第二讲免疫器官的观察与免疫细胞的分离
免疫细胞的分离及检测技术课件
Ficoll分离液---聚蔗糖-泛影葡胺溶液
➢2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1 份34%泛影葡胺生理盐水溶液, 比重为1.077± 0.002
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
二 、淋巴细胞分离
(去单核细胞)
➢ 贴壁粘附法 ➢ 吸附柱过滤法 ➢ 磁铁吸引法 ➢ Percoll 分离液法
二、B细胞表面标志
➢ SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体,部 分CD分子是B细胞的重要表面标志,其中以 SmIg为B细胞所特有,是鉴定B细胞可靠的指 标。
➢ CD19/CD5分子:可将B细胞区分为B1细胞和 B2细胞,B1细胞为CD19和CD5双阳性,而 B2细胞仅为CD19阳性,B2细胞为通常所指的
细胞活力的检测
常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活 细胞正常完整的细胞膜,故活细胞不着色,死 亡细胞的细胞膜通透性增高,可使染料进入细 胞而使细胞着色(蓝色)。
第二节 淋巴细胞标志及亚群分类
常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志 是簇分化抗原(Cluster of differentiation,CD)。
➢ 根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分 子表达至少可以分为:辅助性T细胞、细 胞毒性T细胞和调节性T细胞;SmIg为B 细胞所特有,是鉴定B细胞可靠的指标, 以CD5和CD19为标志可将B细胞分为B1 和B2两个亚群;目前多以CD3-、 CD16+、CD56+ 作为NK细胞的典型标 志。
三、NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以 CD16、CD56来认定,临床上将 CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为 NK细胞。
T细胞及NK细胞
第三节 其他的免疫细胞
抗原提呈类细胞表面标志
医学免疫学实验:免疫器官和免疫细胞
第一次实验:免疫器官和免疫细胞(示教)一、免疫器官免疫器官包括中枢免疫器官和外周免疫器官。
在哺乳类动物,中枢免疫器官包括胸腺和骨髓;在禽类,中枢免疫器官包括胸腺和法氏囊。
外周免疫器官有淋巴结、脾脏等。
1.胸腺胸腺位于胸腔纵隔上部,胸骨后方。
胸腺的组织结构:胸腺分左右两叶,表面覆盖有一层结缔组织被膜,被膜深入实质将实质分割成若干小叶。
胸腺小叶的外层为皮质,内层为髓质。
胸腺皮质区分为浅皮质区和深皮质区。
皮质区内85%-90%的细胞为未成熟的T 细胞。
髓质区内有大量的胸腺上皮细胞和稀疏分散的较成熟的胸腺细胞、单核﹣巨噬细胞和树突状细胞。
人类胸腺在胚胎期及出生后2岁内生长很快,体积较大;2岁后到青春期发育仍很快;但青春期后开始萎缩,逐渐由脂肪组织所代替,它在机体免疫功能的建立上占有重要地位。
骨髓内有部分淋巴细胞迁移到胸腺内,在胸腺素的影响下,增殖分化成为具有免疫功能的T 细胞,再经血流输送到淋巴结和脾等周围免疫器官发挥免疫功能。
若新生期切除胸腺或胸腺生长肿瘤,可导致细胞免疫功能显著下降,常因感染而死亡。
胸腺组织切片2.骨髓骨髓位于骨髓腔中,分为红骨髓和黄骨髓。
红骨髓有造血功能,由造血组织和血窦构成。
造血组织主要由基质细胞和造血细胞组成。
基质细胞包括网状细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等。
骨髓是各类血细胞和免疫细胞发生的场所。
骨髓又是B 细胞分化成熟的场所和体液免疫应答发生的场所。
因此骨髓既是中枢免疫器官又是外周免疫器官。
骨髓概述图3.法氏囊在禽类,法氏囊是位于泄殖腔上方的一个囊状物,内充满着淋巴组织,其中淋巴细胞不断受囊素的影响,发育成B 淋巴细胞。
若新生期切除法氏囊,抗体的形成将受影响,而细胞免疫功能不受影响。
