第05章-代谢物酶法分析技术
【高中生物】必修一第五章第1节《降低化学反应活化能的酶-一酶的作用和本质》教案
第五章第1节降低化学反应活化能的酶一、酶的作用和本质一、教材分析新陈代谢是生物体进行一切生命活动的基础，而新陈代谢的进行又离不开酶的催化作用，因此，了解酶的作用和本质，为理解细胞中复杂的生命活动的顺利进行奠定了基础。
本节内容还与选修模块的相关内容有着内在联系。
例如，选修模块中有关酶的应用等，都是以“酶与代谢”部分的相关内容为基础的。
此外，学生通过有关酶的的探究性学习活动获得的技能，对进一步学习生物技术实践等知识起到保证作用。
二、教学目标1. 知识目标（1）、说明酶在细胞代谢中的作用、本质。
（2）、阐述细胞代谢的概念2. 能力目标（1）、通过自主学习，培养学生推理、比较、分析、归纳总结的能力。
（2）、通过有关的实验和探究，学会控制自变量，观察和检测因变量的变化，以及设置对照组和重复实验。
（3）、在有关实验、资料分析、思考与讨论、探究等的问题讨论中，提高运用语言表达的能力以及分享信息的能力。
3. 情感态度与价值观目标（1）、通过阅读分析“关于酶本质的探索”的资料，认同科学是在不断的观察、实验、探索和争论中前进的，。
认同科学家不仅要继承前人的科研成果，而且要善于吸收不同意见中的合理成分，还要具有质疑、创新和勇于实践的科学精神和态度。
（2）、通过小组间的讨论、合作与交流，培养学生的合作互助精神。
（3）、通过让学生了解酶的发现过程，使学生体会实验在生物学研究中的作用和地位；通过讨论酶在生产、生活中的应用，使学生认识到生物科学技术与社会生产、生活的关系。
三、教学重点和难点1、教学重点：酶的作用、本质2、教学难点：酶降低化学反应活化能的原理四、学情分析学生通过初三、高一阶段化学的学习，对于纯化学反应已比较熟悉，但是对于细胞内部的化学反应及生物催化剂──酶的认识有限。
工业制氨的化学反应是在高温高压并且催化剂作用下进行的，细胞内部却是常温常压的温和状态，而细胞代谢包括一系列的化学反应，这些化学反应的进行应该有生物催化剂──酶的参与，才能使其高效有序的进行，由此从学生熟悉的知识引入对酶相关知识的学习。
微生物学第五章微生物的代谢
通过改变细胞膜的通透性，控制代谢底物和产物的进出，从而调 节代谢过程。
微生物代谢的基因调控
01
原核生物的基因调 控
通过操纵子模型实现基因表达的 调控，包括正调控和负调控两种 方式。
02
真核生物的基因调 控
通过转录因子和顺式作用元件的 相互作用，实现基因表达的精确 调控。
03
基因表达的诱导和 阻遏
03 氮的转化代谢
微生物还可以通过氮的转化代谢将一种含氮化合 物转化成另一种含氮化合物，如硝酸盐还原成氨 的过程。
04Βιβλιοθήκη 微生物代谢的调节与控制代谢调节的方式与机制
酶活性的调节
通过改变酶的构象或修饰酶活性中心，从而调节代谢途径中关键 酶的活性。
代谢物浓度的调节
代谢物浓度的变化可以影响酶的活性，从而调节代谢速率。
用、液相色谱-质谱联用等。
核磁共振法
利用核磁共振技术对微生物代 谢产物进行结构和构象分析， 可以获得代谢产物的详细化学
信息。
生物信息学分析
利用生物信息学方法对微生物 代谢组学数据进行处理和分析， 包括代谢途径分析、代谢网络 构建、代谢物鉴定和代谢调控 研究等。
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微生物代谢产物的生物活性与应用
抗生素
由微生物代谢产生的具有抗菌活 性的化合物，用于治疗细菌感染。
酶
微生物代谢产生的生物催化剂，广 泛应用于食品、医药、化工等领域。
激素
某些微生物代谢产物具有激素活性， 可用于调节动植物生长发育。
微生物代谢在环境保护和能源领域的应用
污水处理
利用微生物代谢降解污水中的有机污染物，净化水质。
02
微生物的能量代谢
能量代谢的基本过程
细胞内代谢物的检测与分析技术
细胞内代谢物的检测与分析技术细胞内代谢物的检测与分析技术是一项关键性的研究领域，它对于深入理解细胞代谢过程以及相关疾病的发生机制具有重要意义。
在过去的几十年里，科学家们借助于先进的分析技术，不断开发出各种应用于细胞内代谢物检测与分析的方法，包括色谱-质谱联用技术、核磁共振技术、质谱成像技术、光谱学等。
在本文中，我将简要介绍一些常用的细胞内代谢物检测与分析技术及其应用。
一、色谱-质谱联用技术色谱-质谱联用技术是一种常用的细胞内代谢物分析方法。
它结合了色谱技术的分离能力和质谱技术的结构鉴定能力，能够对细胞内代谢物进行高效准确的分析。
常用的色谱-质谱联用技术包括气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）和液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）等。
例如，科学家可以利用GC-MS技术对细胞内氨基酸、脂质等进行定性和定量分析，通过对色谱峰的检测和质谱图的解析，确定代谢物的结构和浓度。
另外，LC-MS技术可以更加精确地分析小分子代谢产物，比如核苷酸、脂肪酸等。
色谱-质谱联用技术在生物医学研究、药物开发等方面发挥着重要作用。
二、核磁共振技术核磁共振技术（NMR）是一种基于原子核在磁场中共振吸收和发射辐射的原理，对于测量和分析细胞内代谢物具有独特的优势。
相对于质谱技术来说，NMR技术可以避免样品的毁灭性处理，并能够进行非破坏性的分析，保留了样品的完整性。
NMR技术可以用于测定代谢物的结构、浓度、代谢通路等信息。
科学家们可以通过对代谢物的核磁共振谱进行解析，确定化学环境和相互作用，从而更好地了解细胞内代谢过程。
三、质谱成像技术质谱成像技术（MSI）是一种能够在细胞和组织水平上分析分子信息的方法。
它结合了质谱分析的高灵敏度和成像技术的高空间分辨能力，可以直接将细胞内代谢产物映射到组织切片上。
