第六章 基因工程抗体

单抗制备的流程图
实际意义：
（1）抗原的纯化和结构分析； （2）细胞发生、分化及功能的阐明； （3）临床疾病的诊断和治疗， 如：免疫分子检测； 免疫导向药物治疗恶性肿瘤 --- McAb抗癌药物(毒素或 放射核素偶联)。
多克隆抗体与单克隆抗体的比较
多克隆抗体 来源 动物免疫血清、恢复期病人血 清或免疫接种人群 特点 来源广泛、制备容易 组成 针对不同抗原表位的抗体的混 合物 单克隆抗体 多为鼠源性 纯度高、特异性强、效价高、少 或无血清交叉反应 针对单一表位，结构和组成高度 均一，抗原特异性及同种型一致
在Ig分子多肽 链中，κ型、λ 型轻链和Ig的 重链分别写作 Igκ、Igλ和IgH， 基因依次写作 IGK、IGL和 IGH，其分别 位于第2、22 和14号染色体 上。
13
V区编码基因: VH (可变区) ----- 48 DH (多样性区) ----- 23 JH (连接区) ----- 6
功能：具有较好的抗原结合 能力，且分子量小、穿透力强、 免疫原性低等特性。可与其他效 应分子构建成多种具有新功能的 抗体分子，是构建免疫毒素和双 特异抗体等的理想而基本的元 件 。
ScFv应用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布
基因治疗
研究基因结构与功能的关系
小分子抗体
2 1
3
I Fab antibody molecule
基 因 工 程 抗 体
27
1 小分子抗体
基 因 工 程 改 造 的 抗 体
2
3 鼠单抗人源化
第一代的抗体人源化—嵌合抗体
从杂交瘤细胞分离出鼠 MAb 功能 性可变区基因，与人Ig恒定区（决定 免疫原性）基因连接，插入适当表达 载体，转染宿主细胞，表达人 - 鼠嵌 合抗体。嵌合抗体由于这两部分在空 间结构上相对独立，其独特的抗体亲 和力保持得很好，但因鼠单抗可变区 的存在，应用时仍有较强的免疫排斥 反应。
实际意义
（1）预防、治疗感染性疾病， 如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风， 胎盘球蛋白 抗病毒感染等， 副作用： 超敏反应。 （2）临床诊断， 如：肥达氏反应 --- 伤寒、副伤寒， 缺点：特异性差。
2、单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）
由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗 原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。 特点：具有高度均一性。 杂交瘤细胞： 骨髓瘤细胞 --- 无限增殖； 免疫B细胞 --- 合成、分泌特异性抗体。 杂交瘤技术 --- HAT培养基：次黄嘌呤(H), 氨 基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。
特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性， 同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略
Pr 鼠VH 人 CH
启动子
Pr 鼠VL 人 CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
共转染细胞
抗体分泌细胞
鼠VH
鼠V L 人CL 人CH
人-鼠嵌合基因工程抗体
在嵌合抗体的基础上进一步将 鼠 MAb 可 变 区 中 相 对 保 守 的 FR(framework region) 替 换 成 人 的 FR ，保留与抗原结合部位决定簇互 补 区 （ complement determinant region)部位 (即CDR移植)
包括嵌合抗体、单链抗体形式。
免疫粘附素(immunoadhension) ：将人抗体
恒定区(主要是Fc段)N-端连接于人细胞表面的受体
分子或细胞粘附分子上，在真核细胞中表达出正确
折叠的融合抗体蛋白分子，这种分子可同时发挥抗 体的效应功能及其它相应的效应功能，这种分子又 被称为新效能抗体。
移植排斥 心绞痛 B细胞非霍奇金淋巴瘤 移植排斥 移植排斥 婴儿呼吸道合胞病毒 类风湿关节炎 乳腺癌 急性复发性髓性白血病 难治性慢性淋巴细胞白血病 难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤
1986 1994 1997 1997 1998 1998 1998 1998 2000 2001 2002 5
一 抗体分子结构
-S-S-
CH1
抗原A
VH
抗原B
VL
Fv
VH VL
抗原A
VH
抗原B
VL
CH1
-S-S-
-S-S-
wk.baidu.com
CH1
TUMOR CELL
CTL
CD3

