鸡蛋中沙门氏菌的快速检测
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本研究直接利用加热使细菌裂解来提取模板 DNA。此 方法也不需要特殊的试剂 ,而且操作简单 ,节省了检测时间 。
由于热裂解法具有节约成本 、节省时间 、操作简单等优点 ,有 利于 PCR快速检测技术的推广和应用 。不足的是利用热裂 解法提取的模板 DNA 量较少 ,杂质较多 ,易影响 Taq酶活性 , 对此本研究主要通过控制模板用量以减少杂质的影响 。另 外 ,在研究过程中 ,还比较了其他的 DNA 模板制备方法 (如 冻融法 、基因组提取法 ) ,并未发现煮沸法会导致 PCR 检测敏 感性的显著下降 ,因此认为对沙门氏菌的快速 PCR 检测利用 热裂解法即可 。
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 引物 根据对 SP I - 3的 m g tC 基因的序列分析以及 已发表的 m g tC基因 [7 - 9 ] ,确定 m g tC 基因可以作为沙门氏菌 的检测标志 ,故合成了用于 SP I - 1、SP I - 2、SP I - 3、SP I - 4、 SP I - 5核心蛋白基因 PCR 扩增的引物 SP I - 3 F ( 5′- AAA2 GACAA TGGCGTCAACGTA TGG - 3′) 、SP I - 3 R ( 5′- TTCTT2 TATAGCCCTGTTCCTGAGC - 3′) ,用于沙门氏菌的检测 。 1. 1. 2 培养基 四硫磺酸盐煌绿增菌液 ( TTB ) ,购自中国科 学院上海昆虫科技开发公司康乐培养基有限公司 。 1. 1. 3 主要试剂 Taq酶试剂盒 、dN TP M ixture、DNA M arker DL2000等均购自宝生物工程 (大连 )有限公司 ( TaKaRa) ,琼 脂糖为西班牙 B iowest公司产品 。 1. 1. 4 主要仪器 AB I - 2720 型 PCR 扩增仪 ,为美国生物 系统应用公司产品 ; DYY 10C 型电泳仪 ,为北京市六一仪器 厂产品 ; GIS - 1000型凝胶紫外成像系统 ,为上海天能科技有 限公司产品 。
[ 3 ] Carrique - Mas J J, Davies R H. Samp ling and bacteriological detec2 tion of S a lm onella in poultry and poultry p rem ises: a review [ J ]. Rev Sci Tech, 2008, 27 ( 3) : 665 - 677.
2 结果与分析
2. 1 鸡蛋中沙门氏菌的 PCR检测结果 通过沙门氏菌的 PCR 快速检测 ,确定了所采 296枚鸡蛋
中的 54枚 (18. 24% )为沙门氏菌阳性 (图 1、表 1) (所有阴性 样品均再取 18 h培养物进行第二次检测 ,并再次确认为阴 性 ) 。通过地区比较发现 ,不同来源的禽蛋沙门氏菌携带率 存在一定的差异性 ,这可能与不同地区的养殖模式有关 ,须要 进一步扩大样品数量进行验证 。 2. 2 鸡蛋中沙门氏菌的分离与鉴定结果
参考文献 :
[ 1 ] Hensel M. Evolution of pathogenicity islands of Sa lm onella en terica [ J ]. Int J Med M icrobiol, 2004, 294 ( 2 /3) : 95 - 102.
[ 2 ]张 嫚. 我国微生物危险性评估的最新进展及未来发展方向 [ J ]. 四川食品与发酵 , 2008, 44 (3) : 37 - 40.
[ 5 ] A ltier C. Genetic and environmental control of S a lm onella invasion [ J ]. J M icrobiol, 2005, 43: 85 - 92.
[ 6 ]吴 斌 ,秦 成 ,石 智 ,等. 畜产品中沙门氏菌的风险评估 [ J ]. 大连轻工业学院学报 , 2004, 23 (3) : 226 - 228.