利用质谱成像技术，科学家可以对代谢物的空间分布进行定量分析，从而研究代谢物在细胞内以及组织之间的传递和转化动态。
这一技术在癌症代谢研究、药物代谢动力学等领域具有广阔的应用前景。
代谢物酶法分析技术
采用统计学、机器学习等方法对处理后的数据进行深入分析，挖 掘代谢物与生物体生理状态之间的关联。
结果可视化
将分析结果以图表、图像等形式进行可视化展示，便于理解和解 释。
03
代谢物酶法分析技
术实验设计
实验材料准备
酶
选择特异性针对目标代谢物的酶，确 保酶的纯度和活性。
底物
准备目标代谢物的标准品和待测样品， 确保样品的纯度和浓度。
酶与底物的结合
酶具有特异性，能够与特定的底物结合形成酶底物复合物，从而引发催化反应。
3
酶催化反应的动力学
酶催化反应遵循米氏方程，反应速率受底物浓度、 酶浓度、温度、pH等因素的影响。
代谢物检测原理
代谢物的提取与纯化
从生物样本中提取代谢物，并通过适当的纯化方法去除干扰物质， 提高检测的准确性和灵敏度。
06
代谢物酶法分析技
术未来发展趋势
技术创新方向
高通量分析技术
随着生物技术的发展，未来代谢物酶法分析技术将更加注 重高通量、高灵敏度和高准确性的分析方法开发，以满足 大规模样本分析的需求。
多组学整合分析
代谢物酶法分析技术将与基因组学、蛋白质组学等多组学 技术进行整合，以全面解析生物体的代谢调控网络。
结果解读
结合实验目的和背景知识，对实验结果进行解读和分析，探讨代谢 物与酶活性之间的关系以及可能的影响因素。
04
代谢物酶法分析技
术应用实例
生物医学领域应用
疾病诊断
通过对体液（如血液、 尿液）中特定代谢物的 酶法分析，可以辅助诊 断某些疾病，如糖尿病、 肝病等。
药物研发
利用代谢物酶法分析技 术，可以研究药物在体 内的代谢途径和代谢产 物，为新药研发提供重 要依据。
代谢物酶法分析技术
代谢物酶法分析技术代谢物酶法分析技术的基本原理是利用目标代谢物与特定酶之间的底物-酶-产物反应，通过测定底物的消耗或产物的生成来间接地推测出代谢物的浓度。
通常来说，该方法需要有一个特异性高、反应速率快且稳定的酶作为标志物，该酶只与特定的代谢物发生催化反应。
1.选择合适的酶和底物：酶的选择应取决于需要分析的代谢物。
确保所选的酶对分析样品中的干扰物不敏感，并且酶底物与其他代谢物之间没有交叉反应。
2.校准测定：为了确定测定所需的最佳反应条件，可以通过在不同酶底物浓度下进行一系列试验来建立标准曲线。
标准曲线可以反映酶催化反应速率与底物浓度之间的关系。
3.准备样品：根据需要，对样品进行前处理，如去除干扰物或质量校正。
4.反应体系：将样品与合适的酶底物混合，在适当的反应条件下孵育一定时间，以使酶反应发生。
这个反应体系可以是液体相或固相。
5.检测和测量：将反应体系中的代谢物与其他物质分离，并使用合适的测量仪器和方法测定其浓度。
常用的测量方法包括：比色法、荧光法、放射性测量法等。
1.高灵敏度：代谢物酶法具有高灵敏度，能够检测到非常低浓度的代谢物。
2.特异性：选择特异性酶和底物可以避免其他代谢物的干扰。
3.快速：酶催化反应速率快，在短时间内可以得到准确的测量结果。
4.稳定性：酶底物具有较高的稳定性，可以长时间保存并重复使用。
代谢物酶法分析技术的应用非常广泛。
在医学领域，代谢物酶法可以用于检测血液中的生化指标，如葡萄糖、胆固醇等，用于疾病的早期诊断和监测。
在食品科学领域，代谢物酶法可以用于检测食品中的营养成分，如脂肪、蛋白质等，用于食品质量的评估和控制。
此外，代谢物酶法还可以用于监测环境污染物和化学物质的代谢产物，用于环境和毒理学研究。
总之，代谢物酶法分析技术是一种快速、灵敏、特异性高的代谢物测定方法，具有广泛的应用前景。
通过选择合适的酶和底物，并采取适当的测量方法，可以有效地分析各种生物体中的代谢物。
《酶法分析》课件
酶的分类和特性
酶的分类
酶的种类：包括氧化还原酶、 转移酶、水解酶、裂合酶、异 构酶等
酶的活性：受温度、pH值、离 子强度等因素影响
酶的来源：包括动物、植物、 微生物等
酶的稳定性：受温度、pH值、 离子强度等因素影响
酶的特性
酶是一种生物催化剂，可以加速化 学反应的速度
酶的活性受温度、pH值、离子强 度等因素的影响
法
酶法分析的应 用领域广泛， 包括食品、医 药、环境等领
域
酶法分析的发 展趋势是向着 自动化、微型 化、高通量方
向发展
酶法分析的未 来前景广阔， 有望在更多领
域得到应用
对未来发展的展望
酶法分析技术在生物医学领域的应用前景 酶法分析技术在环境监测领域的应用前景 酶法分析技术在食品检测领域的应用前景 酶法分析技术在工业生产领域的应用前景
酶法分析在生物体内的应用实例：例如，酶法分析可以用于检测血液中的葡萄糖、血脂、胆固醇等 物质，也可以用于检测尿液中的蛋白质、尿素、肌酐等物质。
酶法分析在生物体内的发展趋势：随着生物技术的不断发展，酶法分析在生物体内的应用将会越来 越广泛，越来越深入，为疾病的诊断和治疗提供更加准确、快速的信息。
食品分析中的酶法分析
《酶法分析》PPT课件
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目录
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01
酶法分析的实验技术 和方法
04
酶法分析概述
02
酶的分类和特性
03
酶法分析的应用实例
05
酶法分析的优缺点和 未来发展前景
06
添加章节标题
酶法分析概述
酶法分析的定义和原理
酶法分析：利用酶的生物催化作用，对样品进行定性、定量分析的方法
医学检验主管检验师资格考试复习资料生物化学(12)血清酶催化活性浓度和代谢物浓度酶法检测技术
医学检验主管检验师资格考试复习资料生物化学（12）血清酶催化活性浓度和代谢物浓度酶法检测技术一、酶活性的定义及单位酶活性指酶催化反应的能力即酶促反应速度。
