蔗糖合成酶、酸性转化酶、碱性转化酶活力活力的测定

实验四蔗糖合成酶、酸性转化酶、碱性转化酶活力活力的测定

参考

一、实验意义和目的 (2)

二、实验原理 (2)

三、材料、设备与试剂 (3)

四、实验步骤 (3)

1.蔗糖合成酶活性测定实验 (3)

2.转化酶活性测定 (4)

五、实验结果与分析 (4)

1.蔗糖合成酶活性测定.................................................................... 错误!未定义书签。

2.转化酶活性测定............................................................................ 错误!未定义书签。

六、误差分析........................................................................................... 错误!未定义书签。

一、实验意义和目的

蔗糖作为植物体内主要的光合产物和运输物质，其代谢强弱对许多生理活动都会产生显著影响。蔗糖合成酶(SuSy)是植物进行蔗糖代谢的关键酶之一,与植物细胞组织和骨架的构建、植株的生长发育和果实的成熟以及植物对逆境胁迫的响应等方面密切相关，在植物的生长发育和代谢活动中具有重要作用。转化酶也是催化蔗糖降解的重要酶类，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，还是控制淀粉合成的关键酶，测定转化酶活性对了解光合产物的贮存、转运及累积都有重要意义。

通过本实验要掌握三种酶的作用、酶活力测定的原理和方法、学习酶活力的计算方法，了解糖类水解。

二、实验原理

1.蔗糖合成酶催化蔗糖的水解反应：蔗糖

+UDP 果糖+UDPG。

2.转化酶催化蔗糖的水解反应：蔗糖+H2O—►葡萄糖+果糖。根据催化反应所需的最适PH,可将转化酶分为两种：一种称为酸性转化酶，主要分布在液泡和细胞壁中，另一类转化酶称为碱性或中性转化酶，主要分布在细胞质中。

黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身

蔗糖合成酶

被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量,从而计算得到相应酶活性。

三、材料、器材与试剂

材料：红薯叶片

器材：天平、研钵、恒温水浴锅、沸水浴锅、离心机、分光光度计

试剂：

1.蔗糖合成酶活性测定

①提取液（50mMHepes-NaOH,PH7.5、把那几种试剂抄下来）

②反应液（三种试剂抄下来）

③终止试剂（两种试剂）

2.转化酶活性测定

①提取液同上

②反应液酸性Inv:醋酸……；碱性Inv：试剂

③终止试剂 DNS同上

四、实验步骤

1.蔗糖合成酶活性测定实验

①绘制标准曲线

准确称取100mg无水葡萄糖,溶于蒸馏水并定容到100ml,使用时再稀释10倍,得到100μg/mL 葡萄糖溶液，将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中加热10 min ，取出冷却，按照下表加入各试剂，最后在540 nm 波长下，以吸光度为纵坐标，含葡萄糖量（ug）为横坐标绘制标准曲线。

②酶液提取

剪取红薯叶片叶尖部分进行称量得0.3245g，放入研钵中并加入2mL提取液进行研磨，然后用3mL提取液进行洗涤，全部转移进离心管中。放入离心机中，在转速为15000g下离心20分钟，然后将上清液转入另一个离心管中放入冰块中备用。

③反应

取一支试管，用移液枪加入450uL反应液和200uL酶液，此时开始计时，放入30℃恒温水浴锅中保温30分钟。

④终止反应

30分钟后，向试管中加入250uLTricine-KOH和500uLDNS试剂，放入沸水浴中加热10分钟，然后取出冷却至室温，加入4mL蒸馏水。

⑤吸光度测定

在540nm波长下，测定吸光度，记录数据，计算酶活。

2.转化酶活性测定

①酶液提取同上

②反应

取两支试管，分别加入200uL蔗糖，然后其中一支试管中加入2200uL醋酸-NaOH，另一支加入2200uL醋酸钠-醋酸，再分别加入100uL酶液，计时，放入30℃恒温水浴锅中保温30分钟。

③终止反应

两支试管分别加入1000uLDNS试剂，再放入沸水浴中加热5分钟，然后取出冷却。

④吸光度测定

在540nm波长下，测定吸光度，记录数据，计算酶活。

五、实验结果与分析

酶活性（ug·g−1·ℎ−1）=X×V1

V2×W×t

X:反应液催化产生的葡萄糖总量（ug）

V1:提取酶时加入的缓冲液体积（mL）

V2:酶反应时加入的酶液体积（mL）

W:样品重量（g）

T:反应时间（h）

=53.18ug 根据标准曲线得待测液中葡萄糖量X1=1.5083+0.0711

0.0297

=8194.14（ug·g−1·ℎ−1）则待测液中蔗糖合成酶活性=53.18×5

0.2×0.3245×0.5

酸性条件下：

=4.00ug

根据标准曲线得待测液中葡萄糖量X2=0.1663+0.0711

0.0297×2

=1232.67（ug·g−1·ℎ−1）

待测液中酸性转化酶活性= 4.00×5

0.1×0.3245×0.5

碱性条件下：

=7.95ug

根据标准曲线得待测液中葡萄糖量X3=0.4031+0.0711

0.0297×2

=2449.92（ug·g−1·ℎ−1）

待测液中碱性转化酶活性=7.95×5

0.1×0.3245×0.5

从计算结果可知，蔗糖合成酶活性最高，其次为碱性转化酶和酸性转化酶。

影响本次实验结果准确性的因素主要有以下几点：