实时定量PCRPPT课件
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实时荧光定量PCR在临床医学中的应用ppt课件
主要内容
➢罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案 ➢基因诊断
• 病原体测定 • 肿瘤诊断
• 突变检测——个性化用药 • 甲基化 • 基因差异表达
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
高分辨率熔解曲线 定义
罗氏应用科学部整合细胞组学和基因组学的研究流程
5
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
LightCycler® Real-Time PCR Platform
超过十年的实时荧光 PCR 的技术革新
纯合子
杂合子
VS
不饱和双链DNA荧光染料
SYBR Green I • 纯合子和杂合子的熔解曲线基本相同
饱和双链DNA荧光染料
vs
ResoLight、LCGreen、EvaGreen
• 都为绿色荧光染料，最佳激发波长范围440470nm，发射荧光波长470-520nm。
• 序列的变化会导致熔解曲线的显著变化
LightCycler 480 HRM 应用介绍
基因扫描– 显著降低测序成本
• 甘露糖结合凝集素MBL2基因序列变异分析 (384 个样本, 扩增子长度219 bp): 4种 最常见的基因型在图像上被分为4组; 少量样本呈现另外的3种遗传变异
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
HBsAg和HBeAg均阳性而HBV DNA阴性？
• 干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。
➢罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案 ➢基因诊断
• 病原体测定 • 肿瘤诊断
• 突变检测——个性化用药 • 甲基化 • 基因差异表达
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
高分辨率熔解曲线 定义
罗氏应用科学部整合细胞组学和基因组学的研究流程
5
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
LightCycler® Real-Time PCR Platform
超过十年的实时荧光 PCR 的技术革新
纯合子
杂合子
VS
不饱和双链DNA荧光染料
SYBR Green I • 纯合子和杂合子的熔解曲线基本相同
饱和双链DNA荧光染料
vs
ResoLight、LCGreen、EvaGreen
• 都为绿色荧光染料，最佳激发波长范围440470nm，发射荧光波长470-520nm。
• 序列的变化会导致熔解曲线的显著变化
LightCycler 480 HRM 应用介绍
基因扫描– 显著降低测序成本
• 甘露糖结合凝集素MBL2基因序列变异分析 (384 个样本, 扩增子长度219 bp): 4种 最常见的基因型在图像上被分为4组; 少量样本呈现另外的3种遗传变异
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
HBsAg和HBeAg均阳性而HBV DNA阴性？
• 干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。
实时荧光定量PCR技术全面分析ppt课件
定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终 精确的对起始模板的定量分析
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
实时定量PCR.ppt
4μL
dNTPs
1μL
RNAse inhibitor
1μL
M-MLV
1μL
1、混匀，42℃，90min
D2E、PC7-0Tr℃eat，ed 1H02Omin，终止反应
xμL
3、A3检测
反向PCR (reverse） PCR)
❖ 反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外 的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列 进行扩增。
❖ Tm ❖ 72℃ ❖ 72℃ ❖ 12℃
常用PCR反应条件
2-5min 30-40s 30-45s 1min/1kb 10min +∞
25-35个循环
几种常用PCR技术
❖ RT-PCR (Reverse Transcription PCR) ❖ 反向PCR (Reverse PCR) ❖ RACE (Rapid-Amplification of cDNA Ends) ❖ qRT-PCR (Quantitative Real Time PCR)
1、单、双链DNA，cDNA均可 2、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合 酶抑制剂DNA结合蛋白类 3、一般100ng DNA模板/100L,模板浓度 过高会导致反应的非特异性增加
（2）引物
1、引物浓度一般为0.1-0.5 mol/L，浓度过高易 导致模板与引物错配,反应特异性下降
2、引物的设计
（3）Taq DNA聚合酶
3、Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
（5）dNTP
1、dNTP浓度取决于扩增片段的长度 2、四种dNTP浓度应相等 3、浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则 降低反应产量 4、dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降， 影响DNA聚合酶的活性。
实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用ppt课件
pcrrtpcr反应体系模板45ltagmixture50l025l荧光染料sybrgreen荧光标记的探针taqman探针法rtpcrmonitoringpcrsybrgreendyesybrgreen变性退火延伸rtpcrsybrgreenrtpcr10rtpcrmonitoringpcrtaqmantaqman法11rtpcrtaqman法12taqmanrtpcr13?绝对定量absolutequantificationaq病原体检测转基因食品检测基因表达研究?相对定量relativequantificationrq基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究rtpcr14相对定量通过内标定量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数rtpcr内标endogenouscontrol通常是18s28sactingapdh基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定受环境因素影响小15rtpcr16rtpcrctpcr扩增循环数荧光域值threshold的设定在定量pcr中需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底信号