表示常用国际单位。
1min能转化1微摩尔底物（μmol）的酶量为一个国际单位（μmol／min）。
用SI制表示的酶活性单位为Katal（催量）。
每秒钟转化1个摩尔底物的酶量为1Katal（mol/sec）常用单位为μKatal或nKatal。
国际单位和Katal间关系为：1U＝1μmol／min＝16.67nmol／s＝16.67nKatal1.连续监测法中酶活性浓度的计算：连续检测法指的是在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。
连续监测法优点之一是计算方便，不需作标准曲线或标准管，用分光光度计监测酶反应过程时，很容易求出反应体系中每分钟吸光度变化，根据摩尔吸光系数可求出△A。
ε为微摩尔（线性）吸光体系△A为吸光度变化ν为标本体积（ml）V为反应体系体积（ml）L为光径（cm）后面几项皆为常数，叫做酶活力浓度测定转化因子：2.常数K值设置应是测定酶的判断值或参考值上限，应保证这些值测定的可靠。
3.临床酶催化活性浓度测定的校准由于临床酶催化活性浓度测定受测定方法和条件的影响，国际医学检验量值溯源委员会推荐了常用酶测定的参考方法，采用与仪器和试剂相配套的有溯源校准的校正测定系统，是发展趋势。
二、测定酶活性浓度的两大类方法（一）固定时间法（取样法）先让酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，然后停止酶反应，加人试剂进入化学反应呈色测出底物和产物的变化。
用这类方法测酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则将引起较大误差。
该法最基本的一点是停止反应后才测定底物或产物的变化。
（二）连续监测法连续监测法具有众多的优点，随着科学技术的发展，自动生化仪的使用，正在逐步取代“固定时间法”。
《酶学分析技术》课件
04 酶学分析技术的应用实例
在生物工程领域的应用
通过酶学分析技术，可以深入了解生物分子的 结构和功能，为生物工程领域的研究提供有力
支持。
在生物工程领域中，酶学分析技术对于新药研发、疫 苗生产、生物制品质量控制等方面也具有重要意义。
酶学分析技术在生物工程领域中有着广泛的应 用，如蛋白质组学研究、基因表达分析、代谢 组学研究等。
《酶学分析技术》PPT课件
目录
• 酶学分析技术概述 • 酶的分类与特性 • 酶学分析技术的基本原理 • 酶学分析技术的应用实例 • 酶学分析技术的未来展望
01 酶学分析技术概述
酶学分析技术的定义与特点
总结词
酶学分析技术是一种利用酶的催化特性进行物质检测和分析的方法，具有高特异性、高灵敏度和高选择性等特点 。
详细描述
通过改进酶的提取和纯化技术、酶的固定化 技术、酶反应动力学研究等手段，可以提高 酶学分析技术的准确性和灵敏度。同时，创 新性的酶学分析方法和技术也将不断涌现， 例如酶联免疫分析、酶传感器、酶反应动力
学分析等。
酶学分析技术在其他领域的应用拓展
总结词
随着酶学分析技术的不断发展和完善，其应用领域将 不断拓展，为其他领域的发展提供有力支持。
详细描述
酶学分析技术是利用酶的生物催化作用，通过测量反应产物或底物浓度变化来推算酶活性或酶含量的技术。由于 酶具有高特异性、高灵敏度和高选择性等优点，因此酶学分析技术在生物、医学、农业、工业等领域具有广泛的 应用价值。
酶学分析技术的应用领域
总结词
酶学分析技术广泛应用于生物、医学、农业、工业等领域，如临床生化检验、食品安全 检测、环境保护等。
详细描述
酶学分析技术不仅在生物工程、制药、环保等领域有 广泛应用，还可以应用于食品安全检测、农业残留检 测、生物安全等领域。随着技术的进步和应用需求的 增加，酶学分析技术的应用领域将进一步扩大。
第05章第四节生物样品分析方法的基本要求
第四节
Hale Waihona Puke 生物样品分析方法的 基本要求
二、样品的储存
血浆和血清都必须在采血后即时分离。否则，血凝 后冰冻保存，则因冰冻时引起细胞溶解，而阻碍血浆 或血清的分出，同时因溶血而影响药物浓度变化。 冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1~2d)
冷冻—冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃) 中长期保存
尿样宜立即测定，否则应加入防腐剂或低温冷藏。
四、简述容量分析法的特点及计算公式？
五、紫外吸收光谱有什么特征？哪些特征和常数可作为 鉴定药物的定性定量指标？
思考题
六、简述紫外分光光度法在药品质量标准中的应 用。 七、简述HPLC法中系统适用性试验的意义与内容。 八、HPLC法定量的分析方法哪些？各人何特点？ 九、药物分析方法的选择原则？比较几种定量分 析方法的特点并指出适用范围。 十、简述准确度与精确度的定义以及它们之间的 关系？ 十一、什么叫有效数字？如何正确运用有效数字 的运算规则来表示分析结果？
加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一 定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用
第四节
(二)
生物样品分析方法的 基本要求
缀合物的水解
尿中药物多呈缀合状态。一些含-OH，COOH，-NH3，-SH的药物可与内源性物质葡 萄糖酸或硫酸形成葡糖酸苷或硫酸缀合物。
1）酸水解 2）酶水解
第四节
(三) 有机破坏
生物样品分析方法的 基本要求
习
题
十六、取维生素B2 20片,精密称得重量为 1.6011g，研细，精密称取片粉0.1518g， 置于１000ml量瓶中，溶解．于444nm波 长处测得吸收度为0.312,按C17H20N4O6的 吸光系数为323计算。求维生素Ｂ２的标 示百分含量（标示量５mg/ 片）．(101.9%)。