沙门氏菌是一类对人类和动物健康构成极大危害的革兰 氏阴性致病菌 [1 ] ,是食品 、水源及畜产品的重要污染菌 ,可引 起人食物中毒 、急性肠胃炎和动物腹泻等疾病 [2 - 4 ] 。蛋 、肉 、 奶等畜产品营养丰富 ,夏秋季节极易污染沙门氏菌 ,人类一旦 摄入了含有大量沙门氏菌的畜产品 ,就会引起细菌感染 ,进而 导致食源性中毒 [5 ] 。在引起沙门氏菌中毒的食品中 ,约 90% 是蛋 、肉 、奶等畜产品 [6 ] ,因此沙门氏菌的快速检测对公共卫 生 、食品卫生 、畜牧兽医和口岸检疫等都具有重要意义 。本研 究建立了基于 SP I - 3的 m g tC基因的 PCR 快速检测方法 ,并 对来自江苏省部分地区的鸡蛋进行了沙门氏菌检测 ,为预防 食源性沙门氏菌感染提供借鉴材料 。
[ 4 ] Toyofuku H. Ep idem iological data on food poisonings in Japan fo2 cused on Sa lm onella, 1998 - 2004 [ J ]. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo R isk A ssess, 2008, 25 ( 9) : 1058 - 1066.
细菌分离
阳性数 (枚 ) 30 5 2 3 40
百分率 (%) 15. 31 8. 33 10. 00 15. 00 13. 51
素酶试验鉴定 ,共从 296枚鸡蛋中的 40枚 ( 13. 51% )检测到 沙门氏菌 (表 1) ,其检出率低于 PCR检测方法 。 2. 3 两种检测方法的比较
经与常规细菌学检测结果比较 , 表明通过基于毒力岛 SP I - 3的 m gtC基因所建立的沙门氏菌 PCR检测方法具有以 下特点 : (1)敏感性 。通过对相同样品的检测 ,发现建立的用 于检测鸡蛋中沙门氏菌的 PCR 方法的检出率高于常规细菌 学检测结果 。 (2)可靠性 。所有常规细菌学检测结果为阳性 的样品 ,利用 PCR方法检测均为沙门氏菌阳性 。 (3)快速性 。 所建立的用于检测禽蛋中沙门氏菌的 PCR 方法耗时 12 ～16 h,明显比常规细菌学检测方法 (100～110 h)缩短 。
通过本研究进一步证明了基于 SP I - 3 的 m g tC 基因的 PCR方法进行沙门氏菌快速检测的敏感性 、可靠性以及快速 性 ,同时本研究的沙门氏菌检测结果也揭示了目前商品鸡蛋 沙门氏菌污染的风险 ,进一步提示蛋 、肉 、奶等畜产品的沙门 氏菌检测在公共卫生 、食品卫生 、畜牧兽医和口岸检疫中的重 要意义 。
收稿日期 : 2009 - 07 - 22 基金项目 :江苏检验检疫课题 (编号 : 2007KJ06) 。 作者简介 :陈 飞 (1970—) ,男 ,江苏射阳人 ,兽医师 ,主要从事出入
境检验检疫 。 Tel: ( 0512) 56302700; E - mail: bainui@126. com。 通讯作 者 : 成 大 荣 ( 1971—) , 男 , 副 教 授 。 Tel: ( 0514 ) 87892598;
通过常规细菌学分离以及 IMV iC试验 、糖发酵试验 、尿
陈 飞等 :鸡蛋中沙门氏菌的快速检测
— 285 —
来源地
盐城 苏州 无锡 扬州 Hale Waihona Puke Baidu计
表 1 鸡蛋沙门氏菌的样品检测结果
样品数 (枚 )
196 60 20 20 296
PCR 检测
阳性数 (枚 ) 38 9 3 4 54
百分率 (%) 19. 39 15. 00 15. 00 10. 00 18. 24
— 284 —
江苏农业科学 2009年第 5期
鸡蛋中沙门氏菌的快速检测
陈 飞 1 , 成大荣 2 , 田志高 1 , 孙怀昌 2 , 张鑫宇 2 , 王丽芳 1
(1. 张家港出入境检验检疫局 ,江苏张家港 215600; 2. 扬州大学兽医学院 ,江苏扬州 225009)
