第七讲 差异表达基因分析
基因表达数据分析中的差异分析方法
基因表达数据分析中的差异分析方法随着基因组学和生物信息学的发展，基因表达数据分析在生物学研究中扮演着至关重要的角色。
基因表达数据的分析可以帮助我们寻找不同条件下的基因差异，从而进一步了解基因的功能以及生物系统的调控机制。
而在基因表达数据分析中，差异分析方法是最常用和重要的工具之一。
本文将介绍几种常见的基因差异分析方法，包括差异基因筛选、聚类分析和生物学功能注释等。
一、差异基因筛选差异基因筛选是基因表达数据分析中最常见的任务之一。
它的目的是从两个或多个不同条件下的基因表达数据中找出在两个条件之间有显著表达差异的基因。
在差异基因筛选中，常用的方法有t检验、方差分析和Wilcoxon秩和检验等。
t检验是一种基本的统计方法，适用于两个条件的差异分析。
它可以通过比较两个条件下基因的平均表达水平，来判断它们之间的差异是否具有统计学意义。
方差分析则适用于三个以上条件的差异分析。
它基于方差的分解，通过比较组内和组间的方差差异，判断基因的表达是否受到不同条件的显著影响。
Wilcoxon秩和检验是一种非参数检验方法，适用于数据不满足正态分布的情况。
它利用数据的秩次而非具体数值进行比较，更加鲁棒。
二、聚类分析除了差异基因的筛选，聚类分析也是基因表达数据分析中常用的方法之一。
聚类分析可以将基因表达数据分为若干个类别，从而发现具有相似表达模式的基因。
常见的聚类方法包括层次聚类和k均值聚类。
层次聚类是一种树状图分析方法，可以将样本或基因聚成一颗层次树。
它基于距离或相似性的度量，通过自下而上或自上而下的合并或分割，将数据划分为不同的类别。
而k均值聚类则是一种基于样本的聚类方法。
它将数据分为k个类别，并试图使得每个样本到其所属类别的中心距离最小。
三、生物学功能注释在差异分析之后，对差异基因的生物学功能进行注释是进一步理解基因调控机制的重要步骤。
生物学功能注释可以揭示差异基因所参与的生物过程、细胞部位和分子功能等信息。
在生物学功能注释中，常见的工具和数据库包括Gene Ontology （GO）注释、KEGG和Reactome等通路注释以及蛋白质-蛋白质相互作用网络等。
差异表达基因分析技术及基因芯片在血液学研究中的应用
IPGI 综合运用了 SSH 与基因表达连续分析法的原理，是一种 SSH 的 改良法；含相同接头的双链 cDNA 由于两端有长序列的反向重复,可互 补形成“锅-柄”结构而不能扩增；而含不同接头的双链 cDNA 能与引物 配对而扩增。扩增后的 PCR 产物即可直接插入载体，经测序后与基因
断芯片，如肝癌及糖尿病诊断芯片；检测芯片，如商品检疫和病原检 测芯片。根据芯片上核苷酸的长度不同又可分为寡核苷酸芯片(oligo— chip)、cDNA 芯片(cDNA chip)和基因组芯片(genomic chip)。
基因芯片技术是在传统的 Southern blot 和 Northern blot 分析方法基 础上发展起来的，优越性在于可自动、定量、快速检测目的材料中成 千上万个基因的表达情况，在基因诊断、表达、突变和发现新基因、 多态性检测、基因组作图及各种病原体的诊断等生物医学领域中具有 重大应用价值，已应用于许多疾病的研究。近来有文献报道应用此技 术对白血病、恶性淋巴瘤等进行了基因表达研究[110,111]，现就 DNA 芯 片技术在恶性血液系统疾病研究中的应用进行简要介绍。
认整合步骤法及目前最为有效的基因芯片技术等。这些研究方法根据
其原理大体上分为 3 大类[106](表 2-1)。
表 l 差异表达基因研究方法
杂交的技术
PCR 的技术方法 测序的方法
Northen 斑点杂交 差异显示
表达序列标签
RNA 酶保护实验 代表性差异显示 基因表达系列分析
减数克隆
抑制性消减杂交 DNA 测序芯片
1 差异表达基因的分析技术
《基因差异表达分析》课件
• 引言 • 基因差异表达分析的方法 • 基因差异表达分析的实验设计 • 基因差异表达分析的结果解读 • 基因差异表达分析的挑战与展望 • 案例分享与讨论
目录
Part
01
引言
基因差异表达分析的定义
基因差异表达分析是通过比较不同条件下基因表达水平的变化，来研究基因功能、 生物体对环境或刺激的响应机制以及疾病发生发展机制的方法。
加强跨学科合作
基因差异表达分析涉及到多个学 科领域，加强跨学科合作有助于 推动该领域的发展。
Part
06