代谢物酶法分析技术
代谢物酶法分析技术
代谢物酶法分析技术是一种用于研究生物体内代谢物的方法。
代谢物是生物体内产生的化学物质，包括代谢产物、药物代谢物等。
代谢物酶法分析技术通过测定代谢物与特定酶的反应产物来分析代谢物的含量、产量和代谢途径等，从而揭示生物代谢过程的机理和变化。
1.色谱法：色谱法是一种将混合物中的化学成分按照它们在固体或液体的固定相上的不同亲和性进行分离的技术。
在代谢物酶分析中，常用的色谱法有气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。
这些方法可以用于分离和定量分析代谢物的结构和浓度。
2.质谱法：质谱法是一种用于分析物质的质量和结构的方法。
在代谢物酶法分析中，常用的质谱法有质谱-质谱（MS-MS）联用技术。
这种方法可以用于快速、敏感地检测和定量代谢物的含量和代谢途径。
3.光谱法：光谱法是一种使用光线与物质相互作用并产生特定光谱的技术。
在代谢物酶法分析中，常用的光谱法有紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）和荧光光谱法等。
这些方法可以用于分析代谢物的结构、浓度和代谢动力学等。
4.电化学法：电化学法是一种利用电化学技术对化学反应进行研究的方法。
在代谢物酶法分析中，常用的电化学法有电化学检测法（EC）和电化学发光法（ECL）。
这些方法可以用于测定代谢物与特定酶的反应产物的电化学信号，并根据信号的强度来分析代谢物的含量和代谢途径等。
总的来说，代谢物酶法分析技术是一种重要的研究生物代谢过程的方法。
通过选择合适的分析技术，可以对代谢物的结构、浓度和代谢途径等
进行定量和定性分析，从而加深对生物代谢过程的理解，并为药物研发和生物医学研究提供重要的支持。
代谢物的鉴定与分析方法
代谢物的鉴定与分析方法代谢物的鉴定与分析方法是一种用于确定生物体内产生的化合物的技术。
代谢物是生物体在代谢过程中产生的化合物，可以提供有关生物体健康状态、代谢途径和相关疾病的信息。
代谢物分析的目的是识别和测量这些化合物，并研究它们在生物体中的功能和作用机制。
以下是常用的几种代谢物的鉴定与分析方法。
1. 质谱分析法（Mass Spectrometry, MS）：质谱分析是一种高灵敏度的分析技术，可以确定和测量化合物的分子量和结构。
代谢物通常通过气相色谱-质谱（Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）或液相色谱-质谱（Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）分析。
这些方法可用于代谢物的定性分析和定量测定。
2. 核磁共振波谱法（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR）：核磁共振波谱是一种非常强大的方法，可用于鉴定和测量代谢物的结构。
NMR技术可以提供有关化合物的分子结构、化学环境和相互作用的信息。
这对于代谢物鉴定和分析至关重要。
3. 液相色谱法（Liquid Chromatography, LC）：液相色谱是一种分离和测定化学混合物中成分的方法。
液相色谱法结合了色谱分离技术和检测技术，可以有效地分离和测量复杂的样品混合物中的代谢物。
此外，与质谱法相结合的液相色谱（LC-MS）可用于代谢物的定性和定量分析。
4. 气相色谱法（Gas Chromatography, GC）：气相色谱是一种用于分离和测定挥发性化合物的方法。
使用气相色谱法，代谢物可以通过蒸汽化和分离步骤来分离，并通过检测和鉴定来分析。
气相色谱法可以与质谱法相结合使用，以获得对代谢物结构和浓度的更全面的信息。
5.生物传感器与生物芯片技术：生物传感器和生物芯片是一种基于生物分子相互作用原理的分析技术。
酶学分析技术2016
Km值是酶的特征常数，具有重要的应用价 值。
Km的含义:
当Km=[S]时，v Vm2a，x 可见Km值等于反应速率达 到最大反应速率Vmax一半时的底物浓度。
Km的意 义：
➢Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 ➢鉴别酶的种类 ➢反映酶对底物亲和力的大小 ➢选择酶的最适底物或天然底物 ➢设计适宜的底物浓度
·L·V标
实际保温时间
正常上限升高倍数（ULN）
概念：某标本酶活性测得的结果除以该法正常参考范围上 限所得倍数。
酶活性实测值
即ULN＝
正常参考范围上限
例：如某人血ALT测定结果为80u/L，该测定方法正常 参考范围上限为40mmol/L，其ULN＝80/40＝2
(二)、酶质量浓度表示方法
原理：用免疫学技术直接测定酶的质量，以质量浓度单位 报告结果。如ng/ml或μg/L等。
✓特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测 定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较 少。
9
2.国际单位IU（µmol/min）IFCC3,72℃001年
✓定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1µmol
底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1µmol/min。
表.某些酶的Km值
酶
底物
Km(mmol/L)
乳酸脱氢酶 己糖激酶
-半乳糖苷酶 碳酸酐酶 过氧化氢酶 蔗糖酶 糜蛋白酶
丙酮酸 D-葡萄糖 D-果糖 D-乳糖
H2CO3
H2O2 蔗糖 甘氨酰酪氨酰甘氨酸