4
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
5
RT-PCR技术的原理及试验流程
6
RT-PCR技术的原理及试验流程
7
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
4
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
5
RT-PCR技术的原理及试验流程
6
RT-PCR技术的原理及试验流程
7
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
最新实时荧光定量PCR介绍PPT课件
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
实时荧光定量PCR介绍
常用于SNP解析，病毒、病源菌检测
3/12/2024 • 11
主要内容
2
Real Time PCR实验方法
反转录反应
Real Time PCR反应
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 12
RT Primer的选择
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
RT
目的基因
Total RNA cDNA
T7 Promoter
PCR
目的基因
TTTT•••T
PCR产物
T7 RNA polymerase
AAAA•••A
体外转录RNA
AAAA•••A
RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
• Random Primer • Oligo dT Primer • Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 13
进行相对表达量分析。
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 32
相对定量解析方法
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、β-actin等。
筛选方法
• 根据文献提供 • 通过具体实验筛选
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 33
主要内容
-实时荧光定量PCRppt课件
标准品的稀释 Real-time PCR 数据的分析 Real-time PCR产物的电泳
荧光定量 PCR 所使用的荧光化学可分为两种：荧光 探针和荧光染料。
荧光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法和 Taqman 水解探针 的特异性方法，
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
解曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量结果。另外， 因为 SYBR Green I 不能区分不同扩增子发出的荧光而导致它不能用于多重反
应。
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
-实时荧光定量 PCR
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
（一）实时荧光定量PCR原理 和应用
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
PCR 定量PCR 荧光化学监测物质 实时荧光定量PCR应用
ＰＣＲ技术
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告PPT课件
纵坐标为起始拷贝数对数值横坐 标为Ct值时的数学模型
重新重理（4）式 Log YCt = LogX +Ct×Log ( 1+E ) 可得： LogX = -Ct×Log ( 1+E ) + Log YCt (5)
纵坐标为起始拷贝数对数值横坐 标为Ct值时的数学模型
根据Y= AX+B，（5）式中的Y = LogX，X = Ct，A = -Log ( 1+E )，B = Log YCt 从A = -Log ( 1+E )中，可计算PCR反应的扩增效率E = 10-A-1 （6） 如果 A = -0.301，代入（6）式可得：E = 1，即扩增 效率为100%。 如果 A = -0.201，代入（6）式可得：E = 0.589，即 扩增效率为58.9%。 这样可以判断是否需要优化反应条件。此时，斜率A 必≥-0.301。 截距B = Log YCt ，其与阈值线的选定直接相关，应 为Ct值趋向于0时的原始模板拷贝数的对数值。
基本概念
绝对定量（Absolute quantitation） 绝对定量是使用一系列稀释 的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定，根据系列浓度标 准品的Ct值与起始模板（RNA或cDNA）量之间的线性比例关系， 绘制标准曲线。待测标本的浓度则可根据其测定的Ct值，从标准 曲线或回归方程计算得到原始模板的数量。这种方法是假定所有 的标准品和临床标本有相近的扩增效率。系列稀释标准品的浓度 应包含临床标本的浓度范围，并且在实时PCR仪及检测试剂方法 的准确度和线性范围内。 系列稀释的标准品最好是RNA，也可以是双链DNA片段、单链 DNA或载有靶序列的质粒。标准品必须是纯的，与RNA标准品相 比，DNA有相对较好的稳定性、重复性和敏感性，但其与逆转录 没有关系，不能反映逆转录效率。
实时荧光定量PCR技术ppt课件
斜率与扩增效率
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
荧光定量PCR化学原理
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个
2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率：
2 –ΔΔCT=表达量的比值
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
平台PCR仪介绍
ABI 7500 fபைடு நூலகம்st
特征：
使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直
观
ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差
（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光
性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性
（如孔间、批间温度的波动）
Rn= Normalization = Reporter / Referenc
基因在不同组织中的表达差异
药物疗效考核
耐药性研究
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
实时荧光定量PCR技术原理ppt课件
样本处理与RNA提取
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
