高产辅酶Q_10_类球红细菌的化学诱变筛选及其发酵培养基优化_扶教龙
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将甘油管保存的菌种稀释涂布到基础平板培养基 上，32 ℃条件下静置培养7 d；待菌落生长成熟后，挑起平 板上单个菌落接入种子培养基，于32 ℃条件下200 r/min振 荡培养24 h。装液量均为50 mL/250 mL。
1.3.2 发酵培养 取种子培养液以8%（V/V）接种量接入发酵培养基，
于32 ℃条件下200 r/min振荡培养72 h。 1.3.3 CoQ10的超声辅助酸热破壁提取
对羟基苯甲酸、氯化锂、亚硝基胍、维生素K3、叠氮化 钠、CoQ10标准品，甲醇、乙醇（色谱纯）：阿拉丁试剂（上海） 有限公司；葡萄糖、酵母提取物、琼脂粉、氯化钠、磷酸二氢 钾、MgSO4·7H2O、盐酸硫胺、生物素、烟酸、NaOH、谷氨酸 钠、硫酸铵、CaCO3、无水乙醇、乙酸乙酯：国药集团化学试 剂有限公司；玉米浆干粉：上海缘肽生物有限公司。 1.2 仪器与设备
2016 Vol.35 No．6
·90· Serial No．292
China Brewing
Research Report
高产辅酶Q10类球红细菌的化学诱变筛选及其发酵培养基优化
扶教龙，钱大伟*，吴晨奇，徐敏强，胡翠英，李良智
（苏州科技大学 化学与生物工程学院，江苏 苏州 215000）
摘 要：利用菌株对（维生素K3+叠氮化钠+对羟基苯甲酸）的复合抗性作为筛选标记，对产辅酶Q10的类球红细菌（Rhodobacter
LC-20AT高效液相色谱：日本岛津企业管理（中国）有 限公司；UNE500灭菌烘箱：德国MEMMERT公司；SW-CJ2FD超净台：苏州净化设备有限公司；TS-2102型摇床：上 海天呈科技有限公司；GHP隔水式恒温培养箱：上海精宏 实验设备有限公司。 1.3 实验方法 1.3.1 菌种活化和种子培养液的制备
提高菌株生产CoQ10的能力，以实现CoQ10的工业化生产[5]。 由于CoQ10的生物合成途径比较复杂，涉及到超过20
种中间产物和调控相关反应的酶类。目前通过基因工程 方法通过改变某一或某几个关键酶基因的表达来提高发 酵菌株中CoQ10的含量并实现工业化生产仍存在一定困 难，传统的物理化学诱变育种手段仍是获得CoQ10高产菌 株的有效方法。郑君等[6]以球形红假单胞菌（Rhodopseudomlonas sphaeroides）1.1737T为出发菌株，经紫外线和亚 硝基胍诱变，并结合罗红霉素和对羟基苯甲酸抗性突变 株筛选，获得了一株CoQ10产量为50.6 mg/L的高产突变株 PHBR-2，较出发菌株产量提高了90.9%。YOSHIDA H等[7] 对 类 球 红 细 菌（Rhodobacter sphaeroides）KY-4113 进 行 NTG诱变筛选耐L-乙硫氨基酪酸的突变株，获得的一株绿 色突变株，该株菌可能丧失合成红色类胡萝卜素的能力而
Abstract: Using multiple resistance of vitamin K3, NaN3 and p-hydroxybenzoie acid (PHBA) as selective marker, CoQ10-producing Rhodobacter sphaeroides was mutated by nitrosoguanidine (NTG), and the high CoQ10-producing strains was screened. The fermentation medium was optimized by response surface methodology. Results showed that a strain R.sp3-7 with genetic stability and high CoQ10-production was obtained by mutation breeding. The optimum component of fermentation medium was glucose 31.7 g/L, corn steep powder 5.6 g/L, (NH4)2SO4 5.3 g/L, sodium glutamate 3.0 g/L, NaCl 3.0 g/L, MgSO4·7H2O 12.5 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, CaCO3 2.0 g/L and auxiliary fluids 1 ml/L. Under the conditions, the yield of CoQ10 produced by mutant strain R.sp3-7 was up to (93.63±0.59) mg/L, which was increased by 116.8% than that produced by original strain. Key words: CoQ10; resistant plate; chemical mutagenesis; response surface methodology; Rhodobacter sphaeroides