摘要 : 选择江苏省不同地区来源的鸡蛋 296枚 ,分别取蛋黄蛋清混合液以沙门氏菌增菌液快速增菌 。取增菌培 养物 100μl,离心去上清后 ,重新悬浮于 100μl超纯水中 ;以煮沸法制备可能存在的细菌 DNA 模板 。通过对沙门氏菌 毒力岛 SP I - 3的 m gtC基因的 PCR快速检测 ,确定其中 18. 24%的鸡蛋为沙门氏菌阳性 。通过与细菌分离检测结果 对比 ,揭示该方法明显提高了沙门氏菌的检出率 ,表明 PCR 是一种快速 、敏感和高度特异性的沙门氏菌检测方法 ,值 得在畜产品沙门氏菌的检测中推广应用 。 关键词 : 鸡蛋 ; 沙门氏菌 ; PCR; 检测 中图分类号 : S851. 347. 102 文献标志码 : A 文章编号 : 1002 - 1302 (2009) 05 - 0284 - 02
3 讨论
常见食源性细菌感染的病原微生物有沙门氏菌 、大肠杆 菌 、弧菌 、金黄色葡萄球菌 、单核增生李斯特菌以及空肠弯曲 菌等 。因此 ,上述致病菌的快速检验对提高卫生防疫水平非 常重要 。目前 ,在进行食品质量安全监控的 CMA 认证检测 时 ,沙门氏菌的检测已成为必检的卫生指标项目之一 。传统 的检测方法过程复杂 ,周期长 ,不仅造成人力物力的浪费 ,也 影响了口岸的通关速度 。应用快速简易 、敏感性高和特异性 强的 PCR技术 ,为畜产品中沙门氏菌的快速检测提供了一种 行之有效的手段 。
E - mail: jsyzcdr@ yahoo. com. cn。
1. 2 方法 1. 2. 1 样品采集 随机采集江苏省部分地区的商品鸡蛋 296枚 ,分别来自盐城 ( 196枚 ) 、苏州 ( 60枚 ) 、无锡 ( 20 枚 ) 、 扬州 (20枚 ) 。 1. 2. 2 快速增菌 每枚鸡蛋分别以碘酊和 75%酒精消毒 后 ,小心去除气室一端的蛋壳 。以灭菌吸管将蛋黄 、蛋清搅匀 后 ,吸取 1 m l蛋黄蛋清混合液接种于 5 m l沙门氏菌增菌液 , 37 ℃振摇培养 6～8 h,必要时延长至 18 h。 1. 2. 3 DNA 模板的制备 取增菌培养物 100 μl,离心去除 上清液后 ,重新悬浮于 100μl超纯水中 ;以煮沸法制备 DNA 模板 : 100 ℃煮沸 10 m in,迅速冰浴 5 m in,然后 4 ℃条件下 10 000 r/m in离心 5 m in,取上清液储存于 4 ℃下备用 [10 - 11 ] 。 1. 2. 4 PCR快速检测沙门氏菌 取 10 ×PCR Buffer 2. 5μl、 M gCl2 ( 25 mmo l/L ) 2. 5μl、4 ×dN TPs( 10 mmo l/L ) 2μl、引物 SP I - 3F 和 SP I - 3R (均 为 50 μmol/L ) 各 0. 5 μl、Taq 酶 (5 U /μl) 0. 5 μl、步骤 1. 2. 3 制备的 DNA 模板 2. 5 μl, 加 H2 O 至 25μl。 PCR反应条件 : 94 ℃ 3 m in; 94 ℃ 40 s, 63 ℃ 40 s, 72 ℃ 1 m in,每个循环降低 1 ℃,共 5个循环 ;然后 94 ℃ 40 s, 58 ℃ 40 s, 72 ℃ 1 m in,共 25个循环 ; 72 ℃ 10 m in, 4 ℃ 保温 。取 PCR 扩增产物 5μl在 1%琼脂糖凝胶中进行 80 V 电泳 1 h,以 DNA M arker DL2000为参照 ,观察扩增片段大小 。 1. 2. 5 沙门氏菌的分离与鉴定 按无菌操作挑取增菌培养 物并划线接种于麦康凯琼脂平板 ,于 37 ℃培养 24 h后 ,观察 细菌生长 情 况 , 并 选 择 典 型 灰 白 色 菌 落 进 行 纯 培 养 。以 IMV iC试验 、糖发酵试验 、尿素酶试验鉴定分离的细菌 。
[ 7 ]McClelland M , Sanderson K E, Sp ieth J, et al. Comp lete genome se2 quence of S alm onella en terica serovar Typhimurium LT2 [ J ]. Nature, 2001, 413 ( 6858) : 852 - 856.