0.017 0.05 1.5 4.0 9.0 25 28 108
3.反映酶与底物的亲合力 Km值越大，酶与底物亲合力越小， Km值越小，酶与底物亲合力越大。
代谢物的鉴定与分析方法
代谢物的鉴定与分析方法代谢物是指物质在生物体内经过代谢反应后所形成的产物。
代谢物的鉴定与分析在生物医学研究中起着至关重要的作用。
代谢物的分析方法主要可以分为两类：定性方法和定量方法。
一、定性方法定性方法是指通过检测代谢物的化学性质、光学性质或质谱特征来确定代谢物的种类。
定性方法主要有以下几种：1. 色谱-质谱联用法色谱-质谱联用法是一种常用的代谢物定性方法，它通过色谱技术将复杂的代谢产物分离，再通过质谱技术确定其质谱特征，从而确定代谢物的种类。
色谱-质谱联用法具有灵敏度高、分离效果好等特点。
2. 核磁共振光谱法核磁共振光谱法是一种常用的代谢物定性方法，它通过检测代谢物分子中的核磁共振信号来确定代谢物的种类。
核磁共振光谱法具有结构信息丰富、非破坏性等特点。
3. 紫外光谱法紫外光谱法是一种常用的代谢物定性方法，它通过检测代谢物分子中的紫外吸收光谱来确定代谢物的种类。
紫外光谱法具有操作简单、灵敏度高等特点。
二、定量方法定量方法是指通过测定代谢物的质量或数量来确定代谢物的含量。
代谢物的定量方法主要有以下几种：1. 高效液相色谱法高效液相色谱法是一种常用的代谢物定量方法，它通过色谱技术将代谢产物分离，再通过检测其在某一波长下的吸收光强来确定代谢物的含量。
高效液相色谱法具有稳定性好、重复性好等特点。
2. 质谱-质谱联用法质谱-质谱联用法是一种常用的代谢物定量方法，它通过质谱技术将代谢产物分离，并通过质谱技术测定其质谱信号强度，从而确定代谢物的含量。
质谱-质谱联用法具有灵敏度高、特异性好等特点。
3. 放射性测定法放射性测定法是一种常用的代谢物定量方法，它通过检测代谢产物中放射性同位素的放射性衰变来确定代谢物的含量。
放射性测定法具有准确度高、灵敏度高等特点。
总结代谢物的鉴定与分析方法丰富多样，每种方法都有其适用范围和优缺点。
在具体应用中需要根据实际情况选取合适的方法进行分析。
随着科技的不断发展，代谢物的鉴定与分析技术也在不断进步，相信未来会有更多更先进的分析方法出现。
生物体内代谢物质的分析技术
生物体内代谢物质的分析技术随着科技的发展，生物体内代谢物质的分析技术正在不断地更新和完善。
生物体内的代谢物质是指生物体内所存在的各种有机分子，包括核酸、蛋白质、碳水化合物、脂类等。
分析生物体内代谢物质的方法一直以来都是生物学和医学研究的热点之一，因为它对于了解生物体内的代谢过程、研究疾病的发生、诊断和治疗等方面具有重要意义。
一、生物体内代谢物质分析技术的发展随着生物技术、化学分析技术以及计算机信息技术的飞速发展，对于生物体内代谢物质的分析技术也在不断的更新和完善。
在分析生物体内代谢物质的过程中，一般会采用液相色谱质谱联用技术、核磁共振波谱技术以及基于质谱成像的组织分析技术等。
1. 液相色谱质谱联用技术液相色谱质谱联用技术是指将液相色谱和质谱相结合的一种分析方法。
其主要原理是将生物体内代谢物质分离、纯化并通过质谱检测分析出分子的质谱信号，最终得到代谢物质的结构和含量等信息。
这种方法不仅能够快速、高效地分析代谢物质，而且能够同时分析多种代谢物质。
近年来，随着技术的日益发展，液相色谱质谱联用技术已经成为生物医学研究中最常用的分析方法之一。
2. 核磁共振波谱技术核磁共振波谱技术是一种采用强磁场作用下的核磁共振现象分析物质结构和组成的方法。
其主要原理是通过核磁共振现象来获得物质分子的结构、化学环境和分子间的相互作用等信息，从而获得准确的代谢物质结构信息。
核磁共振波谱技术可以通过分析代谢物质的数量、分布、分子结构等特征来研究生物体代谢过程和疾病的发生和发展等问题。
该技术最大的优势是能够在不破坏样品分子结构的情况下进行分析，得到高精度的分析结果。
3. 基于质谱成像的组织分析技术基于质谱成像的组织分析技术是一种在组织中进行代谢物质分析的新型方法，其中质谱成像是指在样品表面生成质谱图像，并将其与样品形态进行对应，从而获得所分析分子的空间分布图像。
这种方法可以用于对生物样品进行微米级别的空间分析，不但可以在时空分辨率上比较精确地描绘代谢物质的分布情况，而且可通过显微组织切片法，快速、定量地分析分布、摄入、合成、代谢等方面的生理和病理状态。
精品医学课件-代谢物酶法分析 肖 (1) (1)
86 86 135 135 39.7 22.5
200U/L >25U/L,3μg/
L >200 U/L >40%总LD LD1/LD2>1 0.5μg/L 1.5～3.1μg/L
3～8 3～8 8～18 8～18 3～6 3～6
10～36 9～30 24～72 24～72 10～24 14～20
72～96 5～25 48～72 5～20 6～10d 3～5 6～10d 5～10 5～10d 30～200 7～14d 20～50
)
dt
积分得：
t
2.303
Km V max
lg
S 0 St
S 0
V
St
max
式中[S0]为待测物，[St]为待测物至反应t时间后的浓度
17/57
第七章 代谢物酶法分析
以上积分式：
t
2.303
Km V max
lg
S0 St
S0
V
St
max
若反应达到平衡，假设
酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理就 能测定，简化了实验程序； 试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品对 环境的污染； 酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。
7/57
临床诊断MI的常用生化标志物血中浓度动态变化趋势
临床常用的诊断急性心肌梗死常用标志物一览表
