第六章 基因工程抗体
基因工程抗体
基因工程抗体及其进展【摘要】着对分子生物学研究和抗体分子结构功能的深入研究,利用细胞工程和遗传工程对抗体分子进行改建并赋予其新的功能,进而开发了新的抗体应用领域,使单克隆抗体技术又向前发展了一步。
基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子,可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少无关结构,从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。
细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
抗体产生的技术革命为抗体治疗开辟了广阔的前景。
【关键字词】基因工程抗体人源化抗体小分子抗体广阔的前景基因工程抗体以其独特的优点(免疫原性低、可按人的意愿加以改造等) 正逐渐取代动物源性单抗。
随着基因工程和蛋白质工程等生物技术在抗体研制领域的广泛应用, 适应不同需要的基因工程抗体的种类日趋多样化, 构建日趋合理化, 在体内的生物学效应也日臻完善, 使之较天然单抗的治疗效果更好, 范围更广, 并在初步临床试用中展示了光辉的前景。
分子生物学技术的发展，推动了免疫球蛋白遗传学的研究。
抗体的研究从原来的血清学方法、氨基酸水平分析发展到大免疫球蛋白基因结构、表达及调控DNA水平的研究，揭示了抗体多样性、等位基因排斥现象、抗体的分泌型和膜结合型形式、H链类别转换以及亲和力成熟机制等多种生物学现象。
自1975年Milstein和kÖhler等人研制出单克隆抗体以来，抗体技术得到了广泛的应用和发展，但在生物研究和临床疾病的治疗中却遇到了一定的困难。
异源性鼠抗体在人体内诱生免疫应答，产生抗小鼠抗体；人单克隆杂交瘤制备困难，生产量少，稳定性差；获得特异性类别抗体比较困难。
随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。
1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。
至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
基因工程抗体
基因工程抗体[摘要]抗体在生物医学领域中的应用极为广泛,其制备技术经历了从多克隆抗血清、单克隆抗体到基因工程抗体等3个发展阶段。
基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子,可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少无关结构,从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。
关键词: 基因工程抗体；抗体基因工程抗体,即应用基因工程技术将抗体的基因重组并克隆到表达载体中,在适当的宿主中表达并折叠成有功能的一种抗体分子。
一、基因工程抗体概述基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。
此技术的基本原理是[1],首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA,逆转录成cDNA,再经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因,按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中,并在适当的细胞(如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、植物细胞及昆虫细胞等)中表达并折叠成有功能的抗体分子,筛选出高表达的细胞株,再用亲和层析等手段纯化抗体片段。
基因工程抗体技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分,保留原有抗体的亲和力和特异性。
借助于基因工程技术,既可以对完整抗体,又可以对抗体片段进行改造。
二、基因工程抗体类型1.重组抗体片段小分子抗体以表达抗体轻重链可变区基因为主,含或不含外源肽链的分子较小的抗体片段,以分子小、体内半衰期短、免疫原性低、可在原核细胞系统表达、易于基因工程操作等特点而倍受关注。
主要包括单链抗体、双特异性抗体、二硫键抗体、抗体Fab段、单域抗体(single domain antibody,SDA)、三链抗体(triabody)、抗体F(ab')2等。
目前研究较多的是单链抗体、双特异性抗体、二硫键抗体和抗体Fab段。
1.1单链抗体单链抗体单链抗体是用基因工程方法将抗体重链和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组蛋白,是保持了亲本抗体的抗原性和特异性的最小功能型抗体片段,具有分子小、免疫原性低、无Fc端、不易与具有Fc受体的靶细胞结合、对肿瘤组织的穿透力强等特点,可作为将药物、毒素、放射性核素、细胞因子导向肿瘤的有价值分子;还可以将单链抗体基因导向到肿瘤细胞,在肿瘤细胞中表达,干扰肿瘤细胞蛋白表达,这种抗体称为胞内抗体。
《基因工程抗体》PPT课件
早期的改型抗体：
简单的CDR移植，通过点突变进行微 调即更换某个位点上的氨基酸。
理想的抗体药物的性质
高特异性和高亲和力（Kd=108~1010L/M） 对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排 斥反应 游离抗体不激活补体 一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能 细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行 大规模培养 抗体符合生物制品标准
抗体治疗存在的问题及对策
问题
对策
