松茸多糖对辐射损伤小鼠免疫功能的保护作用
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松茸多糖对辐射损伤小鼠免疫功能的保护作用
（作者:___________单位:___________邮编:___________）
作者：王宏芳，李雪静，浦昀，李金华，徐坤，宋秀玲，李娟
【摘要】目的探讨松茸多糖(PTM)对辐射损伤小鼠免疫功能的保护作用。方法90只健康雄性ICR小鼠随机分为正Βιβλιοθήκη Baidu对照组(NC)、照射对照组(IC)和PTM组，每组30只。PTM组小鼠给予1200mg/kg剂量PTM灌胃，每天1次，连续7d;第8天给予IC组和PTM组动物全身一次性照射，总剂量2.0Gy。检测小鼠照射后第1、5、14天的脾指数、脾细胞对ConA诱导的增殖反应、巨噬细胞吞噬功能和抗体生成能力。结果与IC组比较，PTM组小鼠的脾指数、脾细胞对ConA的增殖反应、巨噬细胞吞噬功能和抗体生成能力均明显增强(P0.01)，且照射后第14天PTM组小鼠脾指数、脾细胞对ConA的增殖反应能力、巨噬细胞吞噬率和抗体生成能力与NC组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论松茸多糖对辐射所致的小鼠免疫功能损伤有明显的保护作用。
【关键词】松茸多糖;X射线;免疫功能;脾指数;巨噬细胞
松茸(tricholoma matsutake)是一种纯天然的食用菌类，被誉为“菌中之王”，主要分布在日本、朝鲜半岛以及我国东北和西南地区。松茸菌肉肥厚，有香气，味道鲜美，而且富含蛋白质、脂肪和多种氨基酸，具有很高的营养价值[1]。此外，松茸具有强身、益肠胃、止痛、理气化痰、驱虫等功效。现代科学研究表明，松茸具有抗癌、抗炎等特殊作用[23]。松茸多糖(polysaccharides of tricholoma matsutake, PTM)是从天然真菌植物松茸中分离得到的一种植物多糖。关于松茸提取物质的免疫增强作用、抗肿瘤活性及治疗支气管炎等功能已有文献报道[45]，而对于松茸多糖辐射防护作用的研究较少，主要源自本课题组的实验研究[67]。本研究通过观察松茸多糖对辐射损伤小鼠免疫功能的影响，探讨其辐射防护作用，为进一步研究提供实验依据。
1.3主要实验仪器SWCJIF型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);G3022型酶标仪(中国南京);Olympus倒置显微镜(Olympus公司，日本);CO2恒温孵箱(SANYO公司，日本)。
1.4检测指标
1.4.1脾脏指数的测定小鼠称重，脱臼处死取脾脏，电子天平称重计算脾指数。
脾指数=脾脏重量体重×100%
1.4.2脾细胞对ConA反应性的测定采用MTT法。小鼠脾细胞浓度调成1×107个/mL，ConA浓度为10μg/mL，加于96孔平底培养板，37℃、50mL/L CO2培养箱中培养48h，终止培养前4h每孔加入10μL MTT，培养结束后，吸出上清，每孔加入二甲亚枫100μL，570nm酶标仪测定A值。
1材料与方法
1.1受试物松茸多糖(PTM)是从盛产于吉林省长白山区天然真菌-松茸中提取的多糖类化合物。由本课题组采用索氏提取法提取，制备溶液时以生理盐水溶解。
1.2实验动物、分组及处理健康雄性ICR小鼠，体重(20±2)g，6～8周龄，由吉林大学基础医学院动物中心提供。小鼠按体重随机分为正常对照组(NC)、辐射照射组(IC)和PTM给药组(PTM)3组，每组30只。NC组和IC组给予生理盐水灌胃;PTM组给予剂量为1200mg/kg体重的PTM灌胃，每天1次，连续7d。第8天除NC组外，均接受X线照射。分别于照射后第1、5、14天，每组处死10只动物，进行相关指标的检测。
1.4.3巨噬细胞吞噬功能的测定小鼠腹腔注射100g/L淀粉悬着液1mL，24h后腹腔注射20mL/L鸡红细胞1mL，30min断头处死，腹腔注射0.2mL肝素注射液，吸腹腔液于玻片上展开，湿盒中37℃温育30min，瑞士-姬姆萨染色5min，PBS冲洗，自然干燥，显微镜下观察，计算巨噬细胞吞噬率和吞噬指数。
