序列的进一步分析，van der Knaap[2]指出，这2个SNP正处于CArG顺式元件所在位置，这种情况暗示着这2个SNP 有可能是引发LC突变的原因，即它们的突变导致CArG元件丧失功能，从而提升WUS的表达水平，并进而在表型上产生更多的子房室.最近,Li等[14]利用RNAi技术,将LC突变体内的WUS基因沉默处理,结果植物产生了较野生型更小的果实.同时,该实验也揭示了当WUS被沉默时,参与调控子房室发育的转录因子TAG 1和SLCLV3的表达也会发生相应改变.这个研究首次从实验的角度证实了WUS是LC 位点调控的目标基因.最近，张等[44]分析了WUS基因在植物中的起源和进化，指出WUS起源古老，在植物中经历两步的功能革新，第一步是从蕨类植物和种子植物的祖先中获取和继承了维持顶端干细胞特性的功能；第二步则在蕨类植物和种子植物分开之后，在种子植物的祖先内产生和延续了能够在细胞间移动的功能，但是无论哪种功能，WUS基因自出现至今，一直处于严格的纯化选择之下，并在各类植物顶端分生组织和花器官发育中扮演重要角色.纵观以上4个基因不难看出，这些基因多为植物特有基因，且起源古老，功能保守，不但它们本身，甚至它们隶属的基因家族的其他成员均和果实大小这一表型相关，深入了解这些基因在不同类群内的序列和表达分化将有助于深入理解植物果实变异的遗传机制.此外，除上述控制果实大小的4个基因外，番茄中还识别出与调控果型相关的重要基因，如SUN和OVATE.这2个基因被认为可以通过调节果实的伸长，使果实形状发生改变[1].其中，SUN编码IQ67结构域家族成员，OVATE2则作为钙调蛋白结合蛋白在植物细胞中发挥着重要作用[45].2 存在的问题及今后研究方向综上所述，在分子水平上对于植物果型变异的分子机制的研究已经取得非常重要的成果，但以往的研究多集中在诸如番茄、拟南芥等模式植物中，对于其他具有多变果型的植物，比如南瓜、葫芦等，却少有涉及.这种现状严重限制了我们对植物果实变异规律的整体把握，也不利于我们对蔬菜品种改良和产量提高的宏观调控.鉴于本综述仅局限在果实大小这一性状，更多的关于果型变化的研究也值得广泛开展. 此外，由于目前所了解的控制果实大小的基因均出自不同的基因家族，每个基因家族的成员之间在果实发育过程中均有可能承担不同的功能，因此非常有必要在扩展研究类群的同时，拓宽研究的内容，将整个基因家族纳入研究体系，全面、深入的了解整个家族成员在不同植物中的进化动态以及功能分工和协作的具体关系，这些工作将有助于我们揭开植物表型变异的神秘面纱，并最终阐明果实大小背后的遗传本质.参考文献：[1] Monforte A J, Diaz A, Cano-Delgado A, et al. 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图位克隆的基本原理和方法

r/r
R/R
P1 纯合突变体
×
P2 ZS97
F1
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F2
R/R
R/r
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primary mapping method
Bulked Segregment Analysis：群组分离分析法。原理是将分离群体(F2、BC1等)中的个体依据研究的目标性状(如抗病、感病)分成两组，每一组取样8-15份，在每一组群体中将各个体DNA等量（等浓度等体积）混合，形成两个DNA池(如抗病池和感病池)。同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的 BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间理论上就应主要在目标基因区段存在差异。
精细定位
• 扩大群体，进行精细定位
Complementation test
找到候选基因后可对候选基因进行分析以排除非目标基因，可以通过比较扩增，测序，表达量检测及目标性状相关的生化和生理途径等方法来排除。当然最后要说明问题的话就是构建互补载体做一个互补验证。
将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标记进行PCR扩增，经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。
HL15(M )
HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M ) HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M) HL15(W) HY5(M) HY5(W) HY3(M) HY3(W) HY2(M) HY2(W) HY1(M) HY1(W) ZS97 ZH11
图位克隆的基本原理和方法
何宗顺 2011.12.7
图位克隆的基本原理
其基本的原理是：功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，通过找到与目标性状紧密连锁的分子标记，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，由于水稻全基因组序列的发布，我们可以得到已定位区段的候选基因，通过对候选基因进行分析，确定目标基因，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。