CoQ10标准曲线的制作：称取10 mg的CoQ10标准品溶 于50 mL的无水乙醇中，得200 mg/L的CoQ10母液，以此母 液出发分别稀释至 质量浓度分别为40 mg/L、80 mg/L、 120 mg/L和160 mg/L的标准溶液。通过HPLC分析获得 CoQ10各标准液质量浓度对应的峰面积，并建立CoQ10质量 浓度与峰面积之间的关系曲线。按照CoQ10标准曲线回归 方程计算发酵液中CoQ10的含量。 1.3.5 诱变方法
中图分类号：TS201.3
文章编号：0254-5071（2016）06-0090-06
doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.019
Screening of high CoQ10-producing Rhodobacter sphaeroides by chemical mutagenesis and its fermentation medium optimization
sphaeroides）使用亚硝基胍进行化学诱变，筛选高产菌株并采用响应面法优化其发酵培养基。结果表明，经诱变选育得到一株遗传稳
定的辅酶Q10高产菌株R.sp3-7，其最佳发酵培养基组成为：葡萄糖31.7 g/L，玉米浆干粉5.6 g/L，（NH4）2SO4 5.3 g/L、谷氨酸钠 3.0 g/L、NaCl
3.0 g/L、MgSO4·7H2O 12.5 g/L、KH2PO4 3.0 g/L、CaCO3 2.0 g/L、辅液1 mL/L。在此培养条件下，诱变菌株R.sp3-7的辅酶Q10产量达
（93.63±0.59）mg/L，与出发菌株相比提高了116.8%。
关键词：辅酶Q10；抗性平板；化学诱变；响应面分析方法；类球红细菌
辅酶Q1（0 coenzyme Q10，CoQ10）广泛存在于高等动物 线粒体内膜中的一种内源性物质，是呼吸链的重要递氢体， 是生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的必需成 分[1]。它具有抗氧化性、清除自由基、提高机体免疫力等功 效，可预防和治疗多种疾病，在治疗心脏衰竭 、延缓皮 肤 衰老等方面具有较广泛的应用[2-4]。因此，经济生产CoQ10 的途径也变得尤为重要。目前，CoQ10的主要生产方法有： 动植物提取法、植物细胞培养法、化学合成法和微生物发 酵法。相比其他三种方法，微生物发酵法生产CoQ10具有分 离过程相对简单、产品活性好、可规模放大生产能力等优 点，成为最有发展潜力的CoQ10生产方法。要实现发酵法 工业化生产CoQ10首先要解决的问题是获得一株高产菌 株。但是自然筛选获得的菌株产量都很低，需要通过诱变 育种、构建工程菌、优化发酵工艺等策略，来最大限度地
收稿日期：2016-03-27 基金项目：苏州市科技计划项目（sYN201317）；苏州科技学院科研基金项目（XKZ201411） 作者简介：扶教龙（1969-），男，副教授，博士，研究方向为生物化工、发酵工程。 *通讯作者：钱大伟（1991-），男，硕士研究生，研究方向为生物化工、微生物育种。
研究报告
中国酿造
2016 年 第 35 卷 第 6 期
总第 292 期
·91·
表达细菌叶绿素，故在肉汤琼脂培养基上呈绿色菌落，该 菌株CoQ10含量比野生株提高20%。
本研究采用超声辅助酸热法对类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）进行CoQ10破壁提取，可实现批量提取 菌体中CoQ10。使用紫外-氯化锂（LiCl）、亚硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）最佳诱变剂量诱变处理，筛选耐维生素K3 （vitamin K3，VK3）、叠氮化钠（NaN3）、对羟基苯甲酸（para hydroxy benzoic acid，PHBA）等前体物质的CoQ10生产菌株。 经过摇瓶发酵初筛、复筛获得CoQ10高产菌株，并使用单因 素与响应面法结合进一步对其发酵培养基组分进行优化 [8-10]，以进一步提高CoQ10产量，为CoQ10在国内的工业化生 产奠定一定的科学基础。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 菌种
发酵培养基：葡萄糖40 g/L，玉米浆干粉3 g/L，谷氨酸钠 3 g/L，NaCl 3 g/L，硫酸铵3 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO·4 7H2O 12.5 g/L，CaCO3 2 g/L，1 mL/L辅液；用NaOH调pH至7.2。 121 ℃灭菌20 min。
辅液：盐酸硫胺1 g/L，生物素0.015 g/L，烟酸1 g/L 。 [11] 1.1.3 化学试剂
