蛋白质组学在肿瘤研究的应用

蛋白质组学在肿瘤研究的应用

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专业：病理学与病理生理学导师：

摘要随着人类全基因组计划（HGP）测序工作的完成, 对基因功能即基因表达产物蛋白的研究已经拉开了序幕。蛋白质组学研究直接定位于蛋白质水平, 大规模地分析组织细胞的蛋白质表达水平、翻译后修饰以及蛋白质间相互作用, 是后基因组计划的重要组成部分。肿瘤的发生涉及一系列复杂的分子事件, 蛋白质组学研究手段可以大规模地定量分析细胞内的蛋白质表达水平、翻译后修饰等性质以及定义信号网络中的蛋白质间相互作用, 从而有希望发现控制肿瘤进程的关键分子, 为肿瘤的诊断、分型、药物研制带来新的思路和途径。蛋白质组学为肿瘤的研究提供了新的平台。本文就蛋白质组学研究的技术方法和在肿瘤研究方面的应用做一个综述。

关键词蛋白质组学肿瘤应用

蛋白质组学（Proteomics）是研究一种细胞或一种生物中全部蛋白质的表达、结构、功能等的新兴学科，与基因组学、代谢组学等一起构成了当代生命科学的组学( -omics) 系列。蛋白质组学一般分为表达蛋白质组学( expression proteomics)、结构蛋白质组学( structural proteomics) 和功能蛋白质组学( functional proteomics) 3 个方面。表达蛋白质组学也叫差异蛋白质组学，主要对正常、疾病或药物处理细胞或亚细胞中的所有蛋白质进行定性或定量的研究; 结构蛋白质组学主要研究特定细胞或细胞器中蛋白质及蛋白质复合体的组成，确定其定位并了解蛋白质间相互作用; 功能蛋白质组学是一个较为广义的概念，主要研究蛋白质转录后修饰，为细胞信号转导、疾病机制等提供重要信息。恶性肿瘤的发生是一个涉及多因素、多基因的多阶段病理过程. 以往的研究主要集中在基因组和转录组分析. 随着人类基因组计划的完成, 肿瘤研究开始进入“后基因组时代”, 肿瘤蛋白质组学应运而生. 蛋白质作为基因功能的主要执行者, 一方面在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色, 另一方面在很大程度上决定正常细胞和肿瘤细胞之间的差异(如异型性、恶性特征等).李国庆[1]等参考了他人的研究成果，通过对肿瘤发生与蛋白质表达（谱）的改变、肿瘤与翻译后修饰蛋白质

（组）的改变、肿瘤发生过程中蛋白质相互作用谱的改变三个方面进行了总结并得到结论：肿瘤。一组蛋白质组病。

1 蛋白质组学的主要研究技术

蛋白质组学研究的工作流程是一个多步骤的过程, 包括蛋白质样本的制备、分离、定量及鉴定[ 2]。目前, 蛋白质组学研究包括2 种相互补充的策略。一种策略是表达蛋白质组学( protein expression proteomics) , 观察某种细胞或组织中大量蛋白质的整体表达, 并分析在不同情况下表达图谱的变化; 另一种策略是细胞图谱蛋白质组学( cell mapping proteomics) , 旨在定义蛋白质间的相互作用, 以建立细胞内信号转导通路的复杂网络图[ 3]。

1.1表达蛋白质组学

表达蛋白质组学是现今使用的最为广泛的蛋白质组学研究模式。目前该策略的技术路线主要是通过双向凝胶电泳( two dimensional electrophor esis, 2DE) 建立蛋白质组图谱、用专业图像扫描分析

软件进行图像分析、通过质谱( massspectrometry , MS) 及蛋白质

数据信息处理技术进行蛋白质的鉴定与分析。2DE 是1975 年由O，

Farr el 等人发明, 其原理是第一向基于蛋白质等电点的不同, 通

过等电聚焦进行分离, 再根据分子量的不同, 在与第一向垂直的方

向通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。

1.2细胞图谱蛋白质组学

细胞图谱蛋白质组学, 也称作相互作用蛋白质组学( interact- ion proteomics) 。目前研究蛋白质的相互作用有两种不同的方案。一种即“经典的”蛋白质组学手段, 主要依赖于蛋白质复合物的亲