对于 B 淋巴细胞发育而言,禽类的法氏囊具有哺乳类动物骨髓相似的作用。
法氏囊外观4.淋巴结淋巴结的实质分为皮质区和髓质区两部分。
皮质区分为浅皮质区和深皮质区两部分。
浅皮质区靠近被膜下,是B 细胞定居的场所,称为非胸腺依赖区。
2第二章 免疫器官和免疫细胞ok
各种与免疫有关的细胞
一、淋巴细胞
淋巴细胞是机体主要免疫细胞,分为许多表型和 功能均不同的群体:T、B、NK等。
未活化淋巴细胞直 径6~7微米,浆/ 核比例很小
透射电镜显示未活化 淋巴细胞胞核致密, 胞浆中细胞器很少
淋巴细胞的起源和分化
胸腺
特异抗原 识别受体 B细胞
转移到淋巴器官中
T细胞
转移到淋巴器官中
• 丝裂原—可直接诱导静息T细胞的活化、增殖和分化。 • T细胞表面有丝裂原受体。
(5)细胞因子受体 (6)主要组织相容性抗原(MHC分子)
MHC-I:所有T细胞表面均表达 MHC-II:活化后的T细胞表面表达 (这种代表个体特异性的同种异型抗原称移植抗原 或组织相容性抗原,其中能引起强而迅速排斥反应 的抗原称主要组织相容性抗原,引起较弱排斥反应 的抗原称次要组织相容性抗原。)
2.T淋巴细胞亚群及其功能
根据免疫效应功能分为
辅助性T细胞(TH) 细胞毒T细胞(CTL、TC) 调节性T细胞(TR)
CD4
+
T细胞
CD8
+
T细胞
根据是否表达CD4或CD8分子分为
+ + (1)CD4 辅助性T细胞(CD4 Th细胞)
• Th1细胞—细胞免疫,介导迟发型超敏反应。 • Th2细胞—促进体液免疫 参与超敏反应 抗寄生虫感染
(三)B淋巴细胞
三、其他免疫细胞
造血干细胞 粒细胞
肥大细胞
红细胞
血小板
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返回总目录
骨髓
1.哺乳动物和人的造血器官 2.B细胞分化、发育、成熟的埸所
3.抗体产生的重要部位
免疫细胞的分离及检测课件
免疫磁珠分离法
6
(二)巨噬细胞的分离
☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
7
(三)中性粒细胞的分离
聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
血浆
RBC
RBC
(抗凝血)
8
Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞
有或无
无
增多、嗜碱 增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6~8
不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
3H-TdR掺入法
原理:
刺激物
外周血(T)G0期 37℃56h
G1期→ S1期
3H-TdR
合成DNA↑
DNA- 3H-TdR
37℃16h
测淋巴细胞内放射量(cpm) 判断淋巴细胞转化程度
34
淋巴细胞转化的检测方法
形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法
35
形态学检查法
36
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
细胞大小(直径 μm) 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足
37
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
过渡型
12~20
12~16
增大、疏松 增大、疏松
清晰、1~4个 有或无
目录
第一节 吞噬细胞的分离和收集 第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化 第三节 淋巴细胞及其亚群的分离
1
免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
免疫器官和免疫细胞ppt课件
一、中枢免疫器官
免疫细胞由不成熟发育为成熟的免疫功能 细胞的场所
1.骨髓
由骨髓基质细胞构成微环境
多能造血干细胞在骨髓中增殖,分化、发育, 成熟为粒细胞、单核细胞、红细胞、血小板 及B细胞