3作物数量性状基因图位克隆研究进展

作物数量性状基因图位克隆研究进展作物许多重要农艺性状，如产量、品质、生育期等均属于数量性状，对控制数量性状的基因 (Quantitative trait loci,QTL) 开展研究已成为现代遗传学的热点之一。

QTL 的鉴定和克隆不仅有利于从分子水平上阐明这些性状的发育和形成机理，而且对于有效开展数量性状分子育种，进一步提高作物品种的产量、品质和抗性水平具有重要意义。

近年来，作物数量性状基因克隆取得了重要突破，一批控制复杂农艺性状的 QTL 已被成功分离。

随着植物基因组研究的日益广泛和深入，作物 QTL 的图位克隆技术将有新的发展。

1 数量性状基因克隆基本思路数量性状由多基因控制，并受环境条件影响，其表型变异是连续的，一般只能通过统计分析方法来确定其遗传座位。

从本质上看，QTL 的定位研究只是以一定概率标准说明在基因组的某些区段可能存在影响某个数量性状的 QTL，至于这些 QTL 包含多少个基因，包含什么基因，以及它们如何作用于目标性状，则需通过遗传学的方法进一步去鉴定。

在遗传上，QTL 与控制质量性状的基因是一样的，都能够通过遗传重组进行分离，差异只是在遗传效应大小方面，而且同一座位既是一个 QTL，也可能是一个主基因，这取决于所考察的等位基因。

因此，QTL 克隆的基本思路与控制质量性状的主基因是相似的，即首先将初步定位的 QTL 界定到一个很小的基因组区域，然后提名候选基因，进行序列分析，最后进行功能验证。

由于一个数量性状的分离通常由多个 QTL 共同决定，每一个的贡献较小，且这些 QTL 常常紧密连锁在一起，因此 QTL克隆的关键问题是如何将控制所研究性状的多个 QTL 分解为单个孟德尔因子。

近年来在水稻、玉米和番茄上进行的 QTL 分离和克隆的开创性工作，为解决这一问题提供了有效途径和具体方法。

2 作物数量性状基因图位克隆进展2.1 已被成功克隆的作物 QTL目前已报道被成功克隆的作物 QTL 有9个(表1)。

【挑战杯】水稻光壳基因gl-1的图位克隆和功能初探

1目录摘要： (1)Abstract： (1)一、前言 (2)（一）研究意义 (2)（二）国内外研究现状 (2)1、水稻基因组的测序为基因的图位克隆提供了条件 (2)2、水稻光壳基因的研究进展 (2)二、实验内容及步骤 (4)（一）实验内容 (4)1、水稻光壳基因gl-1的7个候选基因测序 (4)（二）实验步骤 (4)1、取材 (4)2、PCR (4)3、电泳：扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳 (5)三、结果及分析 (5)（一）结果 (5)（二）分析 (6)1摘要：光壳稻是世界稻种资源中的重要组成部分，本项目组从来源于美国光壳稻品种“Star bonnet 99”的以华粳籼74为背景的单片段代换系（SSSL）鉴定出1个控制稻谷光壳性状的基因gl-1, 并将其候选区域界定在35.9kb的物理区域内，共包含7个候选基因。

本项目拟在此工作的基础上，通过对7个候选基因进行测序分析，将候选基因范围缩小到2个，为进一步确定目标基因，进而为了解水稻稃毛发育的遗传基础、探明水稻稃毛发育的分子机理和有效利用光壳稻资源奠定基础。