案例分享与讨论
案例一：肺癌中的基因差异表达分析
总结词
肺癌是一种常见的恶性肿瘤，基因差异表达分析有助于揭示肺癌的发病机制和潜在治疗 靶点。
详细描述
通过对肺癌组织与正常组织进行基因差异表达分析，可以发现与肺癌发生、发展相关的 关键基因，如EGFR、KRAS等。这些基因的异常表达可能导致肺癌细胞的增殖、转移和 耐药性产生。基因差异表达分析为肺癌的诊断、治疗和预后评估提供了重要的科学依据
STEP 02
STEP 01
实验可重复性差
样本获取困难
在某些情况下，获取足够 的样本可能非常困难，特 别是在临床研究中。
STEP 03
实验设计不合理
在某些情况下，实验设计 可能不合理，导致无法准 确地检测基因差异表达。
由于实验条件、操作过程 等因素的影响，基因差异 表达分析实验的可重复性 可能较差。
数据质量控制
数据完整性
检查测序数据的完整性，确保数据没有缺失或损坏。
数据一致性
比较不同样本之间的测序数据，确保它们具有相似性和一致性，以便进行后续的 比较分析。
Part
基因表达差异的分析方法研究
基因表达差异的分析方法研究基因表达差异是指在不同生物或不同条件下，对同一基因进行的表达实验中，所测得的表达量之间的差异。
对基因表达差异的研究可以帮助我们更好地理解基因功能和调控机制，并为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
接下来，将介绍一些基因表达差异分析的方法。
1. 微阵列技术微阵列技术是最早被用于基因表达差异分析的方法之一。
该技术利用DNA芯片上固定的互补DNA序列与待测RNA样品进行杂交，测定样品中各个基因的表达水平。
具体操作步骤包括：样品采集、RNA提取、标记、杂交与扫描等多个步骤。
虽然微阵列技术具有高通量、高灵敏度和高精度等优点，但也存在着成本高、样品处理复杂和标记的局限性等问题。
2. RNA测序技术随着二代测序技术的发展，RNA测序技术已成为一种常用的基因表达差异分析方法。
RNA测序技术利用高通量测序平台对RNA样品进行测序，可以对基因的转录和剪切等过程进行全面的检测和定量。
与微阵列技术相比，RNA测序技术不需要依赖于基因组序列信息，同时还可以检测未知序列和新基因的表达情况。
但RNA测序技术也存在着不同的测序深度和质量、样品处理和分析方法等影响分析结果的因素。
3. 质谱技术质谱技术是一种基于蛋白质组学的方法，也可以用于基因表达差异的分析。
该技术主要包括两个步骤：蛋白质消化和质谱分析。
在蛋白质消化步骤中，蛋白样品被加入胰酶等酶类，将多肽生成后进行分离。
在质谱分析中，分离后的多肽样品被注入质谱仪，得到其质量和放电荷比例的信息。
由此可以推断出蛋白的氨基酸组成和序列等信息。
质谱技术的优点包括定量、选择性和灵敏度高，同时可以进行定量分析和鉴别分析。
4. 基因编辑技术随着基因编辑技术的发展，我们还可以通过CRISPR-Cas等技术对基因表达差异进行分析。
在这种方法中，我们可以将CRISPR-Cas系统引导的RNA处理后注入细胞内，选择性地打靶并对目标基因进行编辑，从而直接体现基因在表达水平上的变化。
【转录组入门】7：差异基因分析
【转录组⼊门】7：差异基因分析作业要求：使⽤R语⾔，载⼊表达矩阵，然后设置好分组信息，统⼀⽤DEseq2进⾏差异分析，当然也可以⾛⾛edgeR或者limma的voom流程。
基本任务是得到差异分析结果，进阶任务是⽐较多个差异分析结果的异同点。
【1】安装DESeq21 # 下⾯是在R语⾔中操作2 # 载⼊安装⼯具3 > source("/biocLite.R")4 # 安装包5 > biocLite("DESeq2")6 # 载⼊包7 > library("DESeq2")DESeq2对于输⼊数据的要求：1.DEseq2要求输⼊数据是由整数组成的矩阵。
2.DESeq2要求矩阵是没有标准化的。
【2】DESeq2进⾏差异表达分析DESeq2分析差异表达基因简单来说只有三步：构建dds矩阵，标准化，以及进⾏差异分析。
# dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = cts, colData = coldata, design= ~ batch + condition) #~在R⾥⾯⽤于构建公式对象，~左边为因变量，右边为⾃变量。
# dds <- DESeq(dds) #标准化# res <- results(dds, contrast=c("condition","treated","control")) #差异分析结果【3】构建dds矩阵1 > library(DESeq2) # 加载包2 > countData <- raw_count_filter[2:7] # 中括号中的数量要与condition中数量⼀致3 > condition <- factor(c("control","control","control","hypoxia","hypoxia","hypoxia"))4 > colData <- data.frame(s=colnames(countData),condition)5 # raw_count_filter：是所有样品的count按照gene id融合后⽣成的矩阵。
differential gene expression analysis
differential gene expression analysisDifferential gene expression analysis（差异基因表达分析）是一种研究基因表达模式在不同条件或不同组织样本之间差异的方法。
通过比较不同条件或组织样本的基因表达谱，可以发现哪些基因的表达水平发生了显著变化，从而了解这些基因在生物学过程或疾病发展中的作用。
在进行差异基因表达分析之前，通常需要对基因表达数据进行标准化处理，以确保不同样本之间的数据具有可比性。
然后，使用统计方法比较不同条件或组织样本的基因表达谱，筛选出表达差异显著的基因。
这些差异基因可能涉及不同的生物学过程、信号通路或疾病过程，具有重要的生物学意义。
差异基因表达分析在许多领域都有应用，如生物学、医学和农业等。
例如，在生物学研究中，差异基因表达分析可以用于研究生物生长发育过程中的基因表达变化；在医学研究中，差异基因表达分析可以用于研究疾病发生发展过程中的基因表达变化，从而发现潜在的治疗靶点或药物。
总之，差异基因表达分析是一种强大的工具，可以帮助我们深入了解基因表达模式的变化，揭示生物学过程和疾病机制，为药物研发和疾病治疗提供重要的线索和依据。
在差异基因表达分析中，数据标准化处理是非常重要的一步，其目的是消除不同样本或实验条件之间的系统误差，使数据具有可比性。
以下是一些常用的数据标准化处理方法：1.归一化：将每个样本的基因表达量转换为相对表达量，使不同样本之间具有可比性。
常见的归一化方法包括：•截尾值归一化：将表达量低于某一阈值的基因去除，或将其表达量设为0。
•最大值归一化：将每个样本的表达量除以该样本中表达量的最大值，使所有样本的表达量都在0-1之间。
•平均值归一化：将每个样本的表达量减去该样本表达量的平均值，使所有样本的表达量都为0。
1.批间归一化：由于实验过程中可能存在的批次效应，需要对不同批次的样本进行归一化处理，使它们之间具有可比性。
RNA测序数据中的差异表达基因分析方法研究
RNA测序数据中的差异表达基因分析方法研究随着高通量测序技术的快速发展，RNA测序成为了研究基因表达和转录组的重要方法之一。
通过RNA测序，我们可以获取到细胞或组织中全部转录本的信息，进而揭示出与疾病发生、发展以及生物学过程相关的差异表达基因。
差异表达基因分析是RNA测序数据分析的重要组成部分，它可以帮助我们识别出在不同样本中表达量有显著差异的基因，从而研究这些基因在生物学过程中的功能和调控机制。
在进行差异表达基因分析时，我们首先需要对RNA测序数据进行质量控制和预处理。
这包括去除低质量的reads、去除接头序列、去除rRNA和tRNA序列等。
接下来，我们需要将清洗后的reads进行比对，将其与参考基因组或转录组进行比对，以确定每个read的来源。
常用的比对工具包括Bowtie、STAR等。
比对完成后，我们需要对reads进行计数，统计每个基因的表达量。
这一步骤可以使用HTSeq、FeatureCounts 等软件实现。
在得到基因的表达矩阵后，接下来可以进行差异表达分析了。
差异表达分析的目的是找出在不同条件下表达显著差异的基因。
常用的差异表达分析方法包括DESeq2、edgeR、limma 等。
这些方法都基于数学模型，通过对基因表达矩阵进行统计学分析，找出在不同样本间表达水平差异显著的基因。
这些方法在差异分析中会考虑到基因间的离散和基因长度的偏差，并进行合适的统计假设检验。
通过设置合适的统计显著性阈值，我们可以筛选出差异表达显著的基因。