2.胸腺 Thymus
T淋巴细胞分化成熟的中枢免疫器官。 来自骨髓的始祖T细胞在胸腺上皮细胞及 其产生的胸腺素作用下→分化成熟T淋巴 细胞。
3)阴性选择
❖ 主要在胸腺皮质与髓质交界处进行。 ❖ 位于该处的巨噬细胞和树突状细胞高水平表达
MHC-I类和MHC-II类分子。 ❖ 在胚胎发育过程,机体自身抗原成份能与巨噬细胞
和树突状细胞表面MHC-II类或I类分子结合形成复 合物。则这细胞发生自身耐受,停止发育,表现为 对该种自身抗原的反正T细胞克隆清除或克隆存在 但功能丧失,即成为克隆无能状态。
❖ 只有那未跟巨噬细胞或树突状细胞表面自身 抗原肽-MHC-II类或I类分子复合物结合的SP 细胞,离开胸腺继续分化、发育为具有识别 非己抗原能力的T细胞。
(二)T细胞的表面标志
❖ 指存在于T细胞表面的膜分子,包括了T细胞表 面受体和T细胞表面抗原。
❖ T细胞表面抗原:参与T细胞抗原识别、信号 传导、及激活的抗原主要有MHC抗原和分化 抗原。
二、外周免疫器官
❖ (一)淋巴结 ❖ 主要含T、B细胞、巨噬细胞和树突然状细胞。
❖ 淋巴结是淋巴液的滤器,也是具有免疫活性 的T、B细胞移居和接受抗原刺激后产生免疫 应答的重要场所。
❖ 2、淋巴结的主要功能
❖ 1)、过滤淋巴液:通过淋巴窦→吞噬细胞、 抗体、杀伤作用→清除病原微生物及有毒物 质→防止病原体的扩散作用。
+、CD2+、CD3+、CD4-、
免疫细胞的分离技术
CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2) 、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、
CD269(BCMA)、CD307(IRTA2)
髓样细胞 CD14、CD35(CR1)、CD64 (FcRI)、CD256(APRIL)、
CD257(BAFF)、CD312(EMR2)
血小板 CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v) 、
➢ 不同细胞密度不同 ➢ 不同细胞表面生物学特性不同 ➢ 不同细胞表面分化抗原不同
17
免疫细胞的分离技术
根据不同的实验目的可以采取下列不同的分离方法
1、密度梯度离心法 2、黏附分离法(尼龙毛法、贴壁法、亲和板法) 3、磁性分离法 4、荧光激活分离法 5、其他分离法(花环沉降法)
18
(一)外周血单个核细胞分离
加工处理抗原,将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的 一组免疫细胞。血液中主要的APC细胞主要包括单核细 胞、树突状细胞、B细胞
10
其他细胞
自然杀伤(NK)细胞,肥大细胞,嗜酸性粒细胞,嗜中 性粒细胞,嗜碱性粒细胞,血小板等
NK细胞 肥大细胞 嗜酸性粒细胞 嗜中性粒细胞 嗜碱性粒细胞 血小板
11
免疫细胞的特征
39
方法 (以CD4+T细胞为例)
1. 羊抗兔Ig包被平皿 2. CD4 一抗培育T细胞,倒入平皿,4℃孵育1小时; 3. 收集未粘附的CD4-T细胞 4. PBS漂洗非特异吸附的CD4-T细胞 5. 收集粘附的CD4+T细胞,可以用刮板刮取并在显微
镜下观察
40
免疫磁珠法 (Magnetic activated cell
CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、 CD279(PD1)、
(精品课件)免疫细胞分离及表面标志检测
细胞分离基本原理
➢不同细胞密度不同 ➢不同细胞生物学特性不同 ➢不同细胞表面分化抗原不同
4
一、外周血单个核细胞分离
➢ 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)包括淋巴细胞和
单核细胞(monocyte)。
聚蔗糖-泛影葡 胺 聚乙烯吡咯烷酮 处理的硅胶颗粒
24
2 .细胞活力测定 细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示,细
胞活力的测定常用的简便方法是台盼蓝(trypan blue)染色法。死细胞着色,染成蓝色;活细胞拒染。
用血细胞计数器在显微镜下观察到着色和不着色 的细胞,计数200 个细胞,以不着色细胞的百分率 即代表细胞的活力。