（1）杂化杂交瘤技术：将具有某种特异性 （如抗瘤细胞）的Mab细胞株与具有抗第二 抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾细胞进行 融合，即产生出杂化杂交瘤细胞株的二价 瘤体。
Gerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibody
Susumu Tonegama ,1987, structure of Ig gene
Nobel Prize winners
免疫球蛋白的功能
Orthoclone ReoPro Rituxan Zenapax Simulect Synagis Remicade Herceptin Mylotarg Campath-1H Zevalin
antibody
antigen
antigen-antibody complex:
epitope
purple : HV CDR ( in both the ribbon and ball and stick views) green : antigen HV sequences contact the antigen.
H链表达载体
共转染细胞
Fv [二硫键稳定的Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)]小分子抗体的制备
抗体分泌细胞
VH
-S-S-
VL
disulfide-stabilized Fv, ds-Fv
Fv小分子抗体的制备
三、单域抗体
抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定， 因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只
医学院免疫学研究所 王嘉宁
Paul Ehrlich , 1908, Emil von Behring, 1901, production of antitoxins antibody
Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody
根据其价数的不同可分为单价小分子
抗体及多价小分子抗体。
单价小分子抗体
一、Fab抗体
Fab段由重链V区及CH1 功能区与整个轻链以二硫 键形式连接而成，主要发 挥抗体的抗原结合功能。 Fab抗体只有完整IgG的1/3。
二、单链抗体(ScFv)
定义：用基因工程方法，
Ag
将抗体VH和VL（重链和轻链可变 区）通过一个连接肽连接而成的 小分子抗体，
肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的
结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为
超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimal
recognition unit, MRU)。
提高抗体效应功能
双特异性抗体 抗体融合蛋白
提高抗体 效应功能
细胞内抗体
偶连细胞毒物质
双特异性抗体
Fab
VH VL
CH1
-S-S-
有VH或 VL一个功能结构域，也能保持原单
克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段
就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个
Ig分子的1／12，故也称之为小抗体。
四.超变区多肽
抗体抗原结合是经过补体决定区（CDR）来
实现。因此，CDR是构成抗原抗体结合的最小
结构单位。根据这一特点，可以设计出那些
在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多
免疫球蛋白的功能区
免疫球蛋白的水解片段
complimentarity determining region,
CDR
hypervarible region (HVR) (complimentarity determining region, CDR) : formation of the Ag binding site
Pr VH CH1 Pr VL CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链表达载体
L链表达载体
共转染细胞
Fab 抗体分子的制备
抗体分泌细胞
VH CH1 VL CL
-S-S-
Fab 抗体分子的制备
II Fv antibody molecule
(1) ds-Fv
Pr VH Pr VL
分别构建载体
L链表达载体
在这些杂化抗体分子中，只有LH-GK配对的才 是所需的双功能抗体分子。

（2）化学交联法：Nisonoff和Rivers最早 从事这方面的研究。化学交联的方法无需 经过细胞融合，所以比较简便易行。 通常利用重链与轻链这间的二硫链经还 原和再氧化，将两种不同特异性抗体的半 分子结合在一起。或用双功能交联剂，如 邻苯酸酯等，把两个抗体半分子交联在一 起。
1975年Kö hler and Milstein等首次利用B淋巴细胞 杂交瘤技术制备出单克隆抗体 (monoclonal antibody, MAb)。 1994年基因工程抗体。


1、多克隆抗体(polyclonal antibody; PcAb)
多价抗原
多个克隆 （致敏的B细胞）
多克隆抗体
早期的改型抗体：
简单的CDR移植，通过点突变进行 微调即更换某个位点上的氨基酸。
CDR序列
CDR序列
鼠单克隆抗体
人抗体
人源化抗体
鼠单克隆V区人源化（CDR移植）
小分子抗体
人源化抗体属完全的抗体分子。通过 基因重组技术，可以在保持原有抗原结合
活性的基础上，把完整的抗体分子改造成
较小的分子，称为小分子抗体。
应用 疾病的被动免疫治疗
疾病诊断、特异性抗原或蛋白的 检测和鉴定、疾病的被动免疫治 疗和生物导向药物制备
缺点 特异性不高、易发生交叉反应， 人体应用后可导致人鼠抗体反应 不易大量制备
单抗体内应用和疗效受限原因：
1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性 2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量 甚少 3.生产成本高,难于普及应用
抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，
所形成的具有新的特性融合蛋白。 根据构建方式的不同，主要分为两种形式： Fc融合蛋白（Fc fusion protein,FcFP）由抗体的Fc 段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。
如CD4免疫粘附素，就是由抗体的Fc段与2个CD4
分子的Ig同源区重组而成 抗原结合融合蛋白（antigen-Binding fusion protein, ABFP）由具有抗原结合功能的抗体结构与其他功 能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体部分主要

人杂交瘤技术未获真正突破原因:融合率低、 建株难、不稳定、产量低、人体不能随意 免疫 新思路：尽量减少抗体中的鼠源成分，但又 尽量保留原有的抗体特异性。 基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基 因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白 基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细 胞进行表达，产生新型抗体，主要包括嵌 合抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体 融合蛋白和双特异性抗体。
第二代：细胞工程抗体 第三代：基因工程抗体

1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素， 并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。

1937年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、 甲种（α）球蛋白、乙种（ β ）球蛋白、丙种（ γ ） 球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白 组分。
C区编码基因: CH (恒定区): Cμ, Cδ, Cγ等10个片段
Cμ
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V区编码基因: ---- V, J --- 40, 5 ---- V, J --- 30, 4 C区编码基因: C (1); C(4)
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二、细胞工程抗体和基因工程抗体
抗体技术的发展经历了三个阶段
第一代：多克隆抗血清
用于制备双功能抗体的Mab可以是完整 分子，也可是经胃酶水解获得F（abˊ）2 片段。后者在减少鼠源免疫原性方面，效 果较好。

（3）利用基因工程技术将两套重轻链基因 导入骨髓瘤细胞或传染瘤细胞中。 这种方法制备的双功能抗体可选择合 适的稳定区和合适的类及亚类，而得到较 好的产量较高的双功能抗体。由于只有较 少的嵌合导入并整合到宿主基因组，故传 染瘤细胞更为稳定，染色体不易丢失

它们分泌的是重链、轻链被杂化的抗体分子，有 10种形式： 重链、轻链都无改变，保持原特异性的配对抗 体分子： LH-HL，KG-GK 重链特异性相同的配对抗体分子： LH-HK，KH-HK KG-GL，LG-GL 重链、轻链特异性不同的配对抗体分子： LH-GK，LH-GL KH-GL，KH-GK