在差异表达基因分析中，我们通常会根据富集分析对差异表达基因进行功能注释，以了解其在生物学过程中的功能。
富集分析可以帮助我们发现差异表达基因富集在哪些生物学通路、功能模块以及进化树上。
常用的富集分析方法包括基于基因本体论的GO分析和基于生物通路的KEGG分析。
这些分析方法能够帮助我们从大量的差异表达基因中挖掘出具有重要生物学意义的基因。
此外，差异表达基因分析还可以进行聚类分析和可视化分析。
测序数据做差异表达基因分析流程
测序数据做差异表达基因分析流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!测序数据的差异表达基因分析流程详解在现代生物信息学中，差异表达基因分析（Differential Expression Gene Analysis，DEG）是研究基因功能和疾病机制的重要手段。
分子生物学中的基因表达差异分析
分子生物学中的基因表达差异分析在分子生物学中，基因表达差异分析是一个重要的研究方向。
简单来说，基因表达差异指的是在不同条件下，不同基因的表达量存在差异。
这种差异的发现可以帮助科学家们更好地理解细胞的生命过程，发现致病基因等。
基因表达差异分析有很多方法，其中常用的包括芯片技术和RNA测序技术。
这两种方法本质上都是从不同的角度观察细胞的基因表达情况，从而找出差异。
这些差异可能来源于不同环境下的基因调控、基因突变等，因而能够为我们提供更多的生物信息。
RNA测序技术是一种高通量技术，能够同时检测上万个基因的表达情况。
在RNA测序实验中，实验者会提取细胞中的RNA，将其转录成cDNA，并通过二代测序技术进行分析。
通过比较不同条件下的RNA-Seq数据，我们就可以得到基因表达水平的差异。
芯片技术也被广泛应用于基因表达差异分析。
芯片通常被设计成包含数万个探针盘，每个探针盘对应一个基因。
实验者可以将RNA或cDNA样本标记后放置在芯片上，使其与芯片上的探针区域发生结合。
通过读取信号强度，我们可以得到对应基因的表达水平。
基因表达差异分析不仅用于生物学基础研究，还可以在医学领域中应用。
例如，在肿瘤研究中，科学家们可以使用RNA测序技术分析不同肿瘤样本集中基因表达差异，从而发现潜在的致病基因或生物标记物。
这种方法可以用来帮助医生更好地确定患者的诊断和治疗方案。
综上所述，基因表达差异分析是分子生物学领域中的重要研究方向。
通过比较不同样本的基因表达情况，我们可以揭示生命过程中的细节以及疾病发生发展的机制，从而为医学和生物学领域带来更多可能性。
差异表达基因分析：差异倍数（foldchange）,差异的显著性（P-value）火山图
差异表达基因分析：差异倍数（foldchange）,差异的显著性（P-value）⽕⼭图Differential gene expression analysis：差异表达基因分析Differentially expressed gene (DEG)：差异表达基因Volcano Plot：⽕⼭图差异倍数(fold change)fold change翻译过来就是倍数变化，假设A基因表达值为1，B表达值为3，那么B的表达就是A的3倍。
⼀般我们都⽤count、TPM或FPKM来衡量基因表达⽔平，所以基因表达值肯定是⾮负数，那么fold change的取值就是(0, +∞).为什么我们经常看到差异基因⾥负数代表下调、正数代表上调？因为我们⽤了log2 fold change。
当expr(A) < expr(B)时，B对A的fold change就⼤于1，log2 fold change就⼤于0（见下图），B相对A就是上调；当expr(A) > expr(B)时，B对A的fold change就⼩于1，log2 fold change就⼩于0。
通常为了防⽌取log2时产⽣NA，我们会给表达值加1（或者⼀个极⼩的数），也就是log2(B+1) - log2(A+1). 【需要⼀点对数函数的基础知识】为什么不直接⽤表达之差，差直接有正负啊？假设A表达为1，B表达为8，C表达为64；直接⽤差B相对A就上调了7，C就相对B上调了56；⽤log2 fold change，B相对A就上调了3，C相对B也只上调了3. 通过测序观察我们发现，不同基因在细胞⾥的表达差异⾮常巨⼤，所以直接⽤差显然不合适，⽤log2 fold change更能表⽰相对的变化趋势。