关键词光壳稻图位克隆稃毛发育基因测序Fine mapping and candidategene analysis of gl-1, a gene controlling trichome formation inrice（Xiaoyu Zhao, Yu Dai, Yue Chen）（College of Agriculture, South China AgriculturalUniversity）1Abstract：Glabrous rice is an important ingredient of world seed rice resources. In our study, we identified gl-1 gene, which controls trichome formation in rice leaves and hulls, from a single segment substitution line (SSSL) derived from crosses by using HJX74 as the recurrent parent and Star bonnet 99 as the donor. Fine mapping and high-resolution linkage analysis were carried out, and the gene was localized to a 35.9 kb genomic region that contains seven annotated genes according to the genome sequence of japonica Nipponbare. By sequencing the seven candidate genes, we narrowed down the candidate genes from seven to two, greatly promoting the final successful cloning of this gene, elucidating the mechanisms of trichome formation in rice and facilitating its utilization in agriculture.Key words Glabrous rice; Fine mapping; Trichome development; Gene sequencing1一、前言（一）研究意义光壳稻是世界稻种资源中的一个重要组成部分，我国的云贵高原、印尼爪哇和非洲都有原始品种（严宗卜，1998）。

图位克隆的基本原理和方法-PPT课件

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将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标记进行PCR扩增，经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。
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HL15(M )
HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M ) HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M) HL15(W) HY5(M) HY5(W) HY3(M) HY3(W) HY2(M) HY2(W) HY1(M) HY1(W) ZS97 ZH11
找到紧密连锁的分子标记之后我们就要进行一个“阳性”检测：即检测这个找到的分子标记是不是真正的与目标性状连锁。我们对F2代群体中随机选取一个200左右的小群体，将找到的分子标记分别扩增这些样，看表型与基因型是否对应。同时我们可以用这个小群体进行一个初步的基因定位。
9
一. 表型观察
Fine mapping
4
作图群体
将纯合突变体与ZS97进行杂交，对杂交的种子进行基因型鉴定，找到杂合型种子（即种子能够发生分离），将杂合F1代种子种下去后就能得到F2代群体。
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r/r
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P1 纯合突变体
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F2
R/R
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primary mapping method
Bulked Segregment Analysis：群组分离分析法。原理是将分离群体(F2、BC1等)中的个体依据研究的目标性状(如抗病、感病)分成两组，每一组取样8-15份，在每一组群体中将各个体DNA等量（等浓度等体积）混合，形成两个DNA池(如抗病池和感病池)。同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的 BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间理论上就应主要在目标基因区段存在差异。

中科院遗传所研究成果

基本信息实验室中文名称：植物基因组学国家重点实验室实验室英文名称：State Key Laboratory of Plant Genomics 实验室代码：2003DA173024依托单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所中国科学院微生物研究所实验室主任：方荣祥实验室学术委员会主任：李家洋通讯地址：北京市朝阳区北辰西路1号院2号联系人：张银红联系电话：************传真：************Email:*******************.cn/学科与学位点：学科1 学科2 学科3名称代码名称代码名称代码学科分类生物学0710硕士点遗传学071007博士点遗传学071007博士后站遗传学071007研究性质■基础研究□应用基础研究□社会公益性研究□高技术研发归口领域(选1项) □化学□数理□地学■生命科学□医学科学□信息□材料□工程目录一．实验室概况 (1)二．科研工作进展和成果 (6)高等植物表观遗传学研究（曹晓风课题组） (6)植物比较基因组学研究（陈明生课题组） (11)植物对非生物胁迫应答调控的分子机制（陈受宜课题组） (14)植物分子细胞遗传（程祝宽课题组） (18)植物基因表达调控（储成才课题组） (23)基因表达调控和植物生物技术（方荣祥课题组） (28)RNA沉默和植物抗病机制（郭惠珊课题组） (38)植物转录调控网络研究（焦雨铃课题组） (43)茉莉酸的生理功能及作用机理研究（李传友课题组） (46)水稻理想株型基因的克隆与功能研究（李家洋课题组） (50)植物对病原微生物的识别及信号转导（邱金龙课题组） (53)植物天然产物代谢（王国栋课题组） (56)生物信息学和系统生物学（王秀杰课题组） (59)与植物重要农艺性状相关基因的结构和功能研究（夏桂先课题组） (62)植物胁迫信号传导的分子机制（谢旗课题组） (66)北方粳稻耐逆性的分子设计和新品种选育（姚善国课题组） (70)乙烯信号传递与植物胁迫和生长发育反应（张劲松课题组） (73)植物细胞壁形成及其生物学功能研究（周奕华课题组） (77)水稻分化发育和抗病性的功能基因组研究（朱立煌课题组） (82)植物遗传工程研究（朱祯课题组） (88)细胞分裂素信号转导和植物细胞的程序性死亡（左建儒课题组） (92)承担课题及当年经费到位情况 (95)三．人员情况 (119)四．学术交流 (129)五．运行管理 (141)六．2010年学术年会纪要 (145)一．实验室概况（一）实验室基本概况植物基因组学国家重点实验室的前身是1990年成立的中国科学院植物生物技术开放实验室，依托于中国科学院遗传研究所和中国科学院微生物研究所。