心肌 分子量 标志物 (kD)
判断值
出现时间 达峰时间 恢复时间 （h） （h） （h）
升高倍数
Mb 17.8 100μg/L 0.5～2 5～12 18～30 5～20
代谢物检测与分析技术研究
代谢物检测与分析技术研究代谢物是由生物体内代谢过程中产生的化合物，它们可以作为多种疾病的标志物。
因此，代谢物检测和分析技术在临床医学、生物医药和食品安全等领域中具有广泛的应用价值。
本文将从介绍代谢物检测的原理、常用的代谢物检测技术以及当前的发展趋势等方面进行探讨。
一、代谢物检测的原理代谢物检测的主要原理是利用代谢物与生物体内变化的关系。
在生物进程过程中，代谢物的数量和种类会随着生物状态而产生变化。
因此，通过测量代谢物的含量和种类，可以推测生物状态和生物反应的活性程度，以此作为疾病的标志物。
二、常用的代谢物检测技术1. 质谱技术质谱技术是一种非常重要的代谢物检测技术。
根据质谱技术的不同类型，可以对分子的质量和组成进行精确的测量和分析。
常见的质谱技术有质谱荧光分析（MS/FD-LTQ-Orbitrap）、气相色谱质谱（GC-MS）和液相色谱质谱（LC-MS）等。
其中，荧光质谱技术具有灵敏度高、特异性好、信噪比高等优点，因此广泛应用于临床医学、环境保护和食品安全等领域。
2. 核磁共振技术核磁共振技术（NMR）是一种对代谢物进行分析的非损伤性技术。
该技术利用对自旋运动的观察来获得有关分子的结构、动力学和化学环境的信息，可应用于代谢物组学研究、生物成像和蛋白质折叠研究等方面。
3. 光谱技术光谱技术是一种利用代表性波长的电磁波，通过模拟生物样品产生的反应而得出代谢物的检测方式。
由于光谱技术具有非常高的灵敏度、分辨率和特异性，是代谢物检测和分析的重要方法。
常见的光谱技术有紫外光谱、荧光光谱、近红外光谱等。
三、当前的发展趋势1. 多样化的生物标记物检测技术目前，代谢物检测和分析已经成为临床医学、生命科学和食品安全等领域的重要技术。
随着技术的不断进步，生物标记物检测技术的种类也越来越多样化，如蛋白质、核酸和细胞等，代谢物分析技术的研究也将更加深入和广泛。
2. 代谢物和疾病的关联性研究代谢物检测技术在临床医学中可以有效地帮助诊断和治疗各种疾病。
代谢物的分析与结构鉴定技术
代谢物的分析与结构鉴定技术随着科学技术的发展，越来越多的代谢物被用于医药、化学等领域。
代谢物是生物体内产生的化合物，可以包括蛋白质、糖类、脂类等多种不同类型的分子。
对于代谢物的分析与结构鉴定技术的发展和应用，具有重要的价值和意义。
代谢物的分析是指对代谢物的多层次分子结构、代谢动力学、代谢通路以及代谢元学进行研究和分析。
研究代谢物可以为医学和药物研发提供重要的信息，例如：发现新药物、评价药物的代谢特征、分析代谢物的副作用等。
同时，代谢物也可以用于检测慢性疾病的发生和发展，利用代谢物水平的变化预测或监测疾病的进程。
代谢物分析技术的发展可以追溯到20世纪50年代。
最初的代谢物分析技术主要依靠柱层析法和纸层析法来分离物质并进行定量分析。
但是，这些方法具有操作复杂、样品量较大的缺点。
因此，各种新的代谢物分析技术相继出现，如高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法等。
其中，质谱法是最为常用的代谢物分析技术之一，其基本原理是根据待检测物质的质量与电荷之比进行分析。
质谱法具有快速、高灵敏度、定量准确、具有流动性等特点，能够对代谢物的结构进行识别和鉴定。
除了分析技术的发展，代谢物的结构鉴定技术也在不断地进化和完善。
代谢物结构鉴定技术旨在确定代谢物的结构、功能以及代谢过程中的化学反应。
对代谢物结构的鉴定可以帮助确定代谢物的生物学特性以及生物体系中的代谢信息。
现在常用的代谢物的结构鉴定方法包括核磁共振（NMR）光谱分析、质谱（MS）分析、X射线和电子晶体学、红外光谱和过渡态结构分析等。
NMR技术是指通过核磁共振仪器对样品中含有核磁共振活性原子（如1H、13C等）的分子进行分析，根据原子（或核）的磁场产生的信息对分子的电子结构、单键和多键、杂环化合物、终末基团，一个分子内的空间构象等进行研究。
NMR技术的优点在于不需要分离和提纯样品，而且可以分析样品中不同种类原子的数量和种类。
但是，这种技术需要对分子进行较为准确的结构模型预测，同时还需要较大的核磁共振实验仪器。
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系统。
19
过氧化物酶指示系统
共用的指示反应 最早由Trinder氏 等人提出，被称 为Trinder反应
最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。
已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油 三酯等项目的测定
20
过氧化物酶指示系统
血清总胆固醇氧化酶测定法
胆固醇酯 + H2O
胆固醇 + O2
9
(1)
单酶反应直接法
待测物与产物在理化性质上有便于检测的信 号，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产 物本身信号的改变来进行定量分析的方法称为
直接法。
10
单底物反应直接测定法
尿酸紫外法测定 尿酸 + O2 + H2O
UAO
尿囊素 + CO2 + H2O2
尿酸在293 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在 293 nm 处测定吸光度下降 胆红素测定 胆红素 + O2
碱酯酶的活性，被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以
计算出标本中有机磷的含量。 另有抑制ALP法测定茶碱、激活HK法测定镁离子等。
