基因诊断与基因治疗

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引物设计应符合以下基本原则： 引物设计应符合以下基本原则：
长度适宜，一般为15∼ 个碱基 个碱基； ① 长度适宜，一般为 ∼30个碱基； 含量， ② G+C含量，一般为 ％∼60％； 含量 一般为40％ ％； 种碱基应随机性分布； ③ 4种碱基应随机性分布； 种碱基应随机性分布 引物自身不应存在互补序列； ④ 引物自身不应存在互补序列； 两个引物之间不应有多于4个碱基的互补 个碱基的互补； ⑤ 两个引物之间不应有多于 个碱基的互补； 引物3ˊ端不应有任何修饰； ⑥ 引物 ˊ端不应有任何修饰； 引物5ˊ可以修饰。 ⑦ 引物 ˊ可以修饰。
固 相 支 持 物
B
本法优点： 本法优点：
16 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。
situ） （6）原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交， 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交， 进而检测特异的DNA RNA序列 DNA或 序列。 进而检测特异的DNA或RNA序列。 有 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 三类杂交
按照上述步骤重复操作， 产物呈指数扩增。 按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。 产物呈指数扩增 模板DNA 扩增倍数 扩增倍数T=2n (n: 循环次数)。 模板 。
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PCR技术原理示意图 PCR技术原理示意图
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2.
PCR各要素及其作用 PCR各要素及其作用
PCR模板可以是DNA或RNA。 PCR模板可以是DNA或RNA。 模板可以是DNA
（其基本过程类似于上述Southern法） 其基本过程类似于上述Southern法 Southern
提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→ 提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→ RNA样本 变性 转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→ 转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影 DNA 或显色→检测信号。 或显色→检测信号。 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA 法可用于检测组织细胞中总RNA
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（3）斑点杂交或狭缝杂交法： 斑点杂交或狭缝杂交法：
基本过程： 基本过程： 将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→ 将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→ DNA 直接点到固相支持滤膜上 用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→ 用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂 交信号→分析结果。 交信号→分析结果。 优点： 优点： 简便、快速、灵敏、样本用量少； 简便、快速、灵敏、样本用量少； 缺点： 缺点： 特异性不高，有一定比例的假阳性。 特异性不高，有一定比例的假阳性。
• DNA:DNA
hybridization 5’ A T G C C G A T 3’ T A C G G C 5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U 5’ A U G C U A C G 3’ U A C G A U G C
DNA:RNA
RNA:RNA
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利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理 原理， 利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理， 碱基互补 可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针 用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针， 可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待 测样本中的单链核酸互补配对， 测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同 源核酸序列的存在。 源核酸序列的存在。 核酸探针 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与 或 片断， 是指带有标记的某一特定 片断 待测样本中单链核酸分子互补配对结合， 待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同 源序列。 源序列。 探针标记物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、 放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、 荧光素等）两大类。 荧光素等）两大类。 8
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（1）DNA模板的变性 DNA模板的变性 模板的
将待扩增DNA加热到95 左右，使双链DNA DNA解开成 将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成 DNA加热到
使模板DNA或延伸后的双链DNA DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 ），
PCR技术在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用耐热 技术在模板、dNTP、 等条件下， 技术在模板 Taq酶代替DNA聚合酶 用合成的DNA引物代替RNA 酶代替DNA聚合酶， DNA引物代替RNA引 的Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引 经过DNA变性、引物与模板结合 复性）和延伸3 DNA变性 模板结合（ 物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3 个步骤的循环过程（25∼30个循环），目的DNA可 个循环），目的DNA 个步骤的循环过程（25∼30个循环），目的DNA可扩增 100万倍以上 万倍以上。 100万倍以上。
基因诊断与基因治疗
(gene diagnosis and therapy)
本章讨论二大方面内容
基因诊断 基因治疗
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第一节
一.
源自文库基 因 诊 断
基因诊断概念 基因诊断概念 ：
利用现代分子生物学和分子遗传学 的技术方法， 的技术方法，直接检测基因结构及其表 达水平是否异常， 达水平是否异常，从而对疾病作出诊断 的方法。 的方法。
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（4）菌落杂交（colony
hybridization） hybridization）
该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。
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hybridization） （5）夹心杂交法（sanwich hybridization） RE
A A A
片断A 片断 检测探针
RE
B B
片段B捕捉探针 片段 捕捉探针
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(1)
Southern 印迹杂交法 （Southern blotting ）
限制性内切酶酶切 检测杂交信号 提取DNA 提取DNA Southern 法可用于检测特异的 法可用于检测特异的DNA序列片断、 序列片断、 序列片断 12 基因定位、分子量测定等。 基因定位、分子量测定等。
（2）Northern 印迹杂交法 （Northern blotting ）
DNA-DNA DNARNARNA-DNA RNARNA-RNA 该法优点： 该法优点： 不需提取核酸， 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的 形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。 形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态17 。
（二）聚合酶链反应(PCR，polymerase chain 聚合酶链反应 ， reaction)技术 技术
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基因诊断特点 特点： 二. 基因诊断特点：
针对性强， 针对性强，特异性高 检测灵敏度和精确性高 实用性强， 实用性强，诊断范围广
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三.