（1）菌悬液的制备 取10 mL对 数 生 长 期 的 类 球 红 细 菌 种 子 培 养 液 ， 5 000 r/min离心10 min，弃上清，用无菌生理盐水洗涤两 次，重新悬浮10 mL生理盐水中，即得菌悬液。 （2）抗性浓度确定 将稀释后菌悬液分别涂布在含有不同质量浓度叠氮 化钠（NaN3）、对羟基苯甲酸（PHBA）、维生素K（3 VK3）和空 白的平板培养基中，32 ℃条件下，培养5 d，观察菌落生 长情况。 （3）化学诱变方法 取1 mL质量浓度为5 mg/mL的亚硝基胍母液加入 9 mL菌悬液中，调节终质量浓度为0.5 mg/mL，30 ℃恒温水 浴振荡处理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 后，离心终止反应，稀释涂布到平板培养基中，后置于32 ℃ 避光培养5 d培养，计算活菌数，绘制致死率曲线。致死率 计算公式如下：
FU Jiaolong, QIAN Dawei*, WU Chenqi, XU Minqiang, HU Cuiying, LI Liangzhi
(School of Chemical and Biological Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China)
采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）法进行CoQ10含量的测定。HPLC色谱条件： Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为 甲醇∶异丙醇=3∶1（V/V）；柱温40 ℃；检测波长 275 nm；流 速 1 mL/min；进样量 20 μL。
取发酵液1 mL，加入200 μL 0.02 mol/L HCl，70 ℃、 500 W超声水浴处理15 min。5 000 r/min离心10 min，弃尽 上清。加入5 mL提取液（乙酸乙酯∶乙醇=5∶3，V/V），混匀后 置 于 超 声 波 清 洗 仪 中 超 声 提 取 10 min ， 暗 室 中 抽 提 15 min，每隔5 min摇匀一次。将抽提液10 000 r/min离心 10 min，得CoQ10提取液[12]。 1.3.4 CoQ10含量的测定
类球红细菌（RhodHale Waihona Puke Baidubacter sphaeroides）：由浙江大学于 洪巍教授赠送。 1.1.2 培养基
种子培养基：葡萄糖3 g/L，酵母提取物8 g/L，NaCl 2 g/L，KH2PO4 1.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，1 mL/L辅液； 用NaOH调pH至7.2。121 ℃灭菌20 min。
1.3.2 发酵培养 取种子培养液以8%（V/V）接种量接入发酵培养基，
于32 ℃条件下200 r/min振荡培养72 h。 1.3.3 CoQ10的超声辅助酸热破壁提取
对羟基苯甲酸、氯化锂、亚硝基胍、维生素K3、叠氮化 钠、CoQ10标准品，甲醇、乙醇（色谱纯）：阿拉丁试剂（上海） 有限公司；葡萄糖、酵母提取物、琼脂粉、氯化钠、磷酸二氢 钾、MgSO4·7H2O、盐酸硫胺、生物素、烟酸、NaOH、谷氨酸 钠、硫酸铵、CaCO3、无水乙醇、乙酸乙酯：国药集团化学试 剂有限公司；玉米浆干粉：上海缘肽生物有限公司。 1.2 仪器与设备
2016 Vol.35 No．6
·90· Serial No．292
China Brewing
Research Report
高产辅酶Q10类球红细菌的化学诱变筛选及其发酵培养基优化
扶教龙，钱大伟*，吴晨奇，徐敏强，胡翠英，李良智
（苏州科技大学 化学与生物工程学院，江苏 苏州 215000）
摘 要：利用菌株对（维生素K3+叠氮化钠+对羟基苯甲酸）的复合抗性作为筛选标记，对产辅酶Q10的类球红细菌（Rhodobacter
LC-20AT高效液相色谱：日本岛津企业管理（中国）有 限公司；UNE500灭菌烘箱：德国MEMMERT公司；SW-CJ2FD超净台：苏州净化设备有限公司；TS-2102型摇床：上 海天呈科技有限公司；GHP隔水式恒温培养箱：上海精宏 实验设备有限公司。 1.3 实验方法 1.3.1 菌种活化和种子培养液的制备
提高菌株生产CoQ10的能力，以实现CoQ10的工业化生产[5]。 由于CoQ10的生物合成途径比较复杂，涉及到超过20
种中间产物和调控相关反应的酶类。目前通过基因工程 方法通过改变某一或某几个关键酶基因的表达来提高发 酵菌株中CoQ10的含量并实现工业化生产仍存在一定困 难，传统的物理化学诱变育种手段仍是获得CoQ10高产菌 株的有效方法。郑君等[6]以球形红假单胞菌（Rhodopseudomlonas sphaeroides）1.1737T为出发菌株，经紫外线和亚 硝基胍诱变，并结合罗红霉素和对羟基苯甲酸抗性突变 株筛选，获得了一株CoQ10产量为50.6 mg/L的高产突变株 PHBR-2，较出发菌株产量提高了90.9%。YOSHIDA H等[7] 对 类 球 红 细 菌（Rhodobacter sphaeroides）KY-4113 进 行 NTG诱变筛选耐L-乙硫氨基酪酸的突变株，获得的一株绿 色突变株，该株菌可能丧失合成红色类胡萝卜素的能力而
