条件性基因敲除的基本原理Cre
条件性敲除的原理

条件性敲除的原理(图2,3):利用Cre/LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。
通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP,并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后,通过将“lo xP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶),产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。
在“loxP floxed”小鼠,虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP,但靶基因并没有发生其他的变化,故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。
但当它与Cre 转基因小鼠杂交时,产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。
Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应,结果将一个loxP 和靶基因切除。
这样,靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。
Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性:即Cre 在哪一种组织细胞中表达,靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞;而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。
所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度[9,10]。
在生理学研究中,为了明确某一组织或器官的功能,常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除,进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。
生命科学发展到今天,人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平,而上述的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想仍然有效。
具体地说,就是在分子水平破坏想要研究的基因,然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构、发育过程的变化等,进而推测相应基因的功能。
这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。
条件性敲除小鼠(CKO)原理、构建与应用

条件性敲除小鼠(CKO)原理、构建与应用基因敲除小鼠作为研究基因功能重要工具,应用十分广泛,然而实际操作中大家常常遇到这样问题:①靶基因敲除造成小鼠胚胎致死无法生育;②研究靶基因在某一阶段或者某一个组织的表达情况,那么全敲小鼠并不能满足我们的研究要求。
条件性基因敲除小鼠(CKO)就应运而生了,完美地解决了上面2个棘手问题。
今天,我们就为大家介绍一下条件性基因敲除小鼠的原理、构建、鉴定与应用。
一、条件性敲除小鼠(Conditional knockout mice, CKO)原理条件性基因敲除小鼠:使靶基因缺失仅发生于小鼠生命周期的某一阶段或某一特定的组织,而在其它组织或细胞表达正常,从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。
如下为全敲和条件性敲除的对比:1. 技术原理通过染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP或Flp-FRT来实现的。
在待敲除目的基因一个或多个重要外显子两端各放置一个LoxP (或FRT)序列,得到flox(Flankedby LoxP)小鼠。
将flox小鼠与带有组织特异性表达的Cre(或Flp)的小鼠交配繁殖,以获得在特定组织里把目标基因敲除掉的小鼠,即条件性基因敲除小鼠。
鉴于这2种技术基本原理一致,Cre-LoxP系统更多用于动物体内编辑,下面就以Cre-LoxP具体介绍。
2. Cre/LoxP系统组成Cre-LoxP系统源于 P1噬菌体,可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分:LoxP位点:一段长34bp的DNA序列,为重组酶识别的位点:含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
Cre重组酶:为一种酶,由343个氨基酸组成的单体蛋白;具有位点特异性,可使LoxP片段间的基因序列被删除或重组。
根据LoxP位点方向分以下三类重组方式:⑴两个LoxP位点方向相同:如果两个LoxP位点位于一条DNA 链上,且方向相同,Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列;如图下①所示。
cre_loxp基因敲除系统解读

诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino acids 281 to 599, G525R)
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合,产生一种嵌合重组酶,该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下,从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性,因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。
(1)打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
(2)转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
电穿孔或是显微注射方法将构 建好的打靶载体导入ES细胞
(3)阳性克隆筛选
随机整合
定点整合 没有整合
DTA(白喉毒素A亚基)
(4)囊胚注射
基因敲除 Knock Out
背景介绍
1981 年Evans 等首次在体 外分离和培养ES,成功建 立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动物 细胞中发现并实现了同源重组
同源重组
Homologus Recombination
同源重组是指发生在姐妹染色单体(sisபைடு நூலகம்er chromatin) 之间或
基因敲除技术

.概述:基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和iRNA,它们同样可以达到基因敲除的目的。
2.实现基因敲除的多种原理和方法:2.1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初,胚胎干细胞<ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年,首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年,Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在,运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1>:a.基因载体的构建:把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因,TK 基因等>的载体上,成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能,所以一般设计为替换型载体。
b.ES 细胞的获得:现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞,最常用的是鼠,而兔,猪,鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是129及其杂合体,因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2,3] c.同源重组:将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射>导入同源的胚胎干细胞(ES cell>中,使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中,从而得以表达。
一般地,显微注射命中率较高,但技术难度较大,电穿孔命中率比显微注射低,但便于使用。
基因敲除技术的主要方法和步骤有哪些?