返回章目录
33
3
代谢物酶法分析的设计要求
试剂酶概念 试剂酶质量 试剂酶特征 试剂酶来源 试剂酶纯度 酶法设计共性要求 平衡法设计的要求 速率法设计的要求
酶法设计要求
34
5
(2)
速率法基本理论
速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测
定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的
消耗量较小时(<5%)，酶促反应呈一级反应，此时的 反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。
速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。
6
(2)
速率法基本理论
在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 <5%， 只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用
23
产物循环－氧化酶－脱氢酶系统
使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一 种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或其衍生
物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。
检测指示系统： ①循环前、后用速率法测定 NADH(340 nm) 的变化。②检测产物H2O2可通
过Trinder 反应比色测定。
24
ICDMg
31
酶活性恢复法应用举例
丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子 α-半乳糖苷酶法测定钠离子
淀粉酶法测定氯离子
超氧化物歧化酶法测定铜离子
碳酸酐酶或碱性磷酸酶法测定锌离子等
32
激活和抑制法
根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动
力学发生改变来测定激活剂和抑制剂的含量。
有机磷的酶法测定 有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆 碱酯酶与标本在37℃水浴10min，测定剩余的乙酰胆
测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正
比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定
18
脱氢酶指示系统
常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。
体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁
酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及
氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示
动力学。 但在以NADH 或NADPH 为底物的终点法测定中， 因340 nm 吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。
12
双底物反应直接测定法
乳酸测定
乳酸 + NAD+
LD
丙酮酸 + NADH + H+
在340 nm 处测定吸光度的增加来进行定量的方法 丙酮酸测定 丙酮酸 + NADH + H+
COD
胆固醇 + 脂肪酸
△4-胆甾烯酮 + H2O2 红色醌类化合物
H2O2 + 4-AAP + 酚
指示酶反应生成的红色醌类化合物可在500 nm 处比色测定
21
过氧化物酶指示系统
常用的Trinder反应生色基团 化学名 酚 2，4-二氯酚 N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺 N-乙基-N-（2-羟基-3-丙磺酰）间甲苯胺 N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺 英文缩写 P 2，4-DCP EMAE TOOS ESPDMA 最大吸收峰 （nm） 500 510 555 555 585
14
脱氢酶指示系统
氧化型辅酶NAD(P)+ 在340 nm 处没有吸 收峰, 还原型辅酶 NAD(P)H在340 nm 处有吸收峰.
15
脱氢酶指示系统
以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶 Ⅰ(NAD+) 或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型
NAD(P)H后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被
(1)
试剂酶的质量要求 试剂酶的概念
试剂酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度 或酶活性的一类酶。它是酶试剂的核心，它的 质量是酶试剂质量的决定性因素。
35
(1)
试剂酶的质量要求
试剂酶的来源和理化特征
主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。
基因重组酶蛋白也有应用，活力高，杂酶含量
少且价格低廉。