Abstract: Using multiple resistance of vitamin K3, NaN3 and p-hydroxybenzoie acid (PHBA) as selective marker, CoQ10-producing Rhodobacter sphaeroides was mutated by nitrosoguanidine (NTG), and the high CoQ10-producing strains was screened. The fermentation medium was optimized by response surface methodology. Results showed that a strain R.sp3-7 with genetic stability and high CoQ10-production was obtained by mutation breeding. The optimum component of fermentation medium was glucose 31.7 g/L, corn steep powder 5.6 g/L, (NH4)2SO4 5.3 g/L, sodium glutamate 3.0 g/L, NaCl 3.0 g/L, MgSO4·7H2O 12.5 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, CaCO3 2.0 g/L and auxiliary fluids 1 ml/L. Under the conditions, the yield of CoQ10 produced by mutant strain R.sp3-7 was up to (93.63±0.59) mg/L, which was increased by 116.8% than that produced by original strain. Key words: CoQ10; resistant plate; chemical mutagenesis; response surface methodology; Rhodobacter sphaeroides
CoQ10标准曲线的制作：称取10 mg的CoQ10标准品溶 于50 mL的无水乙醇中，得200 mg/L的CoQ10母液，以此母 液出发分别稀释至 质量浓度分别为40 mg/L、80 mg/L、 120 mg/L和160 mg/L的标准溶液。通过HPLC分析获得 CoQ10各标准液质量浓度对应的峰面积，并建立CoQ10质量 浓度与峰面积之间的关系曲线。按照CoQ10标准曲线回归 方程计算发酵液中CoQ10的含量。 1.3.5 诱变方法
中图分类号：TS201.3
文章编号：0254-5071（2016）06-0090-06
doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.019
Screening of high CoQ10-producing Rhodobacter sphaeroides by chemical mutagenesis and its fermentation medium optimization
sphaeroides）使用亚硝基胍进行化学诱变，筛选高产菌株并采用响应面法优化其发酵培养基。结果表明，经诱变选育得到一株遗传稳
定的辅酶Q10高产菌株R.sp3-7，其最佳发酵培养基组成为：葡萄糖31.7 g/L，玉米浆干粉5.6 g/L，（NH4）2SO4 5.3 g/L、谷氨酸钠 3.0 g/L、NaCl
3.0 g/L、MgSO4·7H2O 12.5 g/L、KH2PO4 3.0 g/L、CaCO3 2.0 g/L、辅液1 mL/L。在此培养条件下，诱变菌株R.sp3-7的辅酶Q10产量达
（93.63±0.59）mg/L，与出发菌株相比提高了116.8%。
关键词：辅酶Q10；抗性平板；化学诱变；响应面分析方法；类球红细菌
辅酶Q1（0 coenzyme Q10，CoQ10）广泛存在于高等动物 线粒体内膜中的一种内源性物质，是呼吸链的重要递氢体， 是生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的必需成 分[1]。它具有抗氧化性、清除自由基、提高机体免疫力等功 效，可预防和治疗多种疾病，在治疗心脏衰竭 、延缓皮 肤 衰老等方面具有较广泛的应用[2-4]。因此，经济生产CoQ10 的途径也变得尤为重要。目前，CoQ10的主要生产方法有： 动植物提取法、植物细胞培养法、化学合成法和微生物发 酵法。相比其他三种方法，微生物发酵法生产CoQ10具有分 离过程相对简单、产品活性好、可规模放大生产能力等优 点，成为最有发展潜力的CoQ10生产方法。要实现发酵法 工业化生产CoQ10首先要解决的问题是获得一株高产菌 株。但是自然筛选获得的菌株产量都很低，需要通过诱变 育种、构建工程菌、优化发酵工艺等策略，来最大限度地