由于热裂解法具有节约成本 、节省时间 、操作简单等优点 ,有 利于 PCR快速检测技术的推广和应用 。不足的是利用热裂 解法提取的模板 DNA 量较少 ,杂质较多 ,易影响 Taq酶活性 , 对此本研究主要通过控制模板用量以减少杂质的影响 。另 外 ,在研究过程中 ,还比较了其他的 DNA 模板制备方法 (如 冻融法 、基因组提取法 ) ,并未发现煮沸法会导致 PCR 检测敏 感性的显著下降 ,因此认为对沙门氏菌的快速 PCR 检测利用 热裂解法即可 。
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 引物 根据对 SP I - 3的 m g tC 基因的序列分析以及 已发表的 m g tC基因 [7 - 9 ] ,确定 m g tC 基因可以作为沙门氏菌 的检测标志 ,故合成了用于 SP I - 1、SP I - 2、SP I - 3、SP I - 4、 SP I - 5核心蛋白基因 PCR 扩增的引物 SP I - 3 F ( 5′- AAA2 GACAA TGGCGTCAACGTA TGG - 3′) 、SP I - 3 R ( 5′- TTCTT2 TATAGCCCTGTTCCTGAGC - 3′) ,用于沙门氏菌的检测 。 1. 1. 2 培养基 四硫磺酸盐煌绿增菌液 ( TTB ) ,购自中国科 学院上海昆虫科技开发公司康乐培养基有限公司 。 1. 1. 3 主要试剂 Taq酶试剂盒 、dN TP M ixture、DNA M arker DL2000等均购自宝生物工程 (大连 )有限公司 ( TaKaRa) ,琼 脂糖为西班牙 B iowest公司产品 。 1. 1. 4 主要仪器 AB I - 2720 型 PCR 扩增仪 ,为美国生物 系统应用公司产品 ; DYY 10C 型电泳仪 ,为北京市六一仪器 厂产品 ; GIS - 1000型凝胶紫外成像系统 ,为上海天能科技有 限公司产品 。
[ 3 ] Carrique - Mas J J, Davies R H. Samp ling and bacteriological detec2 tion of S a lm onella in poultry and poultry p rem ises: a review [ J ]. Rev Sci Tech, 2008, 27 ( 3) : 665 - 677.
2 结果与分析
2. 1 鸡蛋中沙门氏菌的 PCR检测结果 通过沙门氏菌的 PCR 快速检测 ,确定了所采 296枚鸡蛋
中的 54枚 (18. 24% )为沙门氏菌阳性 (图 1、表 1) (所有阴性 样品均再取 18 h培养物进行第二次检测 ,并再次确认为阴 性 ) 。通过地区比较发现 ,不同来源的禽蛋沙门氏菌携带率 存在一定的差异性 ,这可能与不同地区的养殖模式有关 ,须要 进一步扩大样品数量进行验证 。 2. 2 鸡蛋中沙门氏菌的分离与鉴定结果
参考文献 :
[ 1 ] Hensel M. Evolution of pathogenicity islands of Sa lm onella en terica [ J ]. Int J Med M icrobiol, 2004, 294 ( 2 /3) : 95 - 102.
[ 2 ]张 嫚. 我国微生物危险性评估的最新进展及未来发展方向 [ J ]. 四川食品与发酵 , 2008, 44 (3) : 37 - 40.
[ 5 ] A ltier C. Genetic and environmental control of S a lm onella invasion [ J ]. J M icrobiol, 2005, 43: 85 - 92.
[ 6 ]吴 斌 ,秦 成 ,石 智 ,等. 畜产品中沙门氏菌的风险评估 [ J ]. 大连轻工业学院学报 , 2004, 23 (3) : 226 - 228.