不同来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。 必须掌握专一性和分子量、等电点、Km、最 适pH，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂 和抑制剂对酶活性的影响。
LD
乳酸 + NAD+
在340 nm 处测定吸光度的下降来进行定量的方法
13
(2)
酶偶联法
酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分， 将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到 检测目的的方法称酶促偶联法。 A
A B C
Ea Ei
最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶 指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。
G 6 PD
指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定 340 nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比
17
脱氢酶指示系统
血清尿素测定 尿素 + H2O
尿素酶
2NH3 + CO2
NH3 + α-酮戊二酸 + NADH + H+
谷氨酸 + 物循环－氧化酶－脱氢酶系统
甘油浓度测定
ATP 甘油
GK
ADP
NAD+
G-3-PDH GPO
NADH+H+ 磷酸二羟丙酮 H2O2
甘油-3-磷酸 O2
通过GPO和G-3PDH使G-3P 与DHAP之间循环，在反复
循环中G-3P 和DHAP 的量不变，而产物H2O2 随每次循环 不断递增，同时NADH 递减。在规定时间t 内，H2O2 累计 的量决定于t 和每min循环次数。
26
底物循环－脱氢酶－辅酶系统
血淸胆汁酸测定
Thio-NAD+
3α -HSD
Thio-NADH(黄色) 循环
3α -HSD
胆汁酸 NAD+
3-酮类固醇 NADH
胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代
还原型辅酶Ⅰ（黄色），控制好条件，反应速度与代测 物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。
27
平衡法（终点法） 代谢物酶法分析 速率法（动力学法）
4
(1)
平衡法基本理论
平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐 渐被消耗，当剩余的底物量很小（<1%～5%）时，指示 反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称 为终点法(end-point method)。
平衡法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是“浓度”。
表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、
产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是兰色醌类，能避免溶 血等色素干扰。
22
(3)
酶循环法
利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促
反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应
产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质
的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。 酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定 于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两 种试剂酶( Ea 和Eb) 的量。该法测定中所选择酶的 Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。
该酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、
微量元素或辅酶的含量。
30
酶活性恢复法
异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子 异柠檬酸+ NADP+ α-酮成二酸 + CO2 + NADPH+H+ 用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA) 抑制钙离 子，标本中Mg2+通过恢复ICD 活性，催化异柠檬酸脱氢的 正向反应，使NADP+还原，与镁标准一起在340nm测定吸 光度的増加。
亮氨酸脱氢酶
NH4+ + 氧化异己酸 NADH
28
酶循环法具有的特点
灵敏度随反应时间的延长而提高 灵敏度随酶在扩增反应中的用量而提高 利用酶对底物的特异性,使测定系统简化 利用四唑盐类的显色反应可实现比色测定
29
(4)
其他酶法
酶活性恢复法
很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才 发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、微量元 素或辅酶之后，酶即失去了其催化活性，无活性的酶 与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使
第五章
代谢物酶法分析技术
2
代谢物酶法分析技术的概念