基因敲除技术的主要方法和步骤有哪些?基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组,整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。
它是针对某个序列已知但功能未知的序列,改变生物遗传基因,令特定的基因功能丧失,从而使部分功能被屏蔽,并可进一步对生物体造成影响,进而推测出该基因的生物学功能。
目前能实现基因敲除的方法有:1.运用基因同源重组进行基因敲除(1)步骤方法A 构建基因载体:把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因的载体上,使之成为重组载体,常用的标记基因有:neo 基因、TK 基因等。
根据实验目的不同,打靶载体分为全基因敲除、条件敲除、基因敲进、诱导性基因敲除等打靶载体。
B获得胚胎干细胞:现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞,最常用的是鼠,而兔、猪、鸡等的胚胎干细胞也有使用。
基因敲除一般应用于鼠,常用的鼠的种系是129及其杂合体,因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物。
有些科研机构和单位已经运用C57BL/6遗传背景的小鼠的胚胎干细胞进行基因打靶,广泛运用于免疫学、神经学、癌症等领域。
C同源重组:将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中,使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中,从而得以表达。
一般来说,显微注射命中率较高,但技术难度较大,电穿孔命中率比显微注射低,但操作便利。
D筛选已表达的细胞:由于基因转移的同源重组自然发生率极低,因此要从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞。
目前常用的方法有:正负筛选法(PNS法)、标记基因的特异位点表达法以及PCR 法,其中应用最多的是PNS法。
E 性状观察:通过观察重组小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变,达到研究目的基因的目的。
基因敲除

基因敲除技术(组图)一.概述:基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和iRNA ,它们同样可以达到基因敲除的目的。
二.实现基因敲除的多种原理和方法:1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初,胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年,首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年,Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在,运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):①.基因载体的构建:把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因,TK 基因等)的载体上,成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能,所以一般设计为替换型载体。
②.ES 细胞的获得:现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞,最常用的是鼠,而兔,猪,鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是129及其杂合体,因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2,3]③.同源重组:将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中,使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中,从而得以表达。
一般地,显微注射命中率较高,但技术难度较大,电穿孔命中率比显微注射低,但便于使用。
基因敲除小鼠技术

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术,该技术从上世纪七八十年代诞生以来,已有近四十年的历史,经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰,并逐渐从基础研究实验室转向商业模式,成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术,该技术从上世纪七八十年代诞生以来,至今已有近四十年的历史,经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰,在小鼠模型构建方面日趋完善,并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样,逐渐从基础研究实验室转向商业模式,成为一项高度标准化的新兴产业,催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此,传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷,如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等,而ZFN和TALEN等新技术的出现,或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的,Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组(homologous recombination)的原理,首次实现了ES的外源基因的定点整合(targeted integration),这一技术称为"基因打靶"(gene targeting)或"基因敲除"(gene knockout),利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠(KO Mice: knockout mice);由于这一工作,Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组(homologous recombination)定义:是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
【干货】诱导型条件性基因敲除介绍

【干货】诱导型条件性基因敲除介绍在上上上上次,我们为大家简单的介绍了Cre-loxP重组酶系统,知道了条件性基因敲除策略主要是基于Cre-loxP系统,并且还可以通过它来实现在特定组织细胞中or在动物的特定发育时期对目的基因敲除。
那么,如何随心所欲地实现时空上的条件性基因敲除呢?让我为您一一道来!条件性基因敲除小鼠首先,在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个Loxp序列,得到flox小鼠。
然后,将flox小鼠与带有组织特异性表达Cre的小鼠交配繁殖,以获得在特定细胞里把目标基因敲除的小鼠,即条件性基因敲除小鼠。
对于在特定组织细胞中的基因敲除,我们应该能够理解,主要取决于所选择的启动子。
利用组织特异性表达的启动子调控Cre重组酶的表达,就可以实现相应部位特定基因的敲除。
另外,某些启动子(即诱导型启动子)也可以受某些外源性化学物质的调控,外源性调控的基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用,如荷尔蒙诱导系统、他莫西酚依赖的雌激素突变体启动子和四环素调节系统等。
这其中最频繁使用的是四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)和他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
四环素诱导的Cre-loxP系统四环素诱导的条件性基因敲除系统包含两个互补系统,tTA依赖(tetracycline-controlled transactivator protein (tTA) dependent)和rtTA依赖(reverse tetracycline-controlled transactivator protein (rtTA) dependent)的基因敲除系统,现在又称为Tet-Off系统和Tet-ON系统。
Fig.1 Tetracycline-inducible system[1](a) Tet-Off system. tTA is active without Dox (or tetracycline), and the gene of interest is expressed. With Dox (or tetracycline) treatment, tTA is inactivated, and the gene is no longer expressed.(b) Tet-On system. rtTA is inactive without Dox(or tetracycline), and the gene of interest is not expressed. With Dox (or tetracycline) treatment, rtTA is activated, and the gene is expressed.在这两个系统中,四环素(tetracycline)或其衍生物多西环素(强力霉素Dox)控制转录激活子tTA或rtTA与启动子Ptet结合,从而调控下游基因的表达。
cre-loxp基因敲除系统

