HIV检测及临床意义

0 2 3 5 23 29 52 38 126 136 230 125 947 1045 171 299 216 261 274 531 1567 2649 3343 3306 4677 4527 1342 9824
年
份
HIV感染可通过两种途径检测
1. 直接检测病毒或其组成部分
2. 检测人体HIV免疫反应——HIV特异性抗体
样
本
选用初筛试剂
初筛检测
阳性反应
原有试剂＋另一 种原理初筛试剂
阴性反应
重复检测
阴Fra Baidu bibliotek报告
均阳性反应 送确认
一阴一阳
均阴性反应 阴性报告
HIV抗体初筛检测流程图
快速诊断试剂：
采用乳胶凝集、免疫斑点和免疫层析三种 原理 快速、不需特殊仪器
敏感度、特异度低于ELISA，且价格贵
适用于血站覆盖不到的边远地区/城市大 医院急诊手术前检查 快速诊断阳性结果还需经ELISA方法验证
HIV检测及临床意义
中国医科大学附属一院 艾滋病确认实验室
尚
红
——HIV的发现
Montagnie (LAS) 1983. Science 220: 868-871 Gallo (HTLV) 1983. Science 220: 865-86 Levy (ARV) 1984. Science 225: 840-842
• 应附上仪器打印的数据。
各种HIV定量检测方法的比较
Roche 技术 结果 比较 优点 RT-PCR 约2xbDNA 2.0 Bayer (前Chiron) bDNA 2.0版结果约为RT-PCR的50%， 3.0版结果与Roche 基本相同 操作时间较少 对A-G亚型有较好的反应性 Organon Nuclisens HIV-1 QT 与Roche 基本相同
第三代
病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O
病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O
IgM / IgG 抗体 HIV-1 / -2 / -O
第四代
病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 Ab
病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 抗体
HIV抗体诊断
目前临床上实际应用的是测定特异 性HIV抗体，包括初筛和确认实验。
一、检测试剂
筛查试剂必须是HIV-1/2混合型、经国家药品监 督管理局注册批准、批批检合格、临床评估质 量优良、在有效期内的试剂。 目前常用的筛查试剂有酶联免疫、颗粒凝集和 其它快速诊断试剂。采供血机构进行血液筛查 应采用酶联免疫试剂。 自采自供血的单位必须进行HIV抗体检测，在 尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区可由经 过培训的技术人员在规定的场所用快速试剂进 行血液筛查。
W eeks
5、预测疾病进程
• HIV疾病进程与病毒载量 的关系十分密切，观察 感染者病毒RNA水平可大 致预测其发病的可能。 如右图所示，病毒载量 与6年发病率的关系为： <500时5.4%， 501-3000 时16.6%，3001-10000时 31.7%，10001-30000时 55.2%，>30000时则为 80%。
从感染到血清抗体阳转有一段窗口期，平均为1-3个 月，有一小部分HIV感染者出现延迟反应
HIV感染后抗原和抗体的变化 及其与疾病关系
HIV感染人体后出现一过性病毒血症，6-8周后血 清抗体阳转，病毒滴度降低，在随后的5-8年无症
状带毒期里HIV抗体一直存在，但病毒难查到。进
入AIDS期后血浆中病毒再次出现。 故诊断HIV感染多数时间用抗体检测诊断，极早期 （窗口期）用抗原检测。
通过监测病毒滴度反映疗效
Tre a t m e n t
10000000
O b s e rva t io n
M ed i a n H C V R N A (c op i e s / m L ).
1000000
100000
10000
•
1000
100 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
HIV抗体确认
常用的确认实验方法是免疫印迹法（WB）。 免疫印迹试剂有HIV-1/2混合型和单一型。
一般先用HIV-1/2混合型试剂进行检测
蛋白印迹实验（WB）
——广泛使用的确认实验
用聚丙烯酰胺凝胶电泳将纯化的HIV蛋白抗原 分开后转移到硝酸纤维膜上。标本中存在的 HIV抗体与条带上的抗原结合，再加入酶偶联 的抗人IgG抗体和底物，在抗原抗体结合的部位 会出现有色条带 其可检测标本中针对HIV不同抗原的抗体，故 被用做确认试剂。 不同的研究机构有不同的判定标准
1986
国际病毒分类委员会： HIV
HIV-2 1986 西非
中国每年新发现的HIV/AIDS 病例数（1985~2002）
15000
病例数
AIDS HIV(+)
10000 5000 0
AIDS HIV(+)
198 198 198 198 198 199 199 199 199 199 199 199 199 199 199 200 200 200 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 1 5 0 1 2 9 0 7
2、确认试剂必须经国家药品监督 管理局注册批准。确认试剂包括免疫 印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光 试验试剂。目前以免疫印迹试剂最为
常用。
1. ELISA方法：
目前最常用的初筛实验，自1985年首次
检测HIV-1抗体的试剂盒供市以来，已
从第一代的全病毒抗原间接法发展到第
四代的以重组的多肽抗原及抗P24抗体包
来自文献或自行设计，应尽量涵盖所有的或常见
的毒株，也可使用复合引物。
定量检测
• 定量检测常用于监测HIV感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。 目前常用的HIV RNA定量测定方法有逆转录PCR实验（RT-PCR）、 核酸序列扩增实验（NASBA）、分支DNA杂交实验（bDNA）等，这 几种进口试剂盒的最低检测限为20-50拷贝/毫升 • 按照仪器读数报告结果，应注明使用的试验方法、样品种类和样 品量。 • 测定结果小于最低检测限时，应注明最低检测限水平。注意低于 最低检测限的结果不能排除HIV感染。