2.2脾细胞对ConA的反应性小鼠受到2.0Gy射线照射后，第1、5、14天小鼠脾细胞对ConA刺激的增殖反应明显低于同期NC组(P0.01)。预防给予PTM组小鼠脾细胞对ConA刺激的增殖反应高于同期IC组(P0.01)，且第14天PTM组小鼠脾细胞对ConA刺激的增殖反应与NC组比较差异无统计学意义(P0.05，表2)。表2 PTM对照射后不同时期小鼠脾细胞增殖反应的影响
1.5统计学处理采用SPSS 15.0软件进行统计分析。实验数据用±s表示，实验组与对照组间数据比较采用单因素方差分析。以P0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1小鼠脾脏指数小鼠受到2.0Gy射线照射后，第1、5、14天小鼠脾指数明显低于同期NC组(P0.01);PTM组脾指数在照射后第1、5、14天明显高于同期IC组(P0.01)，且第14天PTM组脾指数与NC组比较差异无统计学意义(P0.05，表1)。表1 PTM对照射后不同时期小鼠脾指数的影响
2.3小鼠巨噬细胞的吞噬功能小鼠受到2.0Gy射线照射后，第1、5、14天小鼠巨噬细胞的吞噬率及吞噬指数均低于同期NC组(P0.01);预防给予PTM组小鼠巨噬细胞吞噬率及吞噬指数均高于同期IC组(P0.01)，且第14天PTM组小鼠巨噬细胞吞噬率与NC组比较差异无统计学意义(P0.05，表3、表4)。表3 PTM对照射后不同时期小鼠巨噬细胞吞噬率的影响
吞噬百分率(%)=200个巨噬细胞中吞噬CRBC的巨噬细胞数200个巨噬细胞数×100%
吞噬指数=200个巨噬细胞吞噬CRBC总数200个巨噬细胞数×100%
1.4.4 B淋巴细胞功能的测定采用玻片小室法。小鼠腹腔注射50mL/L SRBC悬液0.2mL，4d后脱臼处死，取出脾脏，用磷酸缓冲生理盐水制成单细胞悬液，调细胞浓度为1×107个/mL，冰浴中保存备用;取0.24mL脾细胞悬液、0.24mL 200mL/L SRBC悬液和0.92mL新鲜的豚鼠稀释血清混匀，取混合液0.1mL加入到玻片小室中，平行样2份，小室两端用石蜡封口后，置37℃温箱中孵育1h，取出后显微镜下计数小室中形成的空斑数。结果换算：结果用106个脾细胞形成的PFC数表示。
（作者:___________单位:___________邮编:___________）
作者：王宏芳，李雪静，浦昀，李金华，徐坤，宋秀玲，李娟
【摘要】目的探讨松茸多糖(PTM)对辐射损伤小鼠免疫功能的保护作用。方法90只健康雄性ICR小鼠随机分为正Βιβλιοθήκη Baidu对照组(NC)、照射对照组(IC)和PTM组，每组30只。PTM组小鼠给予1200mg/kg剂量PTM灌胃，每天1次，连续7d;第8天给予IC组和PTM组动物全身一次性照射，总剂量2.0Gy。检测小鼠照射后第1、5、14天的脾指数、脾细胞对ConA诱导的增殖反应、巨噬细胞吞噬功能和抗体生成能力。结果与IC组比较，PTM组小鼠的脾指数、脾细胞对ConA的增殖反应、巨噬细胞吞噬功能和抗体生成能力均明显增强(P0.01)，且照射后第14天PTM组小鼠脾指数、脾细胞对ConA的增殖反应能力、巨噬细胞吞噬率和抗体生成能力与NC组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论松茸多糖对辐射所致的小鼠免疫功能损伤有明显的保护作用。
【关键词】松茸多糖;X射线;免疫功能;脾指数;巨噬细胞
松茸(tricholoma matsutake)是一种纯天然的食用菌类，被誉为“菌中之王”，主要分布在日本、朝鲜半岛以及我国东北和西南地区。松茸菌肉肥厚，有香气，味道鲜美，而且富含蛋白质、脂肪和多种氨基酸，具有很高的营养价值[1]。此外，松茸具有强身、益肠胃、止痛、理气化痰、驱虫等功效。现代科学研究表明，松茸具有抗癌、抗炎等特殊作用[23]。松茸多糖(polysaccharides of tricholoma matsutake, PTM)是从天然真菌植物松茸中分离得到的一种植物多糖。关于松茸提取物质的免疫增强作用、抗肿瘤活性及治疗支气管炎等功能已有文献报道[45]，而对于松茸多糖辐射防护作用的研究较少，主要源自本课题组的实验研究[67]。本研究通过观察松茸多糖对辐射损伤小鼠免疫功能的影响，探讨其辐射防护作用，为进一步研究提供实验依据。