25
第二节 淋巴细胞标志及亚群分类
22
四、不同细胞分离方法的综合评价
早期
细胞物理属性 细胞生物属性
分辨率和灵敏度不高
现在(根据细胞表面标志)
免疫磁珠 流式细胞仪
分辨率和灵敏度高
缺点:不适用于细胞表面分子不清的细胞分离,试剂和仪器昂贵
23
五、分离细胞的保存和活力检测
1.分离细胞的保存 对保存液的要求:等渗,具pH 缓冲作用, 并对细胞无毒性(Hanks、Tc-199、 RPMI 1640 )。如需短期保存,置4℃放 置较好,可减低细胞代谢活动。如需长期 保存,应放入液氮罐中在深低温(-196℃) 条件下保存细胞。
死细胞 血小板 单核细胞
淋巴细胞
粒细胞 红细胞
13
三、T、B细胞和T细胞亚群 的分离
• 磁性微球分离法 • 荧光激活细胞分离仪分离法
14
1. 磁性微球分离法
磁性微球:金属小颗粒(Fe2o3, Fe3o4),其表面包裹有高 分子材料(聚苯乙烯,聚氯乙烯等),表面有活性基团 (氨基、羧基和羟基),可结合生物大分子物质(抗原, 抗体,核酸等)。 免疫磁珠:微球表面包被有免疫物质称免疫磁珠。
医学免疫学PPT:免疫器官与免疫细胞
Mo
腺 微
DC
环
成纤维细胞择性发育
17
胸腺 (thymus)
(二) 胸腺微环境
胸腺上皮细胞在微环境中作用:
1. 分泌细胞因子和胸腺肽类分子 2. 细胞-细胞间相互接触
DC树突细胞 (高水平MHCⅡ) 巨噬细胞 (低水平MHCⅡ) 细胞外基质 维持胸腺内细胞的正常生理功能、促进细胞 间的相互接触、促进胸腺细胞移行成熟。
13
骨髓 (bone marrow)
二 骨髓的功能 1. 各类血细胞和免疫细胞发生的场所 2. B细胞和NK细胞分化成熟的场所 3. 体液免疫应答的发生场所
6
1. 各类血细胞和免疫细胞发生的场所
CFU
7
2. B细胞和NK细胞分化成熟的场所
骨髓
NK cell
9
3. (再次)体液免疫应答的发生场所
外周免疫器官又称次级免疫器官,是 成熟免疫细胞居留和发挥免疫效应的 场所。包括淋巴结、脾脏、黏膜相关 淋巴组织。
4
骨髓 (bone marrow)
一 骨髓的结构与微环境
基质细胞
造血组织
网状细胞 成纤维细胞 血管内皮细胞 巨噬细胞等
红骨髓 黄骨髓
血窦构成
造血细胞
基质细胞 及分泌的细胞因子
(IL-3,4,6,7, SCF,GM-CSF等) 细胞外基质
骨髓
经淋巴液和血液
分化成熟
浆细胞
在外周免疫器官 受抗原活化
大量抗体(IgG为主)
记忆性B细胞
血液
再次免疫应答在: 外周免疫器官: 抗体产生速度快,但持续时间较短
骨髓: 抗体产生持久,为血清抗体主要来源 10
骨髓 (bone marrow)
免疫器官和免疫细胞PPT课件
2. 抗体活化的杀伤作用:通过表面IgG的Fc受体(CD16)杀伤 与抗体结合的细胞。即抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用 (ADCC)
3. 免疫调节细胞:被IL-2活化的NK细胞产生IL-1、IFN、TNF 等细胞因子对免疫功能进行调节。
其它淋巴细胞
LAK细胞:需在IL-2等细胞因子诱导下,才能发挥杀 伤作用,即淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)。 运用LAK细胞治疗对Tc细胞和NK细胞不敏感的肿 瘤。
(二)抗原提呈细胞(APC)
1. 单核-巨噬细胞 2. 树突状细胞(DC) 3. B细胞
单核-巨噬细胞 表面受体: 1. IgGFc受体(FcγR):参与调理吞噬与ADCC作用。 2. 补体受体:CRⅠ可与C3b结合,参与调理吞噬及免
免疫学检验
第二章 免疫器官和免疫细胞
本章要点
1. 免疫系统的组成。 2. 中枢免疫器官与外周免疫器官的组成和
功能。 3. 免疫细胞的分类 4. 淋巴细胞的主要表面标志。
4
目录
1 免疫系统的组成 2 免疫器官的分类及其功能 3 免疫细胞的分类 4 淋巴细胞的表面标志
免疫系统
概念:是由具有免疫功能的器官、细胞和分子组成的 。具有识别和排除抗原性异物、维持机体内环境稳定 和生理平衡的功能,是执行体液免疫和细胞免疫的物 质基础。Leabharlann T淋巴细胞——T淋巴细胞亚群