背景介绍
1981 年Evans 等首次在体 外分离和培养ES,成功建 立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动 物细胞中发现并实现了同源重 组
同源重组
Homologus Recombination
同源重组是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin) 之间或同 一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合 。在基因敲除小鼠制作过程中,需要针对目的基因两端特异性片 段设计带有相同片段的重组载体,将重组载体导入到胚胎干细胞 后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射,是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内,注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中,并稳定遗传给后代。
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的 配体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre 重组酶进行融合,产生一种嵌合重组酶,该嵌 合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下 ,从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶 段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥 Cre重组酶的活性,因为雌激素受体结合区的 存在使其不能进入核内与loxP位点相结合。只 有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。
基因敲除机理 (续)
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
cre重组酶的工作原理

CRE重组酶的工作原理引言在生物学领域,基因编辑技术是一项革命性的技术,它可以精确地修改生物体的基因组。
CRE重组酶是一种常用的基因编辑工具,它可以在特定的DNA序列上催化重组反应,实现基因组的特定切除、插入或替换。
本文将详细探讨CRE重组酶的工作原理,包括结构、功能机制以及应用领域。
一、CRE重组酶的结构CRE重组酶是一种DNA重组酶,属于乳酸杆菌家族的重组酶。
它由38个氨基酸组成,形成一个螺旋状结构。
CRE重组酶的结构中包含两个重要的结构域:DNA结合结构域和催化结构域。
1. DNA结合结构域CRE重组酶的DNA结合结构域是通过与DNA靶标的特定序列结合来实现基因组的重组。
这个结构域具有高度的特异性,可以识别并与CRE重组酶特异的DNA序列结合。
DNA结合结构域的结构非常稳定,并且可以与DNA形成特异的氢键和范德华力。
2. 催化结构域CRE重组酶的催化结构域是实现DNA重组的关键部分。
在催化结构域中,CRE重组酶通过催化水解反应,将DNA的磷酸二酯键切断,从而实现DNA的切除、插入或替换。
催化结构域中含有一些重要的氨基酸残基,它们与DNA结合后能够催化水解反应的进行。
二、CRE重组酶的工作机制CRE重组酶的工作机制涉及到多个步骤,包括DNA结合、催化反应和DNA修复。
下面将详细介绍CRE重组酶的工作机制。
1. DNA结合CRE重组酶首先通过与CRE DNA序列的特定部分结合,形成CRE-酶复合物。
这个DNA结合过程是通过DNA结合结构域与DNA序列的特定碱基配对实现的。
DNA结合后,CRE重组酶会发生构象变化,使得催化结构域与DNA的切割位点相互靠近。
2. 催化反应在DNA结合后,CRE重组酶的催化结构域会催化DNA的切割反应。
催化结构域中的氨基酸残基与DNA形成氢键和范德华力,从而使得DNA的磷酸二酯键发生水解反应。
这个反应导致DNA链的切断,从而实现基因组的切除、插入或替换。
3. DNA修复DNA切割后,CRE重组酶会离开DNA链,使得DNA链的两端暴露在细胞质中。
条件性敲除小鼠

条件性敲除小鼠定义:条件性基因敲除小鼠(也叫Flox小鼠)是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠,与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
CKO如何实现?重组酶系统(如:Cre-loxP)介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶(38kDa),可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构,中间8bp为非回文结构,因此loxp具有方向性。
(当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时,Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化,同时将loxP 两侧的序列进行连接;当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时,Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
)CKO敲除的是什么?条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列,这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中,通常采用DNA 同源重组方法,在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能,故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生?除了flox 小鼠以外,重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中,将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下,Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达,靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞;Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率;使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂,决定在特定的发育时期或疾病发生阶段,定时地进行基因敲除。
(范衡宇老师课件)实验时,将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配,最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中,凡是表达Cre 的细胞,两个loxP 之间的序列被切除,从而实现组织特异性基因敲除。
基因敲除技术