沙门氏菌是一类对人类和动物健康构成极大危害的革兰 氏阴性致病菌 [1 ] ,是食品 、水源及畜产品的重要污染菌 ,可引 起人食物中毒 、急性肠胃炎和动物腹泻等疾病 [2 - 4 ] 。蛋 、肉 、 奶等畜产品营养丰富 ,夏秋季节极易污染沙门氏菌 ,人类一旦 摄入了含有大量沙门氏菌的畜产品 ,就会引起细菌感染 ,进而 导致食源性中毒 [5 ] 。在引起沙门氏菌中毒的食品中 ,约 90% 是蛋 、肉 、奶等畜产品 [6 ] ,因此沙门氏菌的快速检测对公共卫 生 、食品卫生 、畜牧兽医和口岸检疫等都具有重要意义 。本研 究建立了基于 SP I - 3的 m g tC基因的 PCR 快速检测方法 ,并 对来自江苏省部分地区的鸡蛋进行了沙门氏菌检测 ,为预防 食源性沙门氏菌感染提供借鉴材料 。
[ 4 ] Toyofuku H. Ep idem iological data on food poisonings in Japan fo2 cused on Sa lm onella, 1998 - 2004 [ J ]. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo R isk A ssess, 2008, 25 ( 9) : 1058 - 1066.
细菌分离
阳性数 (枚 ) 30 5 2 3 40
百分率 (%) 15. 31 8. 33 10. 00 15. 00 13. 51
素酶试验鉴定 ,共从 296枚鸡蛋中的 40枚 ( 13. 51% )检测到 沙门氏菌 (表 1) ,其检出率低于 PCR检测方法 。 2. 3 两种检测方法的比较
经与常规细菌学检测结果比较 , 表明通过基于毒力岛 SP I - 3的 m gtC基因所建立的沙门氏菌 PCR检测方法具有以 下特点 : (1)敏感性 。通过对相同样品的检测 ,发现建立的用 于检测鸡蛋中沙门氏菌的 PCR 方法的检出率高于常规细菌 学检测结果 。 (2)可靠性 。所有常规细菌学检测结果为阳性 的样品 ,利用 PCR方法检测均为沙门氏菌阳性 。 (3)快速性 。 所建立的用于检测禽蛋中沙门氏菌的 PCR 方法耗时 12 ～16 h,明显比常规细菌学检测方法 (100～110 h)缩短 。
通过本研究进一步证明了基于 SP I - 3 的 m g tC 基因的 PCR方法进行沙门氏菌快速检测的敏感性 、可靠性以及快速 性 ,同时本研究的沙门氏菌检测结果也揭示了目前商品鸡蛋 沙门氏菌污染的风险 ,进一步提示蛋 、肉 、奶等畜产品的沙门 氏菌检测在公共卫生 、食品卫生 、畜牧兽医和口岸检疫中的重 要意义 。
收稿日期 : 2009 - 07 - 22 基金项目 :江苏检验检疫课题 (编号 : 2007KJ06) 。 作者简介 :陈 飞 (1970—) ,男 ,江苏射阳人 ,兽医师 ,主要从事出入
境检验检疫 。 Tel: ( 0512) 56302700; E - mail: bainui@126. com。 通讯作 者 : 成 大 荣 ( 1971—) , 男 , 副 教 授 。 Tel: ( 0514 ) 87892598;
通过常规细菌学分离以及 IMV iC试验 、糖发酵试验 、尿
陈 飞等 :鸡蛋中沙门氏菌的快速检测
— 285 —
来源地
盐城 苏州 无锡 扬州 Hale Waihona Puke Baidu计
表 1 鸡蛋沙门氏菌的样品检测结果
样品数 (枚 )
196 60 20 20 296
PCR 检测
阳性数 (枚 ) 38 9 3 4 54
百分率 (%) 19. 39 15. 00 15. 00 10. 00 18. 24
— 284 —
江苏农业科学 2009年第 5期
鸡蛋中沙门氏菌的快速检测
陈 飞 1 , 成大荣 2 , 田志高 1 , 孙怀昌 2 , 张鑫宇 2 , 王丽芳 1
(1. 张家港出入境检验检疫局 ,江苏张家港 215600; 2. 扬州大学兽医学院 ,江苏扬州 225009)