异源蛋白导致产生抗抗体，• 抗体人源化 影响靶向性和效果
2 开创人类抗体基因组学的研究 评 价：1 诺贝尔奖得主Dr Milstein 推荐发表在
PNAS 2 世界权威杂志“科学”发表了新闻评述 3 剑桥大学开了新闻发布会
未来单抗开发的完美方案
从已知治疗靶子生产高亲和力全人抗体 全人抗体挑战靶分子的筛选 开发未知抗原的治疗用抗体
已批准上市的单抗
适用病症 移植排斥 大肠癌 冠心病
AbAg是应用基因工程技术，把编码蛋白 质抗原表位的核苷酸片段插入重链CDR3序列 中进行表达，从而产生具有天然抗原表位构 象和免疫原性的新型抗体。
今后抗体药物发展的方向
寻找新的靶抗原 基于抗原立体结构设计抗体 基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗 体模拟物
最理想的单克隆抗体 100%人源 人类免疫系统自然产生
功能：具有较好的抗原结合能 力，且分子量小、穿透力强、免 疫原性低等特性。可与其他效应 分子构建成多种具有新功能的抗 体分子，是构建免疫毒素和双特 异抗体等的理想而基本的元件 。
第六章抗体的表达
常用的原核表达载体分类及特征
转录载体：用以表达本身带有原核核糖体结合位 点和AUG起始密码子的目的基因T-24（+）和pET-23（+）
体
翻译载体：包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效
核糖体结合位点，用于表达一些不带有核糖体结合
位点的目的基因
pET载体系统为满足不同的需求，生产了带有His·Tag、 T7·Tag、S·Tag、GST·Tag、ompT、CBD S·Tag、 Thioredoxin、DsbA·Tag 、Trx·Tag等标签的融合蛋白，其中带 有S·Tag、His·Tag、T7·Tag的蛋白易于通过蛋白质杂交检测。
11
一种表达体系的核心是表达载体及宿主菌，而表达方法的进步也 主要体现在载体元件的优化和宿主菌基因型的改造上。 理想的原核表达载体应具有以下特征：
（1）稳定的遗传复制和传代能力；
（2）具有显性的转化筛选标记； （3）启动子的转录是可调控的，抑制时本底转录水平较低； （4）启动子转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程 中不影响表达载体的复制； （5）具备适用于外源基因插入的酶切位点，以确保目的基因 按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。
第六章抗体的表达
第一节 概述
目前抗体的主要类型： 1、多克隆抗体：通过免疫手段制备。 2、单克隆抗体：通过杂交瘤技术制备。 3、基因工程抗体：包括嵌合抗体、改型抗体等，通过 基因工程手段制备，涉及设计、构建与表达等。
2
3
要想获得全长的抗体分子，就必须选择恰当的抗体表 达系统，而要使所表达的蛋白质结构不具有免疫原性 或避免半衰期过短，就需要使用一个标准的抗体工程 技术生产全人抗体。
大肠杆菌表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物表达系统酵母表达系统存在一些蛋白不能有效地折叠发酵周期较长容易污染需要考虑表达产物的卫生安全性筛选产物价格昂贵有时表达产物没有生物活性等问题都为临床生产和应用带来了不便也存在产物低表达或不表达的问题产物纯化问题依然存外源基因不能持久稳定地表达而且表达成本很高技术背景复杂存在不正确的糖基化修饰且表达量低原核表达系统具有吸引力的原因在于它的成本低生产率高和能够大规模快速的生产等优点第二节原核表达系统原核表达是指通过基因克隆技术将外源目的基因通过构建表达载体并导入表达菌株的方法使其在特定原核生物或细胞内表达
基因工程抗体PPT课件
cover illustration Antibody single-chain fragment stability-engineered by point mutations (A) and by a CDR-graft to the most stable human consensus framework (B). Insufficient thermodynamic stability can limit the use of particular antibody fragments as targeting moieties in therapeutic constructs, such as e.g. immunotoxins or immunoliposomes. This limitation can be overcome by a graft of the antigen combining site to a more stable antibody framework. However, such grafts sometimes fail to reach the superior stability of the acceptor framework. Comparison with the stabilization obtained with a set of designed point mutations shows that this is not always due to destabilizing interactions within the complementary determining regions, but to subtle structural differences between different classes of antibody frameworks that introduce strain in CDR grafts to divergent frameworks. For further details please see Kügler et al. (pp.135–148) and Honegger et al. (pp. 121–134).