IgM / IgG 抗体 HIV-1 / -2 / -O p24 抗原
Closing the window
HIV antigen 4th gen 3rd gen IgM ab IgG ab 1st-2nd gen
Detection limit
<= window
=>
=>
=>
第一代试剂检测IgG抗体，第三代试剂检测IgG 、IgM抗体, 第四代试剂同时检测IgG、 IgM抗体和P24抗原使窗口期缩短。
被的双夹心法，使窗口期缩短了2-3周。
四代艾滋病酶联免疫试剂比较
solid phase conjugate specific detection of IgG 抗体 HIV-1
第一代
病毒裂解液 HIV-1
-IgG抗体
第二代
病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2
IgG抗体
IgG 抗体 HIV-1 / -2
P24抗原测定
（一）适用范围
HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。 HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。 第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈
阳性反应， 但HIV-1抗体确认阴性者的诊
断。 监测病程进展和抗病毒治疗效果。
（三）结果报告和解释
1、HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中和试验 确认。 2、HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊 断依据，不能依此确诊。 3、HIV-1 P24抗原阴性结果只表示在本试验中无 反应，不能排除HIV感染。
80 70 60 50 40 30 20 10 0 6年发病率
<500 501-3000 3001- 10001- >30000 10000 30000 血浆病毒载量（拷备数/毫升）
定性检测
• HIV核酸检测有定性和定量两类，定性检测用于 HIV感染的辅助诊断。通常使用PCR或RT-PCR技术， 使用分子生物学实验室通用的扩增试剂，引物可
免疫印迹法(HIV1/2混合型)
出现HIV-2指带
阴性反应 HIV-1阳性反应 可疑反应 免疫印迹法（HIV-2） 阴性报告 HIV-1阳性报告 阳性反应 阴性反应
报告HIV-2血清学阳性反 应报告必要时测核酸
可疑反应 阴性报告
每3个月随访一次，共2次，仍属可疑，则作阴性报告如随访期间出现阳性反应则报告阳性
WB结果判定标准
组 织 WHO 阳 性 阴 性
2 ENV+GAG+POL 1 ENV + p24/p31
无条带或只有P17 无条带
FDA（USA）
CHINA
２ENV 或１ENV+p24 无HIV-1特异性条带
“不确定”(±)：出现HIV-1特异性条带，但带型不足以
确认阳性，每三个月随访一次，共两次， 仍属可疑，判为阴性
检测结果的报告和处理
阴性反应出具HIV抗体阴性报告， 如果近期有高危行为，如性乱、注射毒品等，或有急 性流感样症状等情况，为排除“窗口期”的可能，可 以进行HIV-1 P24抗原或HIV核酸检测，或2－3个月以 后再做抗体检测。 筛查实验呈阳性发现反应，可出具“HIV抗体待复查” 的报告，不能出阳性报告。
HIV-1抗体特异带
env gag pol gp160/gp120gp41 p55、p24、p17 （或p18） p66（或p65）、p51、 p31
HIV-2抗体特异带
gp140/gp105、gp36， 也可为gp125/gp80、gp36 p56、p26、p16 p68、p53、p34
HIV抗体确认检测流程图
2、窗口期辅助诊断
• 在窗口期抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高 峰，通常此高峰高于发病时的血浆病毒水平，早期病
毒RNA测定具有特殊的意义。
• 目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行 多个样品混合后的RNA检测以降低窗口期传播的残余危 险度。
3、病程监控
• 由于HIV感染发生后病毒载量的变化具有一定规律，并 且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。
HIV核酸检测
1、辅助诊断
• 某些非典型的抗体反应，特别是不确定反应时，RNA的测 定可提供非常有用的证据。
• 单纯使用RNA测定不能完全确定感染与否，但当RNA测定 出现较高拷贝数的阳性结果时（>1000）提示感染发生的 可能性非常大。 • 使用此指标应综合其他检测数据和样品背景情况进行综 合分析与判断。
通过了 FDA认证 假阳性结果较bDNA少 1.5版对A-G亚型有较好的反应性
通过了 FDA认证 可使用多种组织，如生殖道分泌 液 对A-G亚型有较好的反应性 检测范围大 早期版本（NASBA）对部分亚 型（G亚型）反应性差。 操作复杂，样品提取(不使用自 动提取仪时)和测定反应时需要进 行大量的手工操作。 不适合一次大量检测，ECL读数 仪每次只能进行12个样品的检测 。 实验内、外误差相对较大。
缺点
操作容易污染 测定范围较小（相对于NASBA ） 少数生物样品反应受抑制，如精 液、乳汁和唾液 早期版本对部分亚型反应性较差 ，1.0版对非B亚型的样品反应性 普遍较差，（5）版通过改进 对O亚型检测能力较差
对低值样品检测的特异性较差。 无内部质量控制，尤其在3.0版 中为单孔检测时，无法控制由于 提取或加样操作的失误。 不同版本间差异较大，2.0版约 为RT-PCR50%，3.0版结果与 Roche 基本相同表明两个版本间 差异可能达到50%。 对除血浆、血清外的大部分体液 样品无法进行检测。 对抗凝剂敏感，只能使用EDTA 。 bDNA 3.0版: 100-500,000 c/mL
• 通常在感染后无症状期内发生的临床症状很难与AIDS 发病时的症状区别，病毒载量测定可以帮助医生判断 一个刚发生的症状是否与HIV感染有关。
4、指导治疗方案及疗效测定
• 并非在任何情况下感染者都应该 进行抗病毒治疗，这不但是经济 上的原因，更重要的是在于抗病 毒药物的副作用和疗效。通常在 病毒载量达到一定水平后（如 >35000-50000拷贝/毫升）才具 有良好的效果。 只有通过治疗后病毒水平的检测 才能确定治疗是否有效，通常治 疗后病毒水平降低50%才被认为 临床有效。