重组腺病毒载体的构建

构建：＜20代－－构建成功的关键
扩增：无特殊要求
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
重组原理
www.bbioo.com
生物w秀ww-.专bb心io做o.生co物m
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
注意事项
n n n n n
设用不选转阴高要用染性浓更传时生对度换代 29物照N培3次w细a秀w养数H胞w-C液少.不专Ob的3b要心调2io做9太节o3.生密细培co物胞m养液50P－H值60%
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
重组病毒的扩增
n n n
用感2反养9收染复3细集培29胞生的 养3大 细物病 、w规 胞秀w变感模w-细染.培专b胞b养心培io做：o收养.生悬c集上o物浮m大清培量或养的冻，病融单变上层细清培胞
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
生物w秀ww-.专bb心io做o.生co物m
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
重组穿梭质粒的构建－－将 PCR产物克隆到穿梭质粒
n n n
体穿p用用D会梭BTC4a3：质连m1生H5粒 设接及I物计酶wB和秀w引T将定EwE-物BBc.向专oTb2时REb克心c引BiIoD做隆2o入双N.生ccA需酶oD物mN要切A的穿反酶梭向切质连位粒接点到
重组腺病毒载体 的构建
心内科 李德
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
外源性基因的转移方法
n
n
n n
磷D聚显转转E酸阳微A染染钙离注E效效－生－子射率率葡物－技Dw＜2聚N秀术D5wA1%糖Mw5-共%S法.专沉Ob法b心淀io做法o.生co物m
n 电穿孔法
n 脂质体载体法
n 病毒载体
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
4、取上清重复抽提 2 次，得到初步纯化 的重组腺病毒
5、用0.22μm滤纸过滤除菌，分装，保存 于－70 °C。
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
重组病毒的纯化
n 进一C操s步作C生l纯梯 复物化杂度w秀w，离w-设心.专b备b心i要o做o求.生co高物m，价格昂贵
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
腺病毒载体的特点
n
n n
保不增疫留整殖应了合和答生E到 非，3物宿 增可区w秀w主 殖用的w-基 细于腺.专b因 胞体病b心均内 组i毒o做o可基－.生c感因o－物m治染可疗逃逸宿主免
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
www.bbioo.com
生物w秀ww-.专bb心io做o.生co物m
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
穿梭质粒
www.bbioo.com
生物w秀ww-.专bb心io做o.生co物m
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
重组腺病毒的制备
nn1质共实脂、粒转质验A转液2染体步染0：2介骤液μ生9重导3配l物细，组w重制胞1秀w穿组0w´-梭穿H.专质Bb梭Sb心粒质io5做o粒2μ.0生和cμlo，物腺ml，去病腺离毒病子基毒水因基5组μ因质l组粒
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
腺病毒载体的特点
n n
n n
具重可主通有功插要过携能入以 受生带 长A体d物外 达介5w型秀w源5导kw病-基的b.的专毒b因细b外心为和胞io做源框o转内.生基c架移吞o物因m构外作建源用基进因行的基双因
转移
n 安全性，复制缺陷（E1区缺陷）
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
生物w秀ww-.专bb心io做o.生co物m
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
重组腺病毒的鉴定
n
n n
引离取用病物心上目变作清的29生P提 片3细C物取 段Rw胞秀w重 引于w-组 物.液专b和病b氮心病毒io做、o毒D.生3cN基7oA物°m因C组反特复征冻片融段，
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
ห้องสมุดไป่ตู้
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
共转染后293细胞的病变效应
n n
n
壁注发表漂意生现浮与在：生－细细转物C胞染 胞wP秀wE老肿后w-化胀1.0专b和、－b心营变1io做2o养圆天.生c， 不o物m部足分鉴的别细胞脱
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
B液：DOTAP 30 μl， 10´HBS 10 μl，去 离子水 60 μl
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
5324、、、、合培倒A将液、养去A、 B培 4生混8B养小物两合w瓶时秀w液液中后w-混与.专的更b合无b心旧换i，血o做培新o室清.生养鲜c温Do物m液培M孵，养E育M加液1混5入分合上钟述混
可使基因定向克隆的程序简化
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
生物w秀ww-.专bb心io做o.生co物m
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
重组穿梭质粒的鉴定
重组腺病毒载体构建、蚀斑挑选。也可 用于腺病毒扩增。
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
腺病毒载体的包装细胞
n n
H建HEE和高 1KK0扩22糖%99生F增33型B细细物DSw胞胞（秀Mw的的wE构-M.专传培建bb心养 代）io做次o，.生数c1o0物m与%腺NB病S毒（扩载增体）构
以介反重绍生义重组物Bw组T秀w腺E腺wB-病.病2专b腺毒b心毒病io载做o毒载.体生c表o的物体m达构构载建体建过为程例
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
BTEB2简介
n n
功基能本：转生促录物进元w秀w件 VwS-结M.专b合Cb心增蛋io做o殖白.生c和2o物－m表转型录转因化子
及病毒上清
n 病变细胞及病毒上清分别保存于-70°C
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
重组病毒的纯化
n 胞 4初°4步次C231纯、、、1化4取液5生0°上氮0物rCwp清、m秀w3加3离0w7-0入°心.专0br等Cp5b心反m量imo离复做o的in.心冻生三co融3物m氯0收三m集i氟n的乙病烷变，293细
n n
目重酶的组切片穿鉴生段梭定物测质：w秀w序粒用w-pB.D专abmCb心H3io1做oI5.A和生coS物mBEcToERT2I ，双电酶泳切
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
生物w秀ww-.专bb心io做o.生co物m
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
生物w秀ww-.专bb心io做o.生co物m
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
生物w秀ww-.专bb心io做o.生co物m
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
生物秀-专心做生物
pDC315
www.bbioo.com
生物w秀ww-.专bb心io做o.生co物m
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
腺病毒载体的包装胞细
n 稳H于悬E定腺浮K单。病2H9层E毒3生K细培大物2w胞养9规秀3w－H细w模-E－.胞专K制bE，2b心备19io区易3做o。细.缺大生c但胞o陷规物m不，互模易稳补培长定的养期，细，保用胞可持于系用
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
构建腺病毒载体的要素
n n n n
目包穿腺的装梭病基细质毒生因 胞粒基物片因w秀w段组w-质.专b粒b心io做o.生co物m
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
AdMax™ system
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
外源性基因的制备
n n n
中VR体TS提会M－取：CPC中生。从R提物目得w取秀w的到w总-基B.专RTb因Eb心N丰iBAo做o2度.生cc高oD物mN的A组织或细胞
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
生物w秀ww-.专bb心io做o.生co物m
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
病毒滴度测定
n n
P第培02.4B2养8孔Sm管至2培l。4，总生小养每量物时板w孔2秀w后每m加w-，孔l，.入专b取接混b不心病种io匀做同o毒1.后生稀×c转o作物释1m0染15度个0液倍的20比9病.23m细稀毒l加胞释液至
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
n 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
病毒滴度测定
np稀观fu/释察m度细l=生计胞10物病 算5w细秀w病变胞w-毒情.×专b滴况b稀心度，i0o释做.o2：取.m度生c1ol物×0m01%0出个现病C毒P/E细的胞
bbs.bbioo.com
生物秀-专心做生物
www.bbioo.com
病毒载体
n n
S增反V可整殖转4整合0细 录病合到生胞 病毒到宿物毒w载宿主秀w载体主染w-体.专染色bb心色体io做体，o.生，只co物m可感感染染增增殖殖细和胞非
n 腺病毒载体
不整合到宿主染色体，增殖和非增殖
细胞均可感染
生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区