T细胞共同的标志:TCR、CD3和CD2分子 CD4+T细胞:具有CD4分子的T细胞,即辅助性T细胞(Th) 1.Th1细胞:引起炎症反应与迟发型超敏反应,炎性T细胞(
TDTH细胞),效应细胞,产生IL-2、IFN-γ、TNF-β 2.Th2细胞:诱导B细胞增殖、分化产生抗体,参加体液免疫
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Department of Immunology
实验目的
掌握小白鼠的捉拿与处死方法 掌握免疫细胞分离的方法及其效果的判断 熟悉血细胞计数板的构造及使用方法
Department of Immunology
免疫器官的观察
Department of Immunology
【实验结果】
细胞计数
• 随机计数100个细胞,并数出其中活细胞 数
结果计算
• 细胞活力=活细胞数/细胞总数 × 100%
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实验操作录像
实验报告
实验原理
实验方法
实验结果及分析
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【台盼兰拒染法原理】
活细胞 死细胞
通透性 死细胞 高
着色 易
颜色 蓝
体积 大
活细胞
低
难
无色
小
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注意事项
脾脏去净筋膜,弃边缘,取其中间部分 研磨时不可用力过大,时间不宜过长 染色时间不宜过长或过短 血细胞计数板的使用方法(10倍镜、暗 视野)
Department of Immunology
粒细胞 红细胞
离心前
离心后
密度梯度离心法
Department of Immunology
淋巴细胞及其亚群的分离
Department of Immunology
抗原肽-MHC 分子四聚体技术
Department of Immunology
小白鼠的抓取和固定
通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠 笼盖或其它粗糙表面上,在小鼠向前挣 扎爬行时,用左手拇指和食指捏住其双 耳及颈部皮肤,翻转后将小鼠置于左手 掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾 部,即可将小鼠完全固定。
Department of Immunology
小白鼠的抓取和固定
Department of Immunology
小白鼠的抓取和固定
Department of Immunology
小白鼠的处死方法
颈椎脱臼法:用拇指和食指用力往下按住 鼠头,另一只手抓住鼠尾,用力稍向后上 方一拉,使之颈椎脱臼,造成脊髓与脑髓 断离,动物立即死亡。
【实验步骤】
1. 颈椎脱臼法处死小白鼠,取其脾脏 2. 将脾脏放入适量(约15ml)生理盐水 中,除去筋膜 3. 取绿豆大小的脾脏,用玻片研磨制成 10ml细胞悬液 4. 取1ml细胞悬液于试管中,加入1滴 台盼蓝染液 5. 混匀后静置3分钟,低gy
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小白鼠的处死法(颈椎脱臼法)
Department of Immunology
倒 T 字开腹
Department of Immunology
小白鼠脾脏
Department of Immunology
小白鼠脾脏
Department of Immunology
小白鼠脾脏
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小白鼠胸腺
Department of Immunology
小白鼠胸腺
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【实验器材】
小白鼠
手术器械,解剖台,血细胞计数板, 显微镜 0.2%的台盼蓝染液
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免疫细胞种类
Department of Immunology
免疫细胞分离技术
花环沉降法