虽然⼤家都在⽤log2 fold change，但显然也是有缺点的：⼀、到底是5到10的变化⼤，还是100到120的变化⼤？⼆、5到10可能是由于技术误差导致的。
转录组入门（7）：差异表达分析PublicLibraryofBioinformatics
转录组入门（7）：差异表达分析PublicLibraryofBioinformatics理论基础：线性模型，设计矩阵和比较矩阵这部分内容最先在RNA-Seq Data Analysis的8.5.3节看到，刚开始一点都不理解，但是学完生物统计之后，我认为这是理解所有差异基因表达分析R包的关键。
基本上，统计课都会介绍如何使用t检验用来比较两个样本之间的差异，然后在样本比较多的时候使用方差分析确定样本间是否有差异。
当然前是样本来自于正态分布的群体，或者随机独立大量抽样。
对于基因芯片的差异表达分析而言，由于普遍认为其数据是服从正态分布，因此差异表达分析无非就是用t检验和或者方差分析应用到每一个基因上。
高通量一次性找的基因多，于是就需要对多重试验进行矫正，控制假阳性。
目前在基因芯片的分析用的最多的就是limma。
但是，高通量测序(HTS)的read count普遍认为是服从泊松分布（当然有其他不同意见），不可能直接用正态分布的t检验和方差分析。
当然我们可以简单粗暴的使用对于的非参数检验的方法，但是统计力不够，结果的p值矫正之估计一个差异基因都找不到。
老板花了一大笔钱，结果却说没有差异基因，是个负结果，于是好几千经费打了水漂，他肯定是不乐意的。
因此，还是得要用参数检验的方法，于是就要说到方差分析和线性模型之间的关系了。
线性回归和方差分析是同一时期发展出的两套方法。
在我本科阶段的田间统计学课程中就介绍用方差分析（ANOVA）分析不同肥料处理后的产量差异，实验设计如下肥料重复1 重复2 重复3 重复4A1 ... ... ... ...A2 ... ... ... ...A3 ... ... ... ... ...这是最简单的单因素方差分析，每一个结果都可以看成 yij = ai + u + eij，其中u是总体均值，ai是每一个处理的差异，eij是随机误差。
注：方差分析(Analysis of Variance, ANAOVA)名字听起来好像是检验方差，但其实是为了判断样本之间的差异是否真实存在，为此需要证明不同处理内的方差显著性大于不同处理间的方差。
差异基因表达
差异基因表达差异基因表达是指在不同生物体或不同组织、不同发育阶段、不同环境条件下，基因在转录和翻译过程中表达水平的变化。
这种差异使得生物体能够适应不同的环境和生理状态，并发挥出不同的功能。
差异基因表达的研究对于理解生物体的发育、适应和进化具有重要意义。
差异基因表达的研究主要通过基因表达谱分析来实现。
基因表达谱分析是指对不同样本中的基因表达情况进行比较和分析，以寻找差异表达的基因。
最常用的方法是基于高通量测序技术的RNA-seq和微阵列技术。
差异基因表达的发现不仅可以揭示不同生物体之间的差异，还可以帮助我们理解疾病的发生机制。
通过比较病人和正常人的基因表达谱，可以发现和疾病相关的差异基因。
这些差异基因可能是疾病的致病基因或潜在治疗靶点。
例如，通过对癌症组织和健康组织的基因表达谱进行比较，可以发现与癌症相关的差异基因，从而为癌症的诊断和治疗提供新的线索。
差异基因表达的研究还可以帮助我们理解基因调控网络的结构和功能。
基因调控网络是由一系列相互作用的基因和调控元件组成的复杂网络。
通过分析差异基因表达的调控网络，可以揭示基因间的相互作用关系和调控机制。
这对于理解生物体的发育和功能具有重要意义。
差异基因表达的研究不仅限于生物医学领域，还涉及到农业、生态学和进化生物学等领域。
例如，通过比较不同品种或不同环境条件下作物的基因表达谱，可以发现与产量、品质和抗性相关的差异基因，从而为作物改良提供新的思路和方法。
差异基因表达的研究对于理解生物体的发育、适应和进化具有重要意义。
通过分析差异基因表达，我们可以揭示基因调控网络的结构和功能，发现与疾病和重要农作物性状相关的差异基因。
差异基因表达的研究将为生物医学、农业和生态学等领域的科研和应用提供新的思路和方法。
07研究差异表达基因的相关技术17
Differential Displaying (DD) - PCR