摘要 : 选择江苏省不同地区来源的鸡蛋 296枚 ,分别取蛋黄蛋清混合液以沙门氏菌增菌液快速增菌 。取增菌培 养物 100μl,离心去上清后 ,重新悬浮于 100μl超纯水中 ;以煮沸法制备可能存在的细菌 DNA 模板 。通过对沙门氏菌 毒力岛 SP I - 3的 m gtC基因的 PCR快速检测 ,确定其中 18. 24%的鸡蛋为沙门氏菌阳性 。通过与细菌分离检测结果 对比 ,揭示该方法明显提高了沙门氏菌的检出率 ,表明 PCR 是一种快速 、敏感和高度特异性的沙门氏菌检测方法 ,值 得在畜产品沙门氏菌的检测中推广应用 。 关键词 : 鸡蛋 ; 沙门氏菌 ; PCR; 检测 中图分类号 : S851. 347. 102 文献标志码 : A 文章编号 : 1002 - 1302 (2009) 05 - 0284 - 02
3 讨论
常见食源性细菌感染的病原微生物有沙门氏菌 、大肠杆 菌 、弧菌 、金黄色葡萄球菌 、单核增生李斯特菌以及空肠弯曲 菌等 。因此 ,上述致病菌的快速检验对提高卫生防疫水平非 常重要 。目前 ,在进行食品质量安全监控的 CMA 认证检测 时 ,沙门氏菌的检测已成为必检的卫生指标项目之一 。传统 的检测方法过程复杂 ,周期长 ,不仅造成人力物力的浪费 ,也 影响了口岸的通关速度 。应用快速简易 、敏感性高和特异性 强的 PCR技术 ,为畜产品中沙门氏菌的快速检测提供了一种 行之有效的手段 。
E - mail: jsyzcdr@ yahoo. com. cn。
1. 2 方法 1. 2. 1 样品采集 随机采集江苏省部分地区的商品鸡蛋 296枚 ,分别来自盐城 ( 196枚 ) 、苏州 ( 60枚 ) 、无锡 ( 20 枚 ) 、 扬州 (20枚 ) 。 1. 2. 2 快速增菌 每枚鸡蛋分别以碘酊和 75%酒精消毒 后 ,小心去除气室一端的蛋壳 。以灭菌吸管将蛋黄 、蛋清搅匀 后 ,吸取 1 m l蛋黄蛋清混合液接种于 5 m l沙门氏菌增菌液 , 37 ℃振摇培养 6～8 h,必要时延长至 18 h。 1. 2. 3 DNA 模板的制备 取增菌培养物 100 μl,离心去除 上清液后 ,重新悬浮于 100μl超纯水中 ;以煮沸法制备 DNA 模板 : 100 ℃煮沸 10 m in,迅速冰浴 5 m in,然后 4 ℃条件下 10 000 r/m in离心 5 m in,取上清液储存于 4 ℃下备用 [10 - 11 ] 。 1. 2. 4 PCR快速检测沙门氏菌 取 10 ×PCR Buffer 2. 5μl、 M gCl2 ( 25 mmo l/L ) 2. 5μl、4 ×dN TPs( 10 mmo l/L ) 2μl、引物 SP I - 3F 和 SP I - 3R (均 为 50 μmol/L ) 各 0. 5 μl、Taq 酶 (5 U /μl) 0. 5 μl、步骤 1. 2. 3 制备的 DNA 模板 2. 5 μl, 加 H2 O 至 25μl。 PCR反应条件 : 94 ℃ 3 m in; 94 ℃ 40 s, 63 ℃ 40 s, 72 ℃ 1 m in,每个循环降低 1 ℃,共 5个循环 ;然后 94 ℃ 40 s, 58 ℃ 40 s, 72 ℃ 1 m in,共 25个循环 ; 72 ℃ 10 m in, 4 ℃ 保温 。取 PCR 扩增产物 5μl在 1%琼脂糖凝胶中进行 80 V 电泳 1 h,以 DNA M arker DL2000为参照 ,观察扩增片段大小 。 1. 2. 5 沙门氏菌的分离与鉴定 按无菌操作挑取增菌培养 物并划线接种于麦康凯琼脂平板 ,于 37 ℃培养 24 h后 ,观察 细菌生长 情 况 , 并 选 择 典 型 灰 白 色 菌 落 进 行 纯 培 养 。以 IMV iC试验 、糖发酵试验 、尿素酶试验鉴定分离的细菌 。
[ 7 ]McClelland M , Sanderson K E, Sp ieth J, et al. Comp lete genome se2 quence of S alm onella en terica serovar Typhimurium LT2 [ J ]. Nature, 2001, 413 ( 6858) : 852 - 856.