相关主题
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12
（1）模板
1、单、双链DNA，cDNA均可 2、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合 酶抑制剂DNA结合蛋白类 3、一般100ng DNA模板/100L,模板浓度 过高会导致反应的非特异性增加
13
（2）引物 1、引物浓度一般为0.1-0.5 mol/L，浓度过高易 导致模板与引物错配,反应特异性下降 2、引物的设计
实时定量PCR （qRT-PCR）
实时定量PCR （qRT-PCR）
1
Polymerase Chain Reaction（PCR） 聚合酶链式反应 伟大的天才发现！
2
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
组成
体积
5X Buffer
4μL
dNTPs
1μL
RNAse inhibitor
1μL
M-MLV
1μL
1、混匀，42℃，90min
D2E、PC7-T0r℃eat，ed 1H02Omin，终止反应 xμL
3、A3检测 27
反向PCR (reverse） PCR)
❖ 反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外 的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列 进行扩增。
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十 余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆 炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
3
PCR的基本原理
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变 单性 链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
4
PCR的基本原理
94℃
模板DNA
5
引物2
5702-℃65℃
DNA引物
引物1
6
PCR的基本原理
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
72℃
7
PCR的基本原理
❖ PCR反应条9件4℃
❖ PCR过程 ❖ PCR的特点
在冰盒上加入以下试剂：
组成
体积
随机引物或Oligo dT）
1μL
1-5μg Total RNA
xμL
DEPC-Treated H2O
yμL
体系配制完成后瞬时离心，70℃反应
5min,然后迅速转移至冰盒，冰浴2-5min,
此步骤的作用是去除mRNA的二级结构。
26
RT-PCR一般步骤
在冰盒上加入以下试剂：
❖ 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的克隆,扩增基因的插入DNA；建立基 因组步移。
未知序列
已知序列
未知序列
28
反向PCR原理
未知序列 限制酶
已知序列 连接酶
未知序列 限制酶
29
RACE (rapid-amplification of cDNA ends)
22
RT-PCR (反转录PCR)
DNA水平
基因
RNA水平 蛋白水平
mRNA 蛋白质多肽链
23
RT-PCR基本原理
mRNA
mRNA
cDNA
AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT Reverse Transcription
AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT
24
RT-PCR一般步骤
常用PCR反应体系 (以HiFi Taq为例)
❖ 模板
1.0 μL
❖ 上游引物 ❖ 下游引物
0.5 μL 0.5 μL
❖ 10X HiFi Buffer（+Mg2+） 2.5 μL
❖ Taq酶
0.2-0.3 μL
❖ ddH2O ❖共
补足25 μL
20
25 μL
❖ 94℃ ❖ 94℃
14
（3）Taq DNA聚合酶
1、酶的用量一般为0.5-2.5 U/50 l， 2、酶量增加使反应特异性下降;酶量过少 影响反应产量。
15
（4）Mg2+
1、Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，一般用量为 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。
2、Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降 ； Mg2+过高影响反应特异性。
17
(1)变性 使双链DNA解链为单链,94℃ 30-40s (2)退火 ❖ 温度由引物长度和GC含量决定。 ❖ 增加温度能减少引物与模板的非特异性结
合;降低温度可增加反应的灵敏性。
18
循环参数
（3）延伸 ❖ 68-75℃,一般为72℃ ❖ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 ❖ 主要取决于模板DNA的浓度,一般为25-35次 ❖ 次数过多,扩增效率降低,错误掺入率增加 19
第1轮结束 第2轮开始
8
PCR的基本原理 ❖ Taq❖
PPCCRR反过应程条567052件-℃℃
❖ PCR的特点
Taq
Taq
Taq
9
PCR的基本原理
❖ PCR反应条件 ❖ PCR过程 ❖ PCR的特点
第2轮结束
10
PCR基本原理
11
PCR反应基本要素
模板
Mg2+
DNA 聚合酶
PCR
dNTP
引物
3、Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
16
（5）dNTP
1、dNTP浓度取决于扩增片段的长度 2、四种dNTP浓度应相等 3、浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降 低反应产量 4、dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降， 影响DNA聚合酶的活性。
❖ Tm ❖ 72℃ ❖ 72℃ ❖ 12℃
常用PCR反应条件
2-5min 30-40s 30-45s 1min/1kb 10min +∞
25-35个循环
21
几种常用PCR技术
❖ RT-PCR (Reverse Transcription PCR) ❖ 反向PCR (Reverse PCR) ❖ RACE (Rapid-Amplification of cDNA Ends) ❖ qRT-PCR (Quantitative Real Time PCR)
❖ 1、RNA提取
RNA质量的检测 一般RT-PCR要求提取的RNA要有较高的完整性和纯度
2
8 S
完整性检测（1%琼脂糖胶电泳）
纯度检测（OD260/280）
1
8
OD260/280一般介于1.9-2.1之间，小于1.9
S
时蛋白污染；大于2.1时RNA发生降解
5 S
25
❖ 2、反转R录T-PCR一般步骤
（1）模板
1、单、双链DNA，cDNA均可 2、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合 酶抑制剂DNA结合蛋白类 3、一般100ng DNA模板/100L,模板浓度 过高会导致反应的非特异性增加