A set of different primers for DDRT-PCR are complimentary to poly (A), and contain two additional 3’ nucleotides like GG, GG, GA…. All separately
5’ xxxxxxxxxxxxxCTAAAAAAAAAA 3’ GATTTTTTTTTTT 5’
12 primers = 12 aliquotes
First strand reverse transcription to cDNAs in 12 aliquotes
2nd PCR with the same anchor primers (separately) and a randomly designed decamer in the presence of labeled dATP for visualization
SAGE技术具有较好的重复性
碱基的特 定锚定酶切位点也就共14个碱基，在实际研究工作中其特异性尚 有欠缺、包含的信息量较少，不便于后续工作，因此其相应的补 充性、改良性技术也颇引人注目：
GLGI技术： 即Generation of Longer cDNA fragments from SAGE tags for Gene Identification，通过PCR技术将10碱基的SAGE tag延伸至平均约 250bp长的3’EST序列，用于验证SAGE结果、以及对未知基因 的进一步研究。
2.同时展示细胞在特定状态下的表达图谱，又 能显示哪些差异表达的基因 • 基因芯片技术 DNA chip • 基因表达系列分析 SAGE Serial analysis of gene expression
转录组高通量测序转录组数据分析差异表达基因分析 PPT
3
➢ 转录组的研究可以提供什么条件下什么基因表达什么信息，从而 推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制
➢ 对转录本的定量可以了解特定基因的活性和表达量，用于疾病的 诊断和治疗
➢ 通过对转录组的研究，也让个性化医疗的目标，从共性转移到个 性，成为可能
11
(2)RNA 聚合酶II负责蛋白质编码基因和调控非编码RNA的转录，在 真核生物的不同生理和病理状态下表达量被严格调控，一直吸引着 各生命科学研究领域的重点关注，无比幸运的是，由RNA聚合酶II 生成的转录的末端均含有3’端多聚腺苷尾【3’poly（A）tail】。 转录组测序一般是对用多聚胸腺嘧啶（oligo-dT）进行亲和纯化的 RNA聚合酶II转录生成的成熟mRNA和ncRNA进行高通量测序。这 样的数据有效排除了看家非编码RNA的干扰，可以通过一次测序获 得一种细胞内几乎所有重要基因的表达参数。
1.4转录组测序
➢ （1）RNA聚合酶I和III负责种类稀少、功能重要的看家非编码 RNA基因的转录，包括rRNA，tRNA，snoRNA，snRNA等。由这 两类RNA聚合酶转录的非编码RNA属于看家RNA，在各种生理和 病理状态下都被高水平转录，转录产物占细胞内RNA总量的95% 以上，不是生命科学研究前沿领域的主要关注对象
4
1.3转录组研究的技术
主要包括如下三种：
➢1）基于杂交技术的微阵列技术； ➢2）基于Sanger测序法的SAGE (serial analysis of gene expression) 和 MPSS(multiple parallel signature sequencing)； ➢3）基于新一代高通量测序技术的转录组测序。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
一般性的方法
选择一个统计量给基因排秩来证明表达有 差异 为排秩统计量选择一个判别值，在它之上 的值将被认为是显著的 前面一个部分更为重要，所以研究的较多， 方法也更多，后面那部分的方法稍微简单
重复芯片（replicates）M值
根据比率平均值或 对基因排序。 M值 为信号强度比值的log2值， 是任一特 定基因在重复序列中M值的均值。 这一排序法忽略了一个基因在重复实验中 的不同芯片上表达水平的差异程度。例如， 可能某一个基因在某一张芯片上M值很大， 但在其他芯片上M值很小，其实这条基因并 没有差异表达，但由于个别M值的影响，从 而显示出一个差异表达的特性，造成假阳 性。
Cluster&Treeview软件
Genesis软件
预分析（Pre-Analysis）