基因诊断常用技术方法
核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（PCR）技术 聚合酶链反应（PCR） 生物芯片 基因测序
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（一）核酸分子杂交技术
核酸分子杂交 是指单链核酸分子（ 是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下， 或 ）在特定条件下， 与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。 与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。 主要依据： 碱基互补、 主要依据： 碱基互补、变性和复性 碱基互补 变性： 变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 复性： 随温度逐渐恢复， 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链 6 DNA与DNA杂交 A=T、 DNA与DNA杂交： A=T、 G≡C ; 杂交： DNA与RNA杂交 A=U、 G≡C ; 与 杂交: 杂交 、
（1） 模板 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为10 个拷贝； 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102∼105个拷贝； DNA模板为佳 RNA作为模板时，需要： RNA作为模板时，需要： 作为模板时 RNA
逆转录
cDNA
PCR, 称此为RT-PCR. 称此为RT PCR. RT-
DNA聚合酶 聚合酶) （2）耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 耐热DNA聚合酶( DNA聚合酶
并游离于反应体系中作为模板； 并游离于反应体系中作为模板；
（2）模板与引物的结合（退火或复性） 模板与引物的结合（退火或复性）
将体系温度降至合适温度（ 左右） 将体系温度降至合适温度 （ 550C 左右 ） ， 使加入 的引物与模板DNA两端 碱基序列互补结合。 的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。 DNA两端（
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（3）引物 引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区 引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区 DNA 两端而设计的一对寡核苷酸小片断， 两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一 般为15∼30个碱基。 般为15∼30个碱基。 15 个碱基 引物是保证PCR扩增产物的大小和特异性 引物是保证PCR扩增产物的大小和特异性 保证PCR 的关键因素，其设计与合成对PCR的成功至关 的关键因素，其设计与合成对PCR的成功至关 PCR 重要。 重要。 引物设计原则如下： 引物设计原则如下：
PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制的 PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制的 是体外基因扩增技术 DNA 原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA的大量 原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA的大量 扩增。 扩增。
1.
PCR基本原理： PCR基本原理： 基本原理
由于加入的引物量远多于模板量， （由于加入的引物量远多于模板量，所以引物与模板的结合比 例远大于模板自身的复性） 例远大于模板自身的复性）；
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（3）引物延伸 引物延伸
将体系温度升到72 左右，Taq聚合酶催化 聚合酶催化dNTP 将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP 按碱基互补原则连接在DNA 引物 使引物延伸， 按碱基互补原则连接在 DNA引物 3ˊ 端 ， 使引物延伸 ， DNA 引物3 形成两条与模板互补的新链。 形成两条与模板互补的新链。 以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸） 以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸） PCR循环 （新合成的链可作为下一轮循环的模板） 新合成的链可作为下一轮循环的模板）
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2.核酸分子杂交（固相杂交） 2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序 核酸分子杂交
制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化DNA片段 分离、变性、转移、固化 片段 预杂交 制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针 检测杂交信号
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3. 常用固相核酸杂交方法
印迹杂交法（ Southern 印迹杂交法（Southern blotting ） 印迹杂交法（ Northern 印迹杂交法（Northern blotting ） 斑点杂交或狭缝杂交法 hybridization） （Spot/ Slot blot hybridization） 菌落杂交（ hybridization） 菌落杂交（colony hybridization） 夹心杂交法（ hybridization） 夹心杂交法（sanwich hybridization） 原位杂交（ situ） 原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）
1.核酸分子杂交的分类 1.核酸分子杂交的分类
液相杂交： 液相杂交： 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中 进行杂交反应； 进行杂交反应； 固相杂交： 固相杂交： 待测核酸样本先结合到固相支持物上， 待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶 液中的特异性探针进行杂交反应。 液中的特异性探针进行杂交反应。 常用固相杂交支持物： 常用固相杂交支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－ 硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－
是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶， 可在 聚合酶， 是从耐热细菌体内提取的一种 聚合酶 95℃稳定 分钟。从而保证 分钟。 ℃稳定30分钟 从而保证PCR在[94℃变性→ 55℃退 在 94℃变性→ ℃ 71℃延伸]循环30次过程中不变性失活 次过程中不变性失活。 火→71℃延伸]循环 次过程中不变性失活。 聚合酶应用最广泛。 在PCR中，Taq DNA聚合酶应用最广泛。 中 聚合酶应用最广泛