基因敲除技术研究进展综述摘要:基因敲除在20世纪80年代发展起来后已经应用到许多领域, 如建立人类疾病的转基因动物模型(糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等)。
这些疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究: 研究发育过程中各个基因的功能, 研究治疗人类遗传性疾病的途径。
关键字:基因敲除;Cre/LoxP系统;基因载体;生物模型1.概述:基因敲除又称为基因打靶, 是指从分子水平上将一个基因去除或替代, 然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法,是功能基因组学研究的重要研究工具。
是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和iRNA,它们同样可以达到基因敲除的目的。
基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿, 并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响, 成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和实践意义。
基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献,在该领域取得重大进展的三位科学家,70岁的美国人马里奥•卡佩奇(Mario Capecchi)、82岁的美国人奥利弗•史密西斯(Oliver Smithies)和66岁的英国人马丁•埃文斯(Martin Evans)分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
2.基因敲出技术发展历史80年代末期的基因敲除技术为第一代技术,属完全性基因敲除,不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物,被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础,Cre在哪种组织细胞中表达,基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
条件性敲除小鼠

条件性敲除小鼠定义:条件性基因敲除小鼠(也叫Flox小鼠)是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠,与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
CKO如何实现?重组酶系统(如:Cre-loxP)介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶(38kDa),可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构,中间8bp为非回文结构,因此loxp具有方向性。
(当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时,Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化,同时将loxP 两侧的序列进行连接;当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时,Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
)CKO敲除的是什么?条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列,这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中,通常采用DNA 同源重组方法,在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能,故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生?除了flox 小鼠以外,重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中,将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下,Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达,靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞;Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率;使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂,决定在特定的发育时期或疾病发生阶段,定时地进行基因敲除。
(范衡宇老师课件)实验时,将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配,最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中,凡是表达Cre 的细胞,两个loxP 之间的序列被切除,从而实现组织特异性基因敲除。
分子生物学综述论文(基因敲除技术)

现代分子生物学课程论文题目基因敲除技术班别生物技术10-2学号 *********** 姓名陈嘉杰成绩基因敲除技术的研究进展要摘基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
此后经历了近20年的推广和应用,直到2007年10月8日,美国科学家马里奥•卡佩奇(Mario Capecchi)和奥利弗•史密西斯(Oliver Smithies)、英国科学家马丁•埃文斯(Martin Evans)因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
基因敲除技术从此得到关注和肯定,并对医学生物学研究做出了重大贡献。
本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。
关键词基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组前言基因敲除又称基因打靶,该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰和基因改制,具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)以取代目的基因,再筛选出已靶向灭活的细胞,微注射入小鼠囊胚。
该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠,再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。
基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明,使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。
上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术,属完全性基因敲除,不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物,被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础,Cre在哪种组织细胞中表达,基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术,其同样以Cre/LoxP系统为基础,利用四环素等诱导Cre的表达。
Cre-loxp基因敲除

• 如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA或染色体上,Cre酶能介导两条 DNA链的交换或染色体易位。
4.Cre-loxP系统的特点
• loxP位点是一段较短的DNA序列,因此非常容易合成;
• Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质,因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发 挥作用;
• Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下,从而使这种重组酶在生物体不 同的细胞、组织、器官,以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生,进而发挥作用, 这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。 • Cre 重组酶与具有 loxP 位点的 DNA 片断形成复合物后,可以提供足够的能量引发之后的 DNA重组过程,因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子;
01
Cre-LoxP重组酶系统
1.Cre重组酶
• 1981年从P1噬菌体中发现,Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp,编码由 343 个氨基酸 组成的38kDa单体蛋白。它不仅具有催化活性,而且与限制酶相似,能识别特异的 DNA 序 列,即 loxP 位点,使 loxP位点间的基因序列被删除或重组。Cre重组酶有70%的重组效率, 不借助任何辅助因子,可作用于多种结构的 DNA 底物,如线形、环状甚至超螺旋 DNA。 它是一种位点特异性重组酶,能介导两个LoxP位点(序列)之间的特异性重组,使LoxP位 点间的基因序列被删除或重组。
转基因动物依赖的Cre-loxp系统在应用中遇到 的问题
• 转基因动物的难以获得:有很多Cre/Loxp转基因动物没有被制作出来,自己制作转基因动 物耗时且成本高。 • 动物交配很耗时间:转基因动物达到实验室后,首先需要将转基因动物的数量扩大,然后 经过至少2代交配才能拿到基因敲除的小鼠,而交配一代小鼠至少需要2个月时间,所以至 少需要半年时间才能拿到基因敲除的小鼠。 • 区域或者组织特异性不高:因为转基因小鼠依赖的基因敲除的特异性只能依赖于启动子的 调控,而有些启动子并不能完全符合科研工作者对于区域或者组织特异性的要求,这样就 会使实验结果不精确。
基因敲除技术