植物基因分离的图位克隆技术

植物基因分离的图位克隆技术毛健民　李俐俐(周口师范高等专科学院生物系河南周口466000) DN A是遗传的物质基础。

遗传的基本单元是以基因的形式包含在DN A序列内。

要想从分子基础上来理解遗传的本质,基因的分离是最基本的前提。

现在分离和克隆植物基因的方法很多,如传统的功能克隆及近年来发展十分迅速的表型克隆。

但大多数情况下,我们并不知道基因的表达产物,在未知基因的功能信息又无适宜的相对表型用于表型克隆时,最常用的基因克隆技术有转座子示踪法、随机实变体筛选法和图位克隆法。

其中,转座子示踪法中的转座子受其种类、活性和数量的制约,随机突变体筛选法随机性较大且不能控制其失活基因的种类和数量,也限制了其应用。

比较而言,图位克隆技术随着相关配套技术的日渐成熟,已成为分离基因的常规方法,并在分离不同的植物发育基因中得到了广泛的应用。

本文对图位克隆技术的原理、基本技术环节及应用作一介绍。

1　图位克隆技术的原理图位克隆技术又称为定位克隆技术,是近几年来随着各种植物的分子标记图谱相继建立而发展起来的1种新的基因克隆技术。

它是根据目的基因在染色体上的位置进行基因克隆的1种方法,在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上,使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DN A文库,从而构建目的基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因或通过染色体登陆的方法最终找到包含该目的基因的克隆,最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。

2　图位克隆的技术环节2.1　筛选与目的基因紧密连锁的分子标记　筛选与目的基因连锁的分子标记是图位克隆技术的关键,常用的分子标记有RF L P标记、R APD标记、微卫星标记和A FL P标记等。

现在已有几十种技术可用于分子标记的筛选,随着分子标记技术的发展,一些植物的遗传图谱构建和比较基因组的研究也为分子标记的筛选提供了有益的借鉴。

利用这些分子标记技术结合使用近等基因系(N ILs)或分离群体分组分析法(BSA)就可以快速地从数量繁多的分子标记中筛选出与目的基因紧密连锁的分子标记。

水稻抽穗期基因Hd1、Hd2和Hd3a的研究概括

水稻抽穗期基因Hd1、Hd2和Hd3a的研究概括摘要：本文通过对水稻抽穗基因进行图位克隆和功能研究，得出以下结论：Hd1的转录水平不受日照长短的影响，推测其具有双重功能：在短日照条件下促进抽穗，长日照条件下延迟抽穗。

低温条件下，Hd1 表现出轻微的高表达水平；Hd6等位基因在长日照和自然生长条件下延迟水稻抽穗，在短日照下则不能延迟水稻抽穗；对于Hd3a，无论是长日照还是短日照，在低温条件下均表现出极低的表达水平，表明水稻在低温条件下导致Hd3a 表达抑制是延迟水稻抽穗的原因。

关键词：水稻抽穗期QTL功能基因图位克隆The research summary of the heading-date genes Hd1, Hd2 andHd3a in riceAbstract:Based on the heading of rice genes map-based cloning and functional research, the following conclusions : Hd1 transcript levels don’t affect by the length day, it has a dual function: to promote heading under short-day conditions , long-day conditions delayed heading . Low temperature conditions ,Hd6 allele under the condition of length day and natural growth delay rice earing, and under short day cannot delay rice heading ; For Hd3a, whether it is long or short day, at low temperatures have shown a very low expression levels , suggesting that expression of rice under low temperature conditions cause Hd3a depression is heading date qtls in rice's reason for the delay..Keyword: Rice Heading-date QTL Functional genes Map-based cloning1.前言水稻的抽穗(Oryza sativa)，是起花器官形成的过程，是其由营养生长转为生殖生长的重要过程，是繁殖下一代的重要步骤。

