基因工程载体和受体
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
✓R因子在细胞内的拷贝数：从1~2个到几十个，分为严紧型和松 弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达2000~3000个/细 胞。
R因子（resistance factor）
✓最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现 还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和 Staphylococcus中。
✓R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子 （resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（rdeterminant）。RTF为分子量约为11×106 Dalton，控制质粒拷 贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106 Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。
（3）质粒的可转移性
据此，革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： ✓接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F质粒。 ✓非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R质粒的一些成员。
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质 粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。
粒组成不相容性群。
以大肠杆菌的质粒为例： ✓ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容； ✓pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容； ✓p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容。
通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传 单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定 复制的方式，如滚环复制和 θ 复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。
4.载体的种类
• 质粒（plasmid） • 噬菌体或病毒DNA • 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 • 人造染色体载体
（一）质粒（plasmid） 1.质粒的定义
质粒是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制，并被稳 定遗传的一类核酸分子。
质粒常见于原核细菌和真菌中。 绝大多数的质粒是DNA型的。 绝大多数质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）。 质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb。 功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮 、产生酶类、降解功能等。
2.质粒的基本特征
（1）质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。
根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为 两大复制类型：
✓严紧型复制控制的质粒：1 - 3 拷贝 stringent plasmid
✓松弛型复制控制的质粒：10 - 60 拷贝 relaxed plasmid
质粒不相容的分子机制
两种含有不同复制子结构的质粒，在复制时受各自的拷贝数 控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此经过 若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。
两种含有相似复制子结构的质粒，在复制时受同一种拷贝数 控制系统的控制而产生竞争，致使两种质粒的最终拷贝数不同 。其中，拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势， 并逐步将另一质粒“稀释”淘汰。
（4）携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
✓物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 ✓物质合成：细菌毒素、有机碱
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。
3.几种代表性质粒
F–因子（fertility factor）：又称致育因子或性因子，62×106 Dalton，94.5 kb，相当于核染色体DNA大小的2%，环状双链 DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与 接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、 奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。
Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carriesBiblioteka Baiduthe genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes.
但这种对应关系不是绝对的，若细胞生长环境中存在蛋白质合成抑制剂（氯霉 素、壮观霉素等）时，细胞的染色体DNA的复制受阻，而质粒仍可扩增，使其 数量可达数千拷贝。
（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质
一、用于基因克隆的载体
1.载体的概念
（1）携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 （2）能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞， 具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩 增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 （3）实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞。
2.载体的功能（function of vector）
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
3.载体应具备的条件（characteristics of vector）
可转移性：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。 具有与受体细胞相适应的复制位点（ori，origin of replication）或 整合位点 。 具有较高的外源DNA的装载能力。 多克隆位点（multiple cloning site, MCS）：具有多种限制性内切 酶的单一切点 。 具有合适的筛选标记（selection marker）。 安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其 他生物细胞中。
R因子（resistance factor）
✓最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现 还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和 Staphylococcus中。
✓R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子 （resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（rdeterminant）。RTF为分子量约为11×106 Dalton，控制质粒拷 贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106 Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。
（3）质粒的可转移性
据此，革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： ✓接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F质粒。 ✓非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R质粒的一些成员。
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质 粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。
粒组成不相容性群。
以大肠杆菌的质粒为例： ✓ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容； ✓pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容； ✓p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容。
通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传 单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定 复制的方式，如滚环复制和 θ 复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。
4.载体的种类
• 质粒（plasmid） • 噬菌体或病毒DNA • 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 • 人造染色体载体
（一）质粒（plasmid） 1.质粒的定义
质粒是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制，并被稳 定遗传的一类核酸分子。
质粒常见于原核细菌和真菌中。 绝大多数的质粒是DNA型的。 绝大多数质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）。 质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb。 功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮 、产生酶类、降解功能等。
2.质粒的基本特征
（1）质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。
根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为 两大复制类型：
✓严紧型复制控制的质粒：1 - 3 拷贝 stringent plasmid
✓松弛型复制控制的质粒：10 - 60 拷贝 relaxed plasmid
质粒不相容的分子机制
两种含有不同复制子结构的质粒，在复制时受各自的拷贝数 控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此经过 若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。
两种含有相似复制子结构的质粒，在复制时受同一种拷贝数 控制系统的控制而产生竞争，致使两种质粒的最终拷贝数不同 。其中，拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势， 并逐步将另一质粒“稀释”淘汰。
（4）携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
✓物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 ✓物质合成：细菌毒素、有机碱
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。
3.几种代表性质粒
F–因子（fertility factor）：又称致育因子或性因子，62×106 Dalton，94.5 kb，相当于核染色体DNA大小的2%，环状双链 DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与 接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、 奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。
Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carriesBiblioteka Baiduthe genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes.
但这种对应关系不是绝对的，若细胞生长环境中存在蛋白质合成抑制剂（氯霉 素、壮观霉素等）时，细胞的染色体DNA的复制受阻，而质粒仍可扩增，使其 数量可达数千拷贝。
（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质
一、用于基因克隆的载体
1.载体的概念
（1）携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 （2）能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞， 具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩 增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 （3）实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞。
2.载体的功能（function of vector）
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
3.载体应具备的条件（characteristics of vector）
可转移性：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。 具有与受体细胞相适应的复制位点（ori，origin of replication）或 整合位点 。 具有较高的外源DNA的装载能力。 多克隆位点（multiple cloning site, MCS）：具有多种限制性内切 酶的单一切点 。 具有合适的筛选标记（selection marker）。 安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其 他生物细胞中。