13
（2）引物 1、引物浓度一般为0.1-0.5 mol/L，浓度过高易 导致模板与引物错配,反应特异性下降 2、引物的设计
实时定量PCR （qRT-PCR）
实时定量PCR （qRT-PCR）
1
Polymerase Chain Reaction（PCR） 聚合酶链式反应 伟大的天才发现！
2
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
组成
体积
5X Buffer
4μL
dNTPs
1μL
RNAse inhibitor
1μL
M-MLV
1μL
1、混匀，42℃，90min
D2E、PC7-T0r℃eat，ed 1H02Omin，终止反应 xμL
3、A3检测 27
反向PCR (reverse） PCR)
❖ 反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外 的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列 进行扩增。
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十 余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆 炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
3
PCR的基本原理
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变 单性 链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
4
PCR的基本原理
94℃
模板DNA
5
引物2
5702-℃65℃
DNA引物
引物1
6
PCR的基本原理
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
72℃
7
PCR的基本原理
❖ PCR反应条9件4℃
❖ PCR过程 ❖ PCR的特点
在冰盒上加入以下试剂：
组成
体积
随机引物或Oligo dT）
1μL
1-5μg Total RNA
xμL
DEPC-Treated H2O
yμL
体系配制完成后瞬时离心，70℃反应
5min,然后迅速转移至冰盒，冰浴2-5min,
此步骤的作用是去除mRNA的二级结构。
26
RT-PCR一般步骤
在冰盒上加入以下试剂：
❖ 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的克隆,扩增基因的插入DNA；建立基 因组步移。
未知序列
已知序列
未知序列
28
反向PCR原理
未知序列 限制酶
已知序列 连接酶
未知序列 限制酶
29
RACE (rapid-amplification of cDNA ends)
22
RT-PCR (反转录PCR)
DNA水平
基因
RNA水平 蛋白水平
mRNA 蛋白质多肽链
23
RT-PCR基本原理
mRNA
mRNA
cDNA
AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT Reverse Transcription
AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT
24
RT-PCR一般步骤
常用PCR反应体系 (以HiFi Taq为例)
❖ 模板
1.0 μL
❖ 上游引物 ❖ 下游引物
0.5 μL 0.5 μL
❖ 10X HiFi Buffer（+Mg2+） 2.5 μL
❖ Taq酶
0.2-0.3 μL
❖ ddH2O ❖共
补足25 μL
20
25 μL
❖ 94℃ ❖ 94℃
14
（3）Taq DNA聚合酶
1、酶的用量一般为0.5-2.5 U/50 l， 2、酶量增加使反应特异性下降;酶量过少 影响反应产量。
15
（4）Mg2+
1、Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，一般用量为 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。
2、Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降 ； Mg2+过高影响反应特异性。
17
(1)变性 使双链DNA解链为单链,94℃ 30-40s (2)退火 ❖ 温度由引物长度和GC含量决定。 ❖ 增加温度能减少引物与模板的非特异性结
合;降低温度可增加反应的灵敏性。
18
循环参数
（3）延伸 ❖ 68-75℃,一般为72℃ ❖ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 ❖ 主要取决于模板DNA的浓度,一般为25-35次 ❖ 次数过多,扩增效率降低,错误掺入率增加 19
第1轮结束 第2轮开始
8
PCR的基本原理 ❖ Taq❖
PPCCRR反过应程条567052件-℃℃
❖ PCR的特点
Taq
Taq
Taq
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PCR的基本原理
❖ PCR反应条件 ❖ PCR过程 ❖ PCR的特点
第2轮结束
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PCR基本原理
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PCR反应基本要素
模板
Mg2+
DNA 聚合酶
PCR
dNTP
引物
3、Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
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（5）dNTP
1、dNTP浓度取决于扩增片段的长度 2、四种dNTP浓度应相等 3、浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降 低反应产量 4、dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降， 影响DNA聚合酶的活性。
❖ Tm ❖ 72℃ ❖ 72℃ ❖ 12℃
常用PCR反应条件
2-5min 30-40s 30-45s 1min/1kb 10min +∞
25-35个循环
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几种常用PCR技术
❖ RT-PCR (Reverse Transcription PCR) ❖ 反向PCR (Reverse PCR) ❖ RACE (Rapid-Amplification of cDNA Ends) ❖ qRT-PCR (Quantitative Real Time PCR)
❖ 1、RNA提取
RNA质量的检测 一般RT-PCR要求提取的RNA要有较高的完整性和纯度
2
8 S
完整性检测（1%琼脂糖胶电泳）
纯度检测（OD260/280）
1
8
OD260/280一般介于1.9-2.1之间，小于1.9
S
时蛋白污染；大于2.1时RNA发生降解
5 S
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❖ 2、反转R录T-PCR一般步骤