图位基因克隆

文章编号:1008—9632(1999)03—0001—1图位基因克隆Ξ涂友斌王　纪(中国科学院等离子体物理所离子束生物工程中心,合肥　230031)摘　要:图位基因克隆是最近几十年中发展并逐步完善起来的基因分离及研究方法。

紧密连锁分子标记的获得及DNA 大片段克隆文库的建立是顺利进行图位基因克隆的重要条件,而对于那些数量性状基因(Q TLs )的克隆更显示了其优越性。

关键词:图位基因;步查;重叠群中图分类号:Q78 文献标识码:A 图1　图位基因克隆原理1　前言高等生物的基因组织结构非常复杂,许多基因的作用机制和产物都是未知的,更有一些基因连其座位都不清楚,所以就很难通过常规途径进行基因克隆。

图位基因克隆(Map -based cloning )的出现解决了这一难题。

顾名思义,图位基因克隆就是将目的基因定位于遗传图谱上,然后对其克隆,它主要是用于分离编码产物尚不知道的目的基因的一种有效的方法。

从理论上讲,任何一种可鉴定出有一个突变的基因,都可以通过图位基因克隆技术予以分离。

一九九二年就已成功用于人类,植物中的拟南芥菜尤其成为当前研究的热点。

从数量上来说,目前植物克隆所得到的抗病基因中有一半以上来自于图位基因克隆。

2　图位基因克隆策略图位基因克隆原理的提出是在一九八六年[1](图1),但当时由于所用的文库插入片段较小,单个克隆往往未能包含完整的基因。

而且各种生物的遗传图谱上可以利用标记还非常少,所以一直未有成功的报道。

近几年来随着高密度DNA 分子标记连锁图谱的构建以及大片段DNA 克隆载体如YAC ,BAC ,P1等发展,为直接定位和克隆基因提供了可能。

211　大片段DNA 克隆文库作为第一代文库载体的代表,噬菌体和科斯质粒虽然具有稳定,易分离及转化率高等优点,但容载量都在25—45kb 之间。

酵母人工染色体色出现是DNA 克隆容载的一次飞跃[2],它具有着丝粒(CEN )、端粒(TEL )及复制起点(ARS ),能够在酵母细胞中自主复制,利用限制性内切酶切开的左右臂可以连接外源大片段DNA ,通常YAC 容载范围在100—500kb 之间,据报道最大克隆量曾达到1Mb 甚至3Mb 。

基因图位克隆的原理及应用

基因图位克隆的原理及应用1. 是什么？为何被广泛应用？基因图位克隆是一种常用的分子生物学技术，通过此技术可以将感兴趣的DNA 片段嵌入到目标向量中，并使其稳定地复制和表达。

这种方法被广泛应用于基因功能研究、基因工程、疾病诊断和治疗等领域。

2. 基因图位克隆的原理基因图位克隆的原理主要包括以下几个步骤：步骤一：选择目标向量和宿主细胞目标向量是用来接收外源DNA片段的载体，宿主细胞是容纳目标向量并使其复制和表达的细胞。

常用的目标向量包括质粒、病毒和人工染色体等。

步骤二：限制性内切酶切割目标向量和DNA片段通过使用限制性内切酶，将目标向量和DNA片段进行切割。

切割后的目标向量具有黏性末端，DNA片段的末端与之相互互补。

步骤三：连接目标向量和DNA片段将切割后的目标向量和DNA片段进行连接。

由于末端互补性，它们能够形成稳定的连接。

步骤四：转化宿主细胞将连接好的目标向量转化到宿主细胞中。

转化方法可以采用化学转化、热冲击法或电穿孔法等。

步骤五：筛选和鉴定通过选择适当的筛选标记或报告基因，选择出转化成功的宿主细胞。

并通过PCR、限制性内切酶切割或测序等方法对目标基因进行鉴定。

3. 基因图位克隆的应用基因图位克隆技术有着广泛的应用，以下是其中几个常见的应用领域：(1) 基因功能研究通过将外源基因或片段插入到目标基因中，可以研究其对基因功能的影响。

