病毒的细胞培养(医学相关)
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• 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生 长需要。
优质课件
12
• 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想 使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天 然培养基（如血清）。
优质课件
13
• 血清中含有：
• ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） • ②多种金属离子 • ③激素 • ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原
• 在长成致密单层细胞后，将病毒接种在细胞上， 置于适当环境中进行培养，逐日观察细胞病变 （CPE）待75%的细胞出现CPE后收获细胞，反 复冻融3次，置-70℃保存备用。
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3
细胞培养的基本概念
• 传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后， 被分开接种到新的培养器皿中。
• 原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外 条件下生长的细胞在传代之前称为原代培 养。
水中，每升培养液中加人0.5ml；链霉素为100万U／瓶，
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将其溶解在5ml三蒸水中，每升培养液加0.5ml）。
（7）冻存液：二甲基亚砜
（8）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖的液体。
其是配方：
基础培养基 80％－90％
血清 10%
双抗 100u/ml
（9）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长或不死的培养
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9
4.细胞培养用液及培养基（液）:
（1）水：蒸馏水、双蒸水，可高压除菌。
（2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.2－7.4，不含钙镁离子 ， 可高压除菌。
（3）消化液 :
胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为0．25％，pH值7.2左 右。需过滤除菌。 EDTA液：常用浓度为 0．02％，配制时采用无Ca2+、 Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。
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10
(4) 培养基
• 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的 溶液，分天然培养基和合成培养基。
• 天然培养基：
• 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡 胚和牛胚浸液）。
• 优点：营养成分丰富，培养效果好
• 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产 物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染
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17
每代贴附生长细胞的生长过程
• 游离期
• 贴壁期
• 潜伏期
• 对数生长期
• 停止期（平台期）
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18
细胞培养常用的培养瓶、 培养皿、6孔板、96孔板
贴附生长型细胞
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19
悬浮生长型细胞
优质课件
20
六 细胞培养的实验步骤
1原代细胞的培养 以鸡胚成纤维细胞为例 （1）取胚 （2）组织处理 （3）消化 （4）分装、培养
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11
合成培养基
• 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数 量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多 种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
• 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化 合物、无机盐和其它一些辅助物质。
• 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本 低
• 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无 细菌、支原体、病毒污染。
• 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟
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（5）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的成分，是细
胞生命的能量来源。
（6）抗生素：最终浓度为青霉素 100 U／ml，链霉素
100U／ml（青霉素为80万U／瓶，将其溶解于4ml三蒸
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（1）取胚
• 选取9-11日龄SPF鸡胚，大头朝上直立于蛋 架上，用碘酒、酒精消毒气室外壳。用镊 子从气室端打开蛋壳，撕开壳膜，用无菌 镊子轻轻取出鸡胚，放入灭菌平皿中。
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（2）组织处理
• 用PBS液冲洗胚体2-3次，再将鸡胚的头、 爪、内脏去除，剩下的胚体在用PBS液冲 洗胚体2-3次，然后再放入平皿中，用剪刀 将鸡胚剪成碎块。
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4
二 主要优点
• ㈠ 研究的对象是活的细胞。 • ㈡ 研究的条件可以人为的控制。 • ㈢ 研究的样本，可以达到比较均一性。 • ㈣ 研究的内容便于观察、检测和记录。 • ㈤ 研究的范围比较广泛。 • ㈥ 研究的费用相对较经济。
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5
三 分类
• 原代细胞培养 • 传代细胞培养
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6
• 传代细胞可以直接从肿瘤组织获得，又可 以通过人工驯化获得。
• 常用的传代细胞：PK-15、IBRS-2、Vero、 Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela 等
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8
四 培养实验用品的前期处理
1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿 (2)塑料器皿 2.包装 3.消毒：在组织细胞培养技术中，务必保 证组织细胞在无微生物的条件下生长。
等。 • ⑤各种生长因子 • ⑥转移蛋白 • ⑦不明成分
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• 一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞 可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10 ％血清．
• 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明， 但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．
• 血清质量好坏是实验成败的关键。
• 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、 兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。
病毒的细胞培养
赵健乔
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1
• 一 基本原理 • 二 细胞培养的基本概念 • 三 主要优点 • 四 培养实验用品的前期处理 • 五 培养细胞的生长方式及类型 • 六 细胞培养的实验步骤 • 七 病毒的细胞培养
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2
一 基本原理
• 通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体 取出，分散成单个细胞，给与必要的生长条件。 模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长与增 值。
液。
其是配方：
基础培养基 95％
血清 2％－5％
双抗 100u/ml
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五 培养细胞的生长方式及类型
• ㈠ 贴附生长型细胞
必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大 体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难 以确定其稳定形态的细胞。
• ㈡ 悬浮生长型细胞
不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。
原代细胞培养
• 概念：从供体获取组织细胞后在体外进行 的首次培养。