1.3主要实验仪器SWCJIF型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);G3022型酶标仪(中国南京);Olympus倒置显微镜(Olympus公司，日本);CO2恒温孵箱(SANYO公司，日本)。
1.4检测指标
1.4.1脾脏指数的测定小鼠称重，脱臼处死取脾脏，电子天平称重计算脾指数。
脾指数=脾脏重量体重×100%
1.4.2脾细胞对ConA反应性的测定采用MTT法。小鼠脾细胞浓度调成1×107个/mL，ConA浓度为10μg/mL，加于96孔平底培养板，37℃、50mL/L CO2培养箱中培养48h，终止培养前4h每孔加入10μL MTT，培养结束后，吸出上清，每孔加入二甲亚枫100μL，570nm酶标仪测定A值。
1材料与方法
1.1受试物松茸多糖(PTM)是从盛产于吉林省长白山区天然真菌-松茸中提取的多糖类化合物。由本课题组采用索氏提取法提取，制备溶液时以生理盐水溶解。
1.2实验动物、分组及处理健康雄性ICR小鼠，体重(20±2)g，6～8周龄，由吉林大学基础医学院动物中心提供。小鼠按体重随机分为正常对照组(NC)、辐射照射组(IC)和PTM给药组(PTM)3组，每组30只。NC组和IC组给予生理盐水灌胃;PTM组给予剂量为1200mg/kg体重的PTM灌胃，每天1次，连续7d。第8天除NC组外，均接受X线照射。分别于照射后第1、5、14天，每组处死10只动物，进行相关指标的检测。
1.4.3巨噬细胞吞噬功能的测定小鼠腹腔注射100g/L淀粉悬着液1mL，24h后腹腔注射20mL/L鸡红细胞1mL，30min断头处死，腹腔注射0.2mL肝素注射液，吸腹腔液于玻片上展开，湿盒中37℃温育30min，瑞士-姬姆萨染色5min，PBS冲洗，自然干燥，显微镜下观察，计算巨噬细胞吞噬率和吞噬指数。
2.2脾细胞对ConA的反应性小鼠受到2.0Gy射线照射后，第1、5、14天小鼠脾细胞对ConA刺激的增殖反应明显低于同期NC组(P0.01)。预防给予PTM组小鼠脾细胞对ConA刺激的增殖反应高于同期IC组(P0.01)，且第14天PTM组小鼠脾细胞对ConA刺激的增殖反应与NC组比较差异无统计学意义(P0.05，表2)。表2 PTM对照射后不同时期小鼠脾细胞增殖反应的影响
1.5统计学处理采用SPSS 15.0软件进行统计分析。实验数据用±s表示，实验组与对照组间数据比较采用单因素方差分析。以P0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1小鼠脾脏指数小鼠受到2.0Gy射线照射后，第1、5、14天小鼠脾指数明显低于同期NC组(P0.01);PTM组脾指数在照射后第1、5、14天明显高于同期IC组(P0.01)，且第14天PTM组脾指数与NC组比较差异无统计学意义(P0.05，表1)。表1 PTM对照射后不同时期小鼠脾指数的影响
2.3小鼠巨噬细胞的吞噬功能小鼠受到2.0Gy射线照射后，第1、5、14天小鼠巨噬细胞的吞噬率及吞噬指数均低于同期NC组(P0.01);预防给予PTM组小鼠巨噬细胞吞噬率及吞噬指数均高于同期IC组(P0.01)，且第14天PTM组小鼠巨噬细胞吞噬率与NC组比较差异无统计学意义(P0.05，表3、表4)。表3 PTM对照射后不同时期小鼠巨噬细胞吞噬率的影响
吞噬百分率(%)=200个巨噬细胞中吞噬CRBC的巨噬细胞数200个巨噬细胞数×100%
吞噬指数=200个巨噬细胞吞噬CRBC总数200个巨噬细胞数×100%
1.4.4 B淋巴细胞功能的测定采用玻片小室法。小鼠腹腔注射50mL/L SRBC悬液0.2mL，4d后脱臼处死，取出脾脏，用磷酸缓冲生理盐水制成单细胞悬液，调细胞浓度为1×107个/mL，冰浴中保存备用;取0.24mL脾细胞悬液、0.24mL 200mL/L SRBC悬液和0.92mL新鲜的豚鼠稀释血清混匀，取混合液0.1mL加入到玻片小室中，平行样2份，小室两端用石蜡封口后，置37℃温箱中孵育1h，取出后显微镜下计数小室中形成的空斑数。结果换算：结果用106个脾细胞形成的PFC数表示。