重复值合并（ replicate handling ） 数据转换和标准化（data transformation and standardization） 缺失数据处理（ missing value management ） 基因筛选（pattern selection）
K最近邻法（K-nearest neighborhood method）： 假定某个基因在某个指标上含有缺失值，计算此 包含缺失值的基因与在该指标上无缺失的基因间 的相似性指标或距离指标（相似性或距离的计算 中不包括欲估计的指标），与该基因相似性最大 的K个基因称为该基因的K个最近邻（k nearest neighborhoods），这K个基因在该观测指标上的 数据就是估计缺失基因数据的基础，估计值可以 是这K个基因在该指标上的均数，也可以是这K个 基因的加权均数。在加权均数中，权重为上面计 算的基因间的相似性。K值的确定具有一定的经验 性，但不宜太大和太小。
平均值 标准差
比较多组数的方法
T检验：平均值 F检验： 方差
SAM（significance analysis of microarrays）
单通道Oligo芯 片，尤其是 affymetrix芯片 数据分析用得 较多
双通道cDNA芯片数据分析用得较多
False Discovery Rate (FDR)
Z值法
在一张cDNA芯片上一般都点了很多基因，其实这 些基因中只有很小一部分表达有差异，所以一般 都假设表达的比率值满足正态分布。 Z=(X-µ)/σ. |Z|>=1.96 在寡核苷酸芯片中，芯片上的基因在相应实验条 件下或相应组织中也只是有很小一部分基因有表 达，可以假定强度满足对数正态分布，同样可以 对其作Z变换，使其具有统计意义。 如果实验体系中没有一条差异表达的基因，Z值法 还是会挑选出5％的差异表达基因。这是因为在芯 片实验中，总有一些由于背景噪声产生的假阳性 点。如果实际上实验中有大量的基因发生表达改 变，Z值法还是机械的找出5％的差异表达基因， 丢失了一部分真阳性点。
单通道寡核苷酸芯片差异基因（两 个样本直接比较）
Affymetrix，illumina芯片由于有探针重复，可以利用统计方 法计算出一个统计性的P值或者score值，筛选差异表达基因
不同类样本差异基因识别
价一组数的统计量
232.7 198.2 137.7 84.3 218.6 181.5 216.7 87
基因筛选（gene selection）
在进行分析之前，要先选择用来分析的基因。不 然所有的基因有上万条，也就是数据矩阵有上万 行时，既增加了运算的难度，又引入了不必要的 基因，也增加了解释结果的难度，要预先进行基 因的滤取。 当一条基因表达谱数据中的无效数据个数超过一 定的范围时，这条基因就认为是一条无效基因， 在以后的聚类分析中不把这条基因考虑在内。 一条基因表达谱数据的波动很小，也就是说，数 据的方差小于一定的范围，意味着这条基因与所 要研究的生物过程或对象关联很小，也被滤掉， 不进行聚类分析。 差异表达次数
重复值合并
基因不同命名
重复值合并
Gene ID converter
重复值合并
在特定条件下把所有的重复值合并成一个数值可 能更为方便，而这一个值是给定基因/条件的代表。 通常的合并是指计算这些重复值的集中趋势指标， 如均数、中位数或众数。然而，使用一个集中趋 势指标代替一组数值意味着信息的丢失，因此数 据的合并应谨慎。 去除奇异值。可以通过计算原始数据的均数和标 准差，去除位于给定区间外的数据（如均数加减3 个标准差外的数据）。剩余的数据重新计算均数 和标准差，并消除给定区间外的数据。
错误发现率是评估检验统计显著性的最有 力工具。统计学家都想用更符合统计学的 手段得到差异基因，具体说来就是想用假 设检验后赋予每个基因统计显著性或者P值， 使得每个基因的判别更有统计学上的意义。 为了达到这个目的，统计学家们常常用控 制错误发现率（False Discovery Rate） 的方法来判断差异基因。
基因筛选
针对特别目的选取，比如选取不同类之间 差异表达基因。常用的方法，假设检验， 比如t检验，F检验等 不改变整体数据矩阵的数据结构，去除数 据的冗余性。常用方法，主成分分析等。
发展
新算法
新角度
合并多种方法
主成分分析 (Principle Component Analysis)
降维概述
降维是指将样 本从输入空间 通过线性或非 线性映射到一 个低维空间。