1.概述:基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和iRNA,它们同样可以达到基因敲除的目的。
2.实现基因敲除的多种原理和方法:2.1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初,胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年,首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年,Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在,运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤a.基因载体的构建:把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因,TK 基因等)的载体上,成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能,所以一般设计为替换型载体。
b.ES 细胞的获得:现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞,最常用的是鼠,而兔,猪,鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是129及其杂合体,因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2,3]c.同源重组:将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中,使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中,从而得以表达。
一般地,显微注射命中率较高,但技术难度较大,电穿孔命中率比显微注射低,但便于使用。
Cre-Loxp

2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上,但方向相反,Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位;
3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上,Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。
另外,Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域,而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。利用这一特点,人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列,以用于特定的基因突变或修复,增加了该系统的应用范围。
Cre-LoxP重组酶系统的应用策略.
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列,这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞,通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除,又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交,筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。或者将Cre基因置于可诱导的启动子控制下,通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的基因切除(诱导性基因敲除),实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。
Cre (Cause Recombination Enzyme)是一种重组酶,特异地识别Loxp位点,并催化两个Loxp位点之间的片段发生删除、倒位或交换。
Loxp是一段34bp长的回文序列,在两段反向重复的13bp片段之间有8bp的间隔序列,这8bp的序列决定Loxp位点的方向。
Loxp位点的方向非常重要,当两个位点方向一致时,发生片段去除;当两个Loxp位 点反向时,发生片段倒位;当两个Loxp分别位于不同的染色体上时,可以发生片段交换。
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条件性基因敲除的基本原理Cre/loxP重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre/10xP或者Ftp/FRT重组系统来实现的。
这
两个系统都是位点特异性重组酶系统,已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。
这两个系统的应用,可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。
此外,若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合,还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
1.Cre/loxP系统的原理
Cre/loxP系统来源于F1噬菌体,可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分:①一段长34bp的DNA序列,含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
这段34bp序列是重组酶识别的位点,被称为loxP位点(10cus of X—over in P1)。
②Cre重组酶(cyclizationrecombination),它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白,可以引发loxP位点的DNA重组。
任何序列的DNA,当其位于两个loxP位点之间的时候,在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP 位点的方向相同),要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反),如图所示。
Cre/loxP系统的作用机制
2.Cre/loxP系统优点
Cre/10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用,是由该系统的诸多优点决定的:①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后,可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程,因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子;②loxP位点是一段较短的DNA序列,因此非常容易合成;
③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质,因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用;④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下,从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官,以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生,进而发挥作用,这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。
3.Cre/loxP系统的工作流程
利用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件下的敲除,需要两只转基因小鼠。
第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得,首先在体外构建一个在目的
基因两端分别含有一个loxP位点的基因序列,之后将体外构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞内,使其通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列。
经过这样处理的胚胎干细胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内,使其重新发育成为一个完整的胚胎,最终成为一只转基因小鼠。
在这只转基因小鼠中,loxP位点被引入到相应基因的内含子内,理论上不会对相应基因的功能产生影响,因此一般情况下,该小鼠的表型是正常的。
第二只转基因小鼠一般采用卵母细胞注射或者胚胎干细胞技术获得,在这只小鼠中,Cre重组酶被置于某特定基因启动子的调控之下,可以使其在某特定的条件下表达。
最后,让这两只小鼠进行交配,产生的同时含有上述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的细胞中缺失某一特定的基因。
很明显,在何种组织细胞或器官中敲除某一特定的基因取决于所选择的启动子。
只要选择合适的启动子调控Cre重组酶的表达,使其在生物体特定的部位、特定的条件下产生,就可以实现相应条件下某一特定基因的敲除。
迄今为止,研究者们已经成功地利用多个不同的启动子实现了在不同条件下的基因敲除,这些启动子可以是细胞类型特异的,如lck启动子(胸腺细胞)、alphaA晶状体球蛋白启动子(眼晶状体)、钙调素依赖性激酶Ⅱ启动子(海马和大脑新皮质)、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)、aP2启动子(脂肪组织)、AQP2启动子(肾脏集合管)和肌浆蛋白启动子(骨骼肌)等。
启动子也可以受某些外源性化学物质的调控,外源性调控的基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用,如干扰素反应Mxl启动子、他莫西酚依赖的雌激素突变体启动子和四环素调节系统等。