和纯化, 后续通过质谱鉴定它们的组成。具体来看, 相互作用蛋白

质的获得主要有以下几种途径: ( 1) 采用抗某种感兴趣蛋白质的抗

体进行经典的免疫沉淀实验;( 2) 将带有亲和纯化标签的某种感兴

趣蛋白质的编码基因转染入细胞内, 将与该表达产物相互作用的蛋

白质亲和纯化后加以鉴定。( 3) 大分子复合物的分离。另一种方案

则通过表达某种感兴趣的基因组中的基因产物, 建立一整套蛋白质,

后者可用于蛋白质相互作用的体外检测( 蛋白质芯片) 或蛋白质相

互作用的体内检测( 酵母双杂交系统) 。这些方法所基于的原理互

不相同, 只有同时联用这些方法才能最终发现某一特定细胞或组织

中尽可能完全的蛋白质相互作用。[ 4]

2蛋白质组学在肿瘤研究方面的应用

目前的研究表明,有大量的蛋白质分子参与了肿瘤细胞周期、凋亡及转移的调控[5]。实践证明, 蛋白质组学将为肿瘤的早期诊断、肿瘤标志物的筛选与鉴定、抗肿瘤药物的筛选及开发出新的治疗靶标, 提供新的平台[6]。

2.1 骨肉瘤与良性肿瘤蛋白质组学的差异

卿海辉等[7]比较骨肉瘤与良性骨肿瘤蛋白质组学差异，探寻骨

肉瘤特异性标记物。分别提取5 例骨肉瘤肿瘤标本和5 例良性骨肿

瘤总蛋白，进行双向电泳，重复3 次; 银染、扫描后进行Image Master 2DE 软件分析以发现差异蛋白并对差异蛋白质点进行MS + MS /MS 质谱鉴定，获取肽质指纹图谱并在NCBI 数据库中找到匹配

蛋白质。所获得的双向电泳银染图谱重复性较好，骨肉瘤组织蛋白

质点数约为1 296 ± 179，骨良性肿瘤组织蛋白质点数约为1 098

± 152，明显差异的蛋白质点38 个，其中12 个被成功鉴定，7 个

蛋白质在骨肉瘤中表达上调，其中热休克蛋白60、应激诱导磷酸化

蛋白1 在骨良性肿瘤中表达缺失; 5 个蛋白质在骨肉瘤中表达下降，以锚定蛋白下降最明显。通过蛋白质组学的分析能成功的发现骨肉

瘤与骨良性肿瘤的差异蛋白质，为寻找骨肉瘤特异标记物提供依据。2.2 高分化星形细胞瘤差异蛋白质表达

肖惠生等[8]研究高分化星形细胞瘤差异蛋白质表达，为星形细胞瘤的治疗及预后的判断提供依据。取经病理证实的29 例正常脑组织及36 例高分化的星形细胞瘤( Kernohan Ⅱ级) ，经蛋白电泳、染色，采用PDQUEST 和2-DE 分析系统软件进行分析。以MALDI-TFO 质谱或MALDI-TOF/TOF 串联质谱技术结合数据库检索对蛋白质进行鉴定。结果通过双向电泳得到正常脑组织和高分化星形细胞瘤标本的双向凝胶电泳图谱; 生物质谱技术鉴定了24 个差异蛋白质点，与正常脑组织相比，高分化星形细胞瘤有9 个蛋白质下调，15 个蛋白质上调。结论以蛋白质组学技术鉴定了正常脑组织和高分化星形细胞瘤的差异蛋白质，其中部分蛋白质有助于深入研究星形细胞瘤的发生、发展机制并对进一步发现肿瘤标记物及治疗靶点有重要的参考价值。