• 优点：生物学特性未发生很大变化，细胞 染色体仍为二倍体，接近和反映体内生长 特性，适合做药物测试、细胞分化及病毒 学方面的实验
• 缺点：传代次数较多细胞就会衰亡。
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传代细胞培养
• 概念：原代细胞经过一系列传代，产生变 异，转化为能够连续传代的细胞。
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• 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想 使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天 然培养基（如血清）。
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• 血清中含有：
• ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） • ②多种金属离子 • ③激素 • ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原
• 在长成致密单层细胞后，将病毒接种在细胞上， 置于适当环境中进行培养，逐日观察细胞病变 （CPE）待75%的细胞出现CPE后收获细胞，反 复冻融3次，置-70℃保存备用。
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细胞培养的基本概念
• 传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后， 被分开接种到新的培养器皿中。
• 原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外 条件下生长的细胞在传代之前称为原代培 养。
水中，每升培养液中加人0.5ml；链霉素为100万U／瓶，
百度文库
将其溶解在5ml三蒸水中，每升培养液加0.5ml）。
（7）冻存液：二甲基亚砜
（8）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖的液体。
其是配方：
基础培养基 80％－90％
血清 10%
双抗 100u/ml
（9）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长或不死的培养
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4.细胞培养用液及培养基（液）:
（1）水：蒸馏水、双蒸水，可高压除菌。
（2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.2－7.4，不含钙镁离子 ， 可高压除菌。
（3）消化液 :
胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为0．25％，pH值7.2左 右。需过滤除菌。 EDTA液：常用浓度为 0．02％，配制时采用无Ca2+、 Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。
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(4) 培养基
• 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的 溶液，分天然培养基和合成培养基。
• 天然培养基：
• 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡 胚和牛胚浸液）。
• 优点：营养成分丰富，培养效果好
• 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产 物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染
优质课件
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每代贴附生长细胞的生长过程
• 游离期
• 贴壁期
• 潜伏期
• 对数生长期
• 停止期（平台期）
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细胞培养常用的培养瓶、 培养皿、6孔板、96孔板
贴附生长型细胞
优质课件
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悬浮生长型细胞
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20
六 细胞培养的实验步骤
1原代细胞的培养 以鸡胚成纤维细胞为例 （1）取胚 （2）组织处理 （3）消化 （4）分装、培养
优质课件
11
合成培养基
• 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数 量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多 种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
• 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化 合物、无机盐和其它一些辅助物质。
• 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本 低
• 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无 细菌、支原体、病毒污染。
• 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟
优质课件
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（5）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的成分，是细
胞生命的能量来源。
（6）抗生素：最终浓度为青霉素 100 U／ml，链霉素
100U／ml（青霉素为80万U／瓶，将其溶解于4ml三蒸
优质课件
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（1）取胚
• 选取9-11日龄SPF鸡胚，大头朝上直立于蛋 架上，用碘酒、酒精消毒气室外壳。用镊 子从气室端打开蛋壳，撕开壳膜，用无菌 镊子轻轻取出鸡胚，放入灭菌平皿中。
优质课件
22
（2）组织处理
• 用PBS液冲洗胚体2-3次，再将鸡胚的头、 爪、内脏去除，剩下的胚体在用PBS液冲 洗胚体2-3次，然后再放入平皿中，用剪刀 将鸡胚剪成碎块。
优质课件
4
二 主要优点
• ㈠ 研究的对象是活的细胞。 • ㈡ 研究的条件可以人为的控制。 • ㈢ 研究的样本，可以达到比较均一性。 • ㈣ 研究的内容便于观察、检测和记录。 • ㈤ 研究的范围比较广泛。 • ㈥ 研究的费用相对较经济。
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三 分类
• 原代细胞培养 • 传代细胞培养
优质课件
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• 传代细胞可以直接从肿瘤组织获得，又可 以通过人工驯化获得。
• 常用的传代细胞：PK-15、IBRS-2、Vero、 Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela 等
优质课件
8
四 培养实验用品的前期处理
1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿 (2)塑料器皿 2.包装 3.消毒：在组织细胞培养技术中，务必保 证组织细胞在无微生物的条件下生长。
等。 • ⑤各种生长因子 • ⑥转移蛋白 • ⑦不明成分
优质课件
14
• 一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞 可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10 ％血清．
• 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明， 但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．
• 血清质量好坏是实验成败的关键。
• 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、 兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。
病毒的细胞培养
赵健乔
优质课件
1
• 一 基本原理 • 二 细胞培养的基本概念 • 三 主要优点 • 四 培养实验用品的前期处理 • 五 培养细胞的生长方式及类型 • 六 细胞培养的实验步骤 • 七 病毒的细胞培养
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2
一 基本原理
• 通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体 取出，分散成单个细胞，给与必要的生长条件。 模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长与增 值。
液。
其是配方：
基础培养基 95％
血清 2％－5％
双抗 100u/ml
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五 培养细胞的生长方式及类型
• ㈠ 贴附生长型细胞
必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大 体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难 以确定其稳定形态的细胞。
• ㈡ 悬浮生长型细胞
不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。
原代细胞培养
• 概念：从供体获取组织细胞后在体外进行 的首次培养。
• 优点：生物学特性未发生很大变化，细胞 染色体仍为二倍体，接近和反映体内生长 特性，适合做药物测试、细胞分化及病毒 学方面的实验
• 缺点：传代次数较多细胞就会衰亡。
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7
传代细胞培养
• 概念：原代细胞经过一系列传代，产生变 异，转化为能够连续传代的细胞。