收稿日期：2016-03-27 基金项目：苏州市科技计划项目（sYN201317）；苏州科技学院科研基金项目（XKZ201411） 作者简介：扶教龙（1969-），男，副教授，博士，研究方向为生物化工、发酵工程。 *通讯作者：钱大伟（1991-），男，硕士研究生，研究方向为生物化工、微生物育种。
研究报告
中国酿造
2016 年 第 35 卷 第 6 期
总第 292 期
·91·
表达细菌叶绿素，故在肉汤琼脂培养基上呈绿色菌落，该 菌株CoQ10含量比野生株提高20%。
本研究采用超声辅助酸热法对类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）进行CoQ10破壁提取，可实现批量提取 菌体中CoQ10。使用紫外-氯化锂（LiCl）、亚硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）最佳诱变剂量诱变处理，筛选耐维生素K3 （vitamin K3，VK3）、叠氮化钠（NaN3）、对羟基苯甲酸（para hydroxy benzoic acid，PHBA）等前体物质的CoQ10生产菌株。 经过摇瓶发酵初筛、复筛获得CoQ10高产菌株，并使用单因 素与响应面法结合进一步对其发酵培养基组分进行优化 [8-10]，以进一步提高CoQ10产量，为CoQ10在国内的工业化生 产奠定一定的科学基础。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 菌种
发酵培养基：葡萄糖40 g/L，玉米浆干粉3 g/L，谷氨酸钠 3 g/L，NaCl 3 g/L，硫酸铵3 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO·4 7H2O 12.5 g/L，CaCO3 2 g/L，1 mL/L辅液；用NaOH调pH至7.2。 121 ℃灭菌20 min。
辅液：盐酸硫胺1 g/L，生物素0.015 g/L，烟酸1 g/L 。 [11] 1.1.3 化学试剂
（1）菌悬液的制备 取10 mL对 数 生 长 期 的 类 球 红 细 菌 种 子 培 养 液 ， 5 000 r/min离心10 min，弃上清，用无菌生理盐水洗涤两 次，重新悬浮10 mL生理盐水中，即得菌悬液。 （2）抗性浓度确定 将稀释后菌悬液分别涂布在含有不同质量浓度叠氮 化钠（NaN3）、对羟基苯甲酸（PHBA）、维生素K（3 VK3）和空 白的平板培养基中，32 ℃条件下，培养5 d，观察菌落生 长情况。 （3）化学诱变方法 取1 mL质量浓度为5 mg/mL的亚硝基胍母液加入 9 mL菌悬液中，调节终质量浓度为0.5 mg/mL，30 ℃恒温水 浴振荡处理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 后，离心终止反应，稀释涂布到平板培养基中，后置于32 ℃ 避光培养5 d培养，计算活菌数，绘制致死率曲线。致死率 计算公式如下：
FU Jiaolong, QIAN Dawei*, WU Chenqi, XU Minqiang, HU Cuiying, LI Liangzhi
(School of Chemical and Biological Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China)
采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）法进行CoQ10含量的测定。HPLC色谱条件： Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为 甲醇∶异丙醇=3∶1（V/V）；柱温40 ℃；检测波长 275 nm；流 速 1 mL/min；进样量 20 μL。
取发酵液1 mL，加入200 μL 0.02 mol/L HCl，70 ℃、 500 W超声水浴处理15 min。5 000 r/min离心10 min，弃尽 上清。加入5 mL提取液（乙酸乙酯∶乙醇=5∶3，V/V），混匀后 置 于 超 声 波 清 洗 仪 中 超 声 提 取 10 min ， 暗 室 中 抽 提 15 min，每隔5 min摇匀一次。将抽提液10 000 r/min离心 10 min，得CoQ10提取液[12]。 1.3.4 CoQ10含量的测定
类球红细菌（RhodHale Waihona Puke Baidubacter sphaeroides）：由浙江大学于 洪巍教授赠送。 1.1.2 培养基
种子培养基：葡萄糖3 g/L，酵母提取物8 g/L，NaCl 2 g/L，KH2PO4 1.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，1 mL/L辅液； 用NaOH调pH至7.2。121 ℃灭菌20 min。