降维可以减少无用信息和冗余信息，将高维数据转换 为易于处理的低维数据，减少了后续步骤处理的计算量 ，当降至三维以下时还可用于可视化技术，从而发挥人 在低维空间感知上的优点，发现数据集的空间分布、聚 类性质等结构特征。
主成分分析（PCA，principal component analysis）
对于一组原始随机变量为 X1,…,Xp，寻找一个新的 变量Z1，这个新的变量是 原始变量的线性组合， Z1=a11X1+a21X2+…+ap1Xp， 并使得Z1的变异最大化 Z1即为原始变量的最大主 成分，它使用一个变量试 图最大化地包含一组变量 的变异。通常一个变量还 不足够，因此，需要寻找 第二个主成分Z2，Z2与Z1 不相关，且是除Z1外具有 最大方差的原始变量的线 性组合。
倍数法
倍数法
倍数法是比较常用的一种方法，因为比较简单和 直接。 但是，这种方法也是有其重大缺陷的。比如，在 某个实验中，基因表达水平的变化不大，如果选 择判别域值为2倍，则有可能找不到几个差异表达 的基因，假阴性率比较高。但如果是主观缩小判 断域值，又有可能增大假阳性率。 这一方法没有考虑到差异表达的统计显著性。
基因表达数据矩阵 (glass slides)
数据矩阵具体形式
数据形式
数据矩阵,基因数远大于样品数
对任意一个基因来说,样本值是特征值,数据的维数是M 对任意一个样本来说,基因值是特征值,数据的维数是N 聚类时考虑基因之间的相似性，从数学上讲 就是看对应的M维数据之间的相似性
Cluster&Treeview软件
Improved Detection of Differentially Expressed Genes Time series microarray dataset
聚类分析
基因表达数据矩阵 (Affymetrix
GeneChip® oligonucleotide arrays)
sam/ref
T值排序
假如一个基因在几张重复芯片的M值都很小， 但是这些M值非常接近，所以s值也非常小， 这样可能会导致t值很大，从而会把这个本 没有差异表达的基因误认为差异表达。
修正的T值
修正值由样本方差的均数和标准差估计而 得。结果显示：在一个模拟的数据集中， 虽然带有一些经验性质，但用修正t-统计 量给基因排秩比用均数和一般的t-统计量 效果要好。
缺失数据的处理
固定值法，比如0或者1 行平均法 使用重复数据点对缺失数据进行填充。对于生物 学重复中缺失数据的填充应慎重，应当使用尽量 同质的样品对缺失值进行估计。 使用基因间的相关性对缺失数据进行填充。奇异 值分解法，KNN法。 其他方法，最小二乘法拟合修补，方差迭代分析， 最大可能性分析
KNN法
第七讲
Quantile Normalization
使每张芯片/通道的强度值有相同的分布 (intensity distribution)
Quantile normalization
Before
Quantile normalization
After
R语言和bioconductor
差异表达基因分析
数据转换和标准化
数据变换的目的是在尽量保证原始数据特 征不变的前提下，使变换后的数据更适于 进行统计分析。 对数转化（log-transformation） 中心化处理（center） 单位圆化 正态化（均值为0，方差为1）
缺失数据处理
芯片上的某些点可能因为芯片的缺陷、点像素强 度达到饱和、点像素强度非常小等因素而产生异 常的数据点，在数据的预处理阶段把这些数据点 删除。 未观测点 若后续的统计分析要求数据满足完整性，如特征 基因提取的奇异值分解、某些基因的聚类分析方 法等，则需要对含有缺失值的数据进行处理 删除含有缺失值的整条记录，这种方法操作简单， 但却因为个别值的缺失而删除整个记录，可能丢 失大量有价值的信息 填充或修补缺失数据
Multiple test (Pvalue adjustment)
火山图（volcano plot）
Statistical test: Pvalue Fold change: Ratio
其他方法
B-statistics (Smyth,2004) Bayes T-test (Baldi and Long, 2001) SAMROC (Broberg, 2002) Zhao-Pan method (Zhao and Pan, 2003) ……
单张cDNA芯片差异表达基因