通过基因图位克隆技术，研究人员可以探索基因的结构和功能，揭示其与生物过程和疾病发生发展之间的关系。

(2) 基因工程基因图位克隆技术被广泛用于基因工程领域，用于构建转基因作物、转基因动物或生物制剂的制备。

通过引入特定的基因或片段，可以实现对目标生物特性的改变，从而实现农作物的抗病性、耐旱性等改良。

(3) 疾病诊断和治疗基因图位克隆技术在疾病诊断和治疗中也有广泛的应用。

通过检测某些特定基因的突变或缺失，可以帮助确定某些遗传疾病的诊断。

此外，基因图位克隆还可用于针对某些基因缺陷进行基因治疗，通过修复或替代缺陷基因来治疗疾病。

基因的图位克隆

基因的图位克隆
要点
1. 克隆基因的意义
2. 基因克隆的常用策略及比较 3. 图位克隆的基本程序和以 xa13为例介绍图位克隆的详细过程 5. 总结及展望
1.为什么要克隆基因？
克隆基因有助于我们解释基因的生物学
功能、调控模式、进化关系等。
在植物中，大部分基因的功能未知。
Tabata, S. et al. 2000, Nature 408, 796 - 815
功能进行干扰，从而证明特定序列所控制的表型。
正向遗传学：从已有的相对表型的差异开始，去分离引起表型变化的对应核苷酸序列改变。
Janny L. P. at el.2003.TRENDS in Plant Science l.8:484-491
• 基因克隆的主要方法：
• T-DNA标签法：当T-DAN导入植物基因组中，并插入基因的编码区或重要的调控区，
• 基因的抑制表达：通过降低目的基因在细胞的表达水平，
使基因的功能下降甚至消失，来研究基因的功能。
• 基因的超量表达：通过人为的重组DNA手段，在生物体细
胞中大量地、持续的表达目的基因，使目标基因的功能得到超常发挥。优点：目的明确，对由基因家族控制的相关形状，抑制表达能同时降低此基因家族成员的功能；抑制表达和超表达是研究时空表达的有力工具。
• 原理：在减数分裂︱时期，同源染色体之间配对，非姊妹染色单体发生交换，与目
标基因距离越远，发生交换的频率就越大，距离越近，发生交换的频率就越小（遗传学第三定律）。（王亚馥，戴灼华. 遗传学.1999，第三章：60-76）与基因发生最小交换频率的两侧分子标记，就是与基因最紧密连锁的分子标记，这两个分子标记之间的区段就是包含这个基因的目标区段。

拟南芥图位克隆

拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative，2000）。

同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所获得结果很容易用于其它高级植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特殊是十字花科中还有许多主要的经济作物，与人类的出产生涯亲密相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的器重。

从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。

正向遗传学道路指的是通过被克隆基因的产物或表示型突变去进行；反向遗传学门路则指的是根据被克隆基因在染色体上的位置来实现。

固然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能仍是未知的。

一、图位克隆概述图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出（Coulson等，1986），用该方法分离基因是依据目的基因在染色体上的地位进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先晓得其抒发产物的有关信息。

它是通过火析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基本。

近几年来跟着拟南芥基因组测序工作的实现，各种分子标记的日趋丰盛和各种数据库的完美，在拟南芥中克隆一个基因所需要的尽力已经大大减少了。

目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。

在这个过程中，我们从筛选突变体开端，逐步找到和表型相关的基因。

这和反向遗传学的方法正好相反。

图位克隆能实现，关键在于全基因组测序打算的完成和各种分子标记的发现。

这些数据被贮存在专门的数据库中（表1）（Lukowitz等，2000）。

在拟南芥中的图位克隆，在很大程度上得益于对Col-0生态型测序的完成，因为它是在研究拟南芥时最常用的生态型。