《基因工程抗体》PPT课件
（三）单链抗体（single-chain antibody
） • 又称FV分子。
• 目的：基因工程手段构建更小的具有结合抗原能力的抗体片段，即FV分子或单链抗体 蛋白。
• 本质：是由VL区氨基酸序列与VH区氨基酸序列经肽连接物（linker）连接而成。此外肽 连接物还可将药物、毒素或同位素与单链抗体蛋白相融合。
优点
• 这类抗体具有分子量小，作为外源性蛋白的免疫原性较低；在血清中比完整的单 克隆抗体或F(ab)2片段能更快地被清除；无Fc片段，体内应用时可避免非特异性 杀伤；能进入实体瘤周围的微循理：可将抗体分子的部分片段（如V区或C区）连接到与抗体无关的序列上（如 毒素），就可创造出一些Ig相关分子
• 催化抗体制备技术的开发预示着可以人为生产适应各种用途的，特别是自然界不存在 的高效催化剂，对生物学、化学和医药等多种学科有重要的理论意义和实用价值。
（二）催化抗体的制备
• 催化抗体（抗体酶）技术是化学和免疫生物学的研究成果在分子水平交叉渗透的产物 ，是将抗体的极其多样性和酶分子的巨大催化能力结合在一起的蛋白质分子设计的新 方法，故而显示出较高的理论和实用价值，成为酶工程领域中的研究热点。
2. 导入骨髓瘤细胞，使之表达嵌合重链 3. 再将小鼠杂交瘤细胞的Ig VL基因与人的CL基因相连 4. 转染含嵌合重链的小鼠骨髓瘤细胞 5. 筛选分泌鼠－人嵌合抗体的骨髓瘤细胞
所分泌的嵌合抗体与原杂交瘤细胞分 泌的抗体特异性和亲和力相同，但减 少了抗体中的鼠源性成分
（二）重构抗体（reshaping anti body）
基因工程抗体
（genetic engineering antibody）
• 随着DNA重组技术以及其它分子生物学技术的发展，人们利用基因工程技术来制备抗体 分子，这种抗体分子称为基因工程抗体，这是分子水平的抗体。
基因工程抗体
（三）双链抗体（diabody)及三链抗体 （triabody)
通过缩短scFv的接头，使两个单链抗体分子间互 相形成VH和VL配对，以非共价键结合在一起形成二 聚体，从而构建出的双价小分子抗体。
如果将两个不同特异性的单链抗体分子的VH和VL 交叉组合构建两个杂合的单链抗体基因，重组到同 一表达载体中，则可在大肠杆菌中表达出双特异双 链抗体。
• 细胞内抗体的应用 表型敲除：在细胞内表达特定抗体分子阻断某 内源蛋白的活性，可用研究靶蛋白的生物学功 能。 基因治疗：通过细胞内抗体对某些蛋白功能的 干扰也可达到基因治疗的目的，如利用癌基因 的细胞内抗体为抗肿瘤的基因治疗提供了一个 新的途径。 目前抗HIV gp120（外壳蛋白）的Fab段和抗Tat （调节蛋白）的scFv已进入临床试用。
• 缺点 有时ScFv比其亲本抗体的亲和力明显降
低，并常常显示聚集倾向，尤其在37度
时稳定性较差，这与轻重链可变区由作
用力较弱的非共价键连接在一起有关。
四、dsFv
• 在VH和VL之间导入了一个链间二硫键，构 建了disulfide-stabilized Fv, dsFv。 二硫键可设计在CDR也可在骨架区。由于 CDR涉及抗原结合，需了解Fv段的立体结构 才能确定正确的引入二硫键的部位。在远 离CDR的结构较保守的骨架区设计二硫键， 具备通用性。
创新的癌症免疫疗法——BiTE抗体技。
• 今年9月，安进向FDA提交首个BiTE疗法blinatumomab上市 申请。
• FDA日前表示，已接受审查BiTE免疫疗法blinatumomab生物
制品许可申请（BLA），同时已授予该药优先审查资格。 • 此前，FDA和EMA均已授予该药孤儿药地位，FDA还授予该 药突破性疗法认定。
基因工程抗体和抗体工程
2023-10-30contents •基因工程抗体概述•基因工程抗体技术•抗体工程技术•基因工程抗体和抗体工程的应用•未来展望与挑战目录01基因工程抗体概述基因工程抗体是指通过基因工程技术对抗体基因进行改造或合成，以产生具有特定性能的抗体分子。
基因工程抗体是通过操作DNA分子层面，根据需求对抗体基因进行各种形式的改造，如插入、敲除或突变等，以获得具有特定性能或去除不良特性的抗体。
基因工程抗体的定义基因工程抗体的种类将鼠源性抗体的人源化改造，使其具有人抗体的亲和性和特异性，同时降低鼠源性抗体的免疫原性。
人源化抗体单克隆抗体双特异性抗体突变体抗体通过杂交瘤技术，将鼠源性的B细胞和骨髓瘤细胞融合，产生的杂交瘤细胞能产生单一抗体的克隆。
具有识别两种不同抗原表位的抗体，通常用于肿瘤免疫治疗和自身免疫性疾病的治疗。
通过基因突变技术，改造抗体分子的结合位点，以获得更强的亲和力、更高的稳定性或降低免疫原性。
基因工程抗体可以用于肿瘤免疫治疗，如靶向肿瘤细胞的抗体-药物偶联物(ADC)，通过将细胞毒性药物偶联到抗体上，实现定向杀伤肿瘤细胞。
肿瘤免疫治疗基因工程抗体可以用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等，通过抑制或调节免疫反应达到治疗目的。
自身免疫性疾病治疗基因工程抗体可以作为疫苗的一部分，通过刺激机体产生特异性抗体来增强免疫力。
疫苗开发基因工程抗体的应用02基因工程抗体技术从免疫原刺激的B细胞中提取抗体基因，包括重链和轻链可变区基因。
抗体基因的获取将抗体基因与适当的载体连接，构建成表达载体。
载体构建将表达载体导入合适的宿主细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞系。
转化宿主细胞在宿主细胞中表达抗体，通常以融合蛋白的形式存在。
抗体表达抗体基因的克隆和表达抗体库的建立和筛选抗体筛选通过亲和力、特异性等指标筛选出高亲和力和高特异性的抗体。
抗体库的建立通过PCR扩增抗体基因，构建成多样性抗体库。
B细胞克隆从免疫动物的脾脏或淋巴结中提取B细胞，并克隆化。
基因工程抗体
. , . ,
也 许还有可
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、
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吞 噬被结 合 的 抗 原
,
、
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.
人 源化 例如
:
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嵌合抗 体 重组 单链抗
一 :
产生 补体依赖的细 胆毒性
① 鼠 人嵌合 抗 体
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小皿或大 鼠单抗可 变 区转入人抗体分子 中
②置换抗
体分子 中的 某个 片段
.
例如
,
将 与诊断和治疗作用 抗
它 由二 条轻链 与二
链 间或环 形折昼 ( 也 称 发 卡 结
一
构 ) 均 由二硫 键 ( 图 1 中
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一
者 ) 共价结合 而 相 连
.
,
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免疫 球蛋 白分子 结 构的稳定性 依靠氢键保持
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疫球蛋 白分子 含有一个可变 区 ( 简称 V 区 ) 和 3 ~ 4个 恒 定区 ( 简 称 c 区 ) 可 变 区 与恒定 区 都具有 一 定 功 能
C HI
、
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分 别命 名 为
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、
重 要作用 和 广 阔 的应 用前景 湿病
,
但是
、
,
目前用 于 治疗风
、
CH
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基因工程抗体
由一个仅识别一种抗原表位的B 细胞克隆产生的同源抗体，为单克隆抗体（McAb）。
其理化性状高度均一，抗原结合部位和同种型都相同，生物活性专一，特异性强，纯度高，有效抗体含量高，无效蛋白含量少，易于实验标准化和大量制备。
单克隆抗体在医学领域中有广泛的应用。
基因工程抗体(genetic engineering antibody)又称重组抗体，在充分认识Ig(immunoglobulin)的基因结构和功能基础上，应用DNA 重组和蛋白质工程技术，按人们的意愿在基因水平上对编码Ig分子基因进行切割、拼接与修饰等，并导入受体细胞，使之表达出新型抗体分子。
该抗体保留了天然抗体的特异性和主要生物学活性，减少或去除了无关结构，更接近人的Ig，第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特征。
当两个细胞紧密接触时候，其细胞膜可能融合在一起。
融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体(heterokaryon)，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞(hybid cell)，包括B 淋巴细胞杂交细胞和T淋巴细胞杂交细胞。
一、B淋巴细胞杂交瘤技术该技术中采用的两株细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
前者的主要特征是它的抗体分泌功能，但在体外不能长期生长；而后者则可在体外培养无限分裂增殖，二者杂交融合，形成在体外无限增殖分裂并产生McAb 的杂交瘤细胞。
其原理如下：（一）细胞的选择与融合融合细胞一方为经过抗原免疫的B 细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞；另一方则是具有永生性的肿瘤细胞，选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
浓度为40％(W／V)的聚乙二醇PEG1000~2000)是目前最常用的细胞融合剂。
（二）选择培养基的应用细胞融合是一个随机的物理过程。
经融合过程后细胞将有多种形式出现，须进行特别的筛选得到融合的脾细胞与瘤细胞。
HAT培养基应用原理：细胞的DNA合成一般有两条途径。
基因工程抗体
基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体【摘要摘要摘要摘要】：基因工程抗体以其独特的优点(免疫原性低、可按人的意愿加以改造等)正逐渐取代动物源性单抗。
随着基因工程和蛋白质工程等生物技术在抗体研制领域的广泛应用, 适应不同需要的基因工程抗体的种类日趋多样化, 构建日趋合理化, 在体内的生物学效应也日臻完善, 使之较天然单抗的治疗效果更好, 范围更广, 并在初步临床试用中展示了光辉的前景。
【关键词】：基因工程抗体生物技术【前言】：单抗作为一种有效的新型生物制剂促进了基础医学、临床医学、生物学、农学等众多生命学科的发展, 尤其在疾病的预防、诊断及治疗方面的作用日益重要。
然而作为体内的应用, 啮齿类动物单抗的高免疫原性, 使所有病人均发生不同程度的人抗鼠抗体反应(HAMA), 削弱了治疗的有效性, 并对清除抗体的器官产生毒性损害, 因此其应用严重受限。
为了创造出更理想的治疗用抗体分子, 将制备单抗的细胞工程技术与生产重组分子的基因工程技术和蛋白质工程技术相结合, 产生了基因工程抗体。
短短的几年研究使得这个领域的发展日新月异, 目前已成为抗体应用研究的热点。
但随着研究的深入进展, 也暴露出许多问题。
目前在以单抗为基础的临床治疗研究中, 面临五个最重要的问题及技术挑战:(1)使基因工程抗体具有与亲本抗体相一致的亲和力及特异性;(2)(2)克服人抗动物单抗及人抗任何与单抗相交联的细胞毒性物质的免疫反应;(3)(3)制备合适的细胞毒性物质;(4)(4)符合体内药物动力学及生物分布特性;(5)高产量, 低成本。
本文综述了近几年国内外学者为攻克这几个难题在基因工程抗体领域所做的努力及研究进展。
1.基因工程抗体概述基因工程抗体又称重组抗体, 是指利用重组DNA 及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配, 经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。
目前报道的基因工程抗体很多, 分类方法不一, 大体可以分为三类。
基因工程抗体
人鼠嵌合抗体的构建
可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达
人鼠嵌合抗体的构建
可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达
克隆可变区基因的方细胞的mRNA中扩 增VH及VL基因。
同一抗体的两个抗原结合部分分别针对两个不同 的抗原，在结构上是双价的，而与抗原结合的功能 是单价的。
－可介导标记物与靶抗原的结合 －使某种效应分子定位于靶细胞 －可提高抗体的某些生物学效应 －减少抗体的体内非特异性分布
增强抗体效应功能
细胞内抗体（intrabody）
在抗体基因的N端或C端加入引导序列使抗体表达定 位在亚细胞部位，如胞质、线粒体、内质网或细胞核 部位。在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体称为 细胞内抗体或内抗体。
IgG2、IgG4
人鼠嵌合抗体的构建
可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达
表达系统的选择
大肠杆菌、噬菌体 无糖基化功能
酵母菌 Asn-X-Ser/Thr 糖基化错误
哺乳动物细胞表达系统 最常用的表达体系
表 达 载 体 的 构 建
共转染模式和单载体转染模式
真核表达载体的要求
为保证PCR产物的准确性，应尽量采 用引导肽部分的引物。
克隆可变区基因常用的引物
克隆鼠κ轻链可变区所用的部分引物
克隆鼠重链可变区所用的部分引物
克隆可变区基因的操作流程
杂交瘤细胞
单链cDNA分离
RNA提取试剂盒
H链引导肽引物 /恒定区引物
L链引导肽引物/ 恒定区引物
制备总RNA
第一链cDNA合成试剂 盒
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
抗 原 表 位 导 向 选 择
《基因工程抗体》课件
通过基因工程技术改进抗体的稳定性、半衰期等特性，实 现抗体药物的长效化，减少给药频率，提高患者依从性。
基因工程抗体面临的挑战与机遇
免疫原性
基因工程抗体的免疫原性是一个重要问题，需要加强研究以降低免疫 原性，提高安全性。
生产成本
基因工程抗体的生产成本较高，需要进一步降低生产成本，提高可及 性。
《基因工程抗体》 PPT课件
目 录
• 基因工程抗体的概述 • 基因工程抗体的技术原理 • 基因工程抗体的应用实例 • 基因工程抗体的未来展望
CHAPTER 01基因工程Βιβλιοθήκη 体的概述基因工程抗体的定义
基因工程抗体是指利用基因工程技术，通过重组DNA或RNA技术制备的 抗体分子。
基因工程抗体可以针对特定抗原或抗体，通过体外基因操作和表达，获得 具有特定结构和功能的抗体分子。
基因工程抗体的制备流程
01
抗体基因的克隆
从免疫小鼠的脾细胞中提取抗体 基因，经过PCR扩增后，将目的 基因片段插入到载体分子中。
02
抗体基因的表达
03
抗体蛋白的纯化
将重组载体导入到宿主细胞中， 通过培养和筛选，获得能够表达 目标抗体的细胞株。
从表达抗体的细胞培养液中分离 出抗体蛋白，经过层析等手段进 行纯化。
监管政策
随着基因工程抗体的快速发展，监管政策也需要不断完善，以确保安 全性和有效性。
机遇
基因工程抗体在肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾病、感染性疾病等领域 具有广阔的应用前景，为患者提供更多治疗选择。
基因工程抗体的发展前景与展望
肿瘤免疫治疗
基因工程抗体在肿瘤免疫治疗 领域具有巨大潜力，未来将有 更多针对肿瘤相关抗原的抗体
治疗方案。
基因工程抗体讲义
VL
噬菌体抗体图示
抗体库的构建
抗体库的富集筛选
抗体库技术的应用
● 人源抗体的制备 ● 抗体性能的改良 ● 不经免疫制备抗体
四、抗体药物的临床应用
抗血清
单克隆抗体
基因工程抗体
破伤风抗血清
抗肿瘤 (鼠 , 人-鼠 )
抗肿瘤 , 自身免疫病
The rise of antibody-based therapeutics further illustrates the substantial change in the paradigms of pharmaceutical development, By utilizing the body's own capabilities as a source for a drug rather than the chemists reagents vessel.
表 已批准上市的治疗性单抗
2001
淋巴瘤
CD52
人源化抗体
Campath
2000
淋巴瘤
CD33
人源化抗体化疗药物交联物
Mylotarg
1998
移植排斥
兔多抗
Thymogloblin
1998
RSV感染
RSV F蛋白
人源化抗体
Synagis
1998
乳腺癌
HER-2
人源化抗体
Herceptin
1998 1999
基因工程抗体
通过基因重组改良抗体性能 通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体
Generating human antibodies which could never be obtained from the blood stream.
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特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性， 同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略
Pr 鼠VH 人 CH
启动子
Pr 鼠VL 人 CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
共转染细胞
抗体分泌细胞
鼠VH
鼠V L 人CL 人CH
人-鼠嵌合基因工程抗体
在嵌合抗体的基础上进一步将 鼠 MAb 可 变 区 中 相 对 保 守 的 FR(framework region) 替 换 成 人 的 FR ，保留与抗原结合部位决定簇互 补 区 （ complement determinant region)部位 (即CDR移植)
医学院免疫学研究所 王嘉宁
Paul Ehrlich , 1908, Emil von Behring, 1901, production of antitoxins antibody
Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody
移植排斥 心绞痛 B细胞非霍奇金淋巴瘤 移植排斥 移植排斥 婴儿呼吸道合胞病毒 类风湿关节炎 乳腺癌 急性复发性髓性白血病 难治性慢性淋巴细胞白血病 难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤
1986 1994 1997 1997 1998 1998 1998 1998 2000 2001 2002 5
一 抗体分子结构
H链表达载体
共转染细胞
Fv [二硫键稳定的Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)]小分子抗体的制备
抗体分泌细胞
VH
-S-S-
VL
disulfide-stabilized Fv, ds-Fv
Fv小分子抗体的制备
三、单域抗体
抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定， 因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只
免疫球蛋白的功能区
免疫球蛋白的水解片段
complimentarity determining region,
CDR
hypervarible region (HVR) (complimentarity determining region, CDR) : formation of the Ag binding site
实际意义
（1）预防、治疗感染性疾病， 如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风， 胎盘球蛋白 抗病毒感染等， 副作用： 超敏反应。 （2）临床诊断， 如：肥达氏反应 --- 伤寒、副伤寒， 缺点：特异性差。
2、单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）
由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗 原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。 特点：具有高度均一性。 杂交瘤细胞： 骨髓瘤细胞 --- 无限增殖； 免疫B细胞 --- 合成、分泌特异性抗体。 杂交瘤技术 --- HAT培养基：次黄嘌呤(H), 氨 基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。
1975年Kö hler and Milstein等首次利用B淋巴细胞 杂交瘤技术制备出单克隆抗体 (monoclonal antibody, MAb)。 1994年基因工程抗体。
1、多克隆抗体(polyclonal antibody; PcAb)
多价抗原
多个克隆 （致敏的B细胞）
多克隆抗体
在这些杂化抗体分子中，只有LH-GK配对的才 是所需的双功能抗体分子。
（2）化学交联法：Nisonoff和Rivers最早 从事这方面的研究。化学交联的方法无需 经过细胞融合，所以比较简便易行。 通常利用重链与轻链这间的二硫链经还 原和再氧化，将两种不同特异性抗体的半 分子结合在一起。或用双功能交联剂，如 邻苯酸酯等，把两个抗体半分子交联在一 起。
C区编码基因: CH (恒定区): Cμ, Cδ, Cγ等10个片段
Cμ
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V区编码基因: ---- V, J --- 40, 5 ---- V, J --- 30, 4 C区编码基因: C (1); C(4)
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二、细胞工程抗体和基因工程抗体
抗体技术的发展经历了三个阶段
第一代：多克隆抗血清
在Ig分子多肽 链中，κ型、λ 型轻链和Ig的 重链分别写作 Igκ、Igλ和IgH， 基因依次写作 IGK、IGL和 IGH，其分别 位于第2、22 和14号染色体 上。
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V区编码基因: VH (可变区) ----- 48 DH (多样性区) ----- 23 JH (连接区) ----- 6
antibody
antigen
antigen-antibody complex:
epitope
purple : HV CDR ( in both the ribbon and ball and stick views) green : antigen HV sequences contact the antigen.
肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的
结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为
超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimal
recognition unit, MRU)。
提高抗体效应功能
双特异性抗体 抗体融合蛋白
提高抗体 效应功能
细胞内抗体
偶连细胞毒物质
双特异性抗体
Fab
VH VL
CH1
-S-S-
包括嵌合抗体、单链抗体形式。
免疫粘附素(immunoadhension) ：将人抗体
恒定区(主要是Fc段)N-端连接于人细胞表面的受体
分子或细胞粘附分子上，在真核细胞中表达出正确
折叠的融合抗体蛋白分子，这种分子可同时发挥抗 体的效应功能及其它相应的效应功能，这种分子又 被称为新效能抗体。
单抗制备的流程图
实际意义：
（1）抗原的纯化和结构分析； （2）细胞发生、分化及功能的阐明； （3）临床疾病的诊断和治疗， 如：免疫分子检测； 免疫导向药物治疗恶性肿瘤 --- McAb抗癌药物(毒素或 放射核素偶联)。
多克隆抗体与单克隆抗体的比较
多克隆抗体 来源 动物免疫血清、恢复期病人血 清或免疫接种人群 特点 来源广泛、制备容易 组成 针对不同抗原表位的抗体的混 合物 单克隆抗体 多为鼠源性 纯度高、特异性强、效价高、少 或无血清交叉反应 针对单一表位，结构和组成高度 均一，抗原特异性及同种型一致
第二代：细胞工程抗体 第三代：基因工程抗体
1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素， 并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。
1937年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、 甲种（α）球蛋白、乙种（ β ）球蛋白、丙种（ γ ） 球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白 组分。
基 因 工 程 抗 体
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1 小分子抗体
基 因 工 程 改 造 的 抗 体
2
3 鼠单抗人源化
第一代的抗体人源化—嵌合抗体
从杂交瘤细胞分离出鼠 MAb 功能 性可变区基因，与人Ig恒定区（决定 免疫原性）基因连接，插入适当表达 载体，转染宿主细胞，表达人 - 鼠嵌 合抗体。嵌合抗体由于这两部分在空 间结构上相对独立，其独特的抗体亲 和力保持得很好，但因鼠单抗可变区 的存在，应用时仍有较强的免疫排斥 反应。
应用 疾病的被动免疫治疗
疾病诊断、特异性抗原或蛋白的 检测和鉴定、疾病的被动免疫治 疗和生物导向药物制备
缺点 特异性不高、易发生交叉反应， 人体应用后可导致人鼠抗体反应 不易大量制备
单抗体内应用和疗效受限原因：
1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性 2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量 甚少 3.生产成本高,难于普及应用
Pr VH CH1 Pr VL CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链表达载体
L链表达载体
共转染细胞
Fab 抗体分子的制备
抗体分泌细胞
VH CH1 VL CL
-S-S-
Fab 抗体分子的制备
II Fv antibody molecule
(1) ds-Fv
Pr VH Pr VL
分别构建载体
L链表达载体
人杂交瘤技术未获真正突破原因:融合率低、 建株难、不稳定、产量低、人体不能随意 免疫 新思路：尽量减少抗体中的鼠源成分，但又 尽量保留原有的抗体特异性。 基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基 因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白 基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细 胞进行表达，产生新型抗体，主要包括嵌 合抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体 融合蛋白和双特异性抗体。
它们分泌的是重链、轻链被杂化的抗体分子，有 10种形式： 重链、轻链都无改变，保持原特异性的配对抗 体分子： LH-HL，KG-GK 重链特异性相同的配对抗体分子： LH-HK，KH-HK KG-GL，LG-GL 重链、轻链特异性不同的配对抗体分子： LH-GK，LH-GL KH-GL，KH-GK
Gerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibody
Susumu Tonegama ,1987, structure of Ig gene
Nobel Prize winners
免疫球蛋白的功能
Orthoclone ReoPro Rituxan Zenapax Simulect Synagis Remicade Herceptin Mylotarg Campath-1H Zevalin
抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，
所形成的具有新的特性融合蛋白。 根据构建方式的不同，主要分为两种形式： Fc融合蛋白（Fc fusion protein,FcFP）由抗体的Fc 段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。