2.3 利用蛋白质组学筛选抑癌候选基因CCDC19在鼻咽癌中可能调控蛋白

方唯意等[9]研究利用蛋白质组学筛选抑癌候选基因CCDC19在鼻

咽癌中可能调控蛋白。提取CCDC19稳定高表达的鼻咽癌3D8 和对照

鼻咽癌C6 细胞蛋白，并采用双向凝胶电泳( 2D-PAGE)技术进行有效

分离，图像扫描后获得高分辨率的2D-PAGE图谱。选用差异蛋白质组

学技术筛选差异蛋白位点，然后用肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting, PMF）和数据库检索技术给予鉴定。荧光定量PCR

和Western blot验证差异基因表达水平。结果质谱分析显示，FASN、CTSD和PGK1在CCDC19 过表达的3D8 细胞中表达下调，分别为-3.28、-1.64 和-6.97 倍。荧光定量PCR在mRNA水平验证了FASN、CTSD和PGK1以及Western blot在蛋白水平验证CTSD蛋白在3D8细胞中表达下调。结论FASN、CTSD和PGK1可能是CCDC19在鼻咽癌中调控的靶基因。

2.4 蛋白质组学研究肿瘤干细胞

Dormeyer 等［10］采用电场轨道阱回旋共振组合质谱( LTQ-Orbitrap-MS) 等技术发现胚胎干细胞HUES-7 与胚胎癌细胞NT2 /D1 存在着不

同的特异性胞浆蛋白，功能涉及信号传导、细胞连接、细胞转运功

能等。Chaerkady 等［11］发现胚胎干细胞( H1; WA01) 及胚胎癌细胞NTERA-2 cl． D1 表达差异在2 倍以上的蛋白有200 多种，包括HSPB1，MAPK1，TPS3I11，NFKBIA，S100 calcium-binding

protein-A4 等基因，这些基因上调与恶性表型有关。

2.5 造血系统蛋白质组学研究

造血系统肿瘤: 肿瘤干细胞蛋白组学研究最早应用于造血系统肿瘤

干细胞的研究。Ota等［12］通过表面标记物AC133 从13 个白血病患者

的骨髓造血干细胞中分离出AC133( + ) 的肿瘤干细胞，利用双向电

泳蛋白图谱，检测到11 差异表达的蛋白点，利用质谱技术鉴定出10 个差异表达蛋白，这些蛋白的功能涉及细胞周期调控、损伤修复、

氧化还原反应的调节，包括NUMA( 与有丝分裂器有关的核蛋白) 、

热休克蛋白( 包括HSPA5、HSPA8( p71) 、HSPA8 ( p34) 、

HSPA9B) 、ADA、ALDOA、TPI1、GST-pi、SOD2、PPIA。这些差异表

达的基因为研究人类白血病的发病机制提供了很好的线索。

3.展望

生命科学已进入后基因组时代, 这是一个整体细胞生物学的时代, 芯片技术、质谱技术、生物信息处理等技术的进步, 基因水平、蛋白质水平研究平台的不断完善, 可以实现对成千上万基因或蛋白质的同时分析。通过DNA( 基因组) 、RNA( 转录子组) 和蛋白质( 蛋

白质组) 3 个不同水平信息的整合, 一定可以更深刻地揭示肿瘤发生的本质, 从而发现临床诊断和治疗肿瘤的新的武器。然而由于蛋白质组学其技术本身存在的一些问题，一定程度上限制了其进一步推广及应用。例如，传统方法对于痕量蛋白质较难检测，而此类蛋白质往往又发挥着极其重要的药理作用。此外，在蛋白质的鉴定中也存在假阳性或不可鉴别的蛋白质等问题。通过样品预分级，如根据蛋白质溶解性和在细胞中不同的细胞器定位进行分级，不仅可提高低丰度蛋白质的检测，还可针对细胞器的蛋白质组进行相关研究。此外，结合多维液相色谱、质谱等新技术的非胶研究系统的发展也为解决这些问题提供了方法。[13]因此，有理由相信表达蛋白质组学在抗肿瘤药物的研发过程中必将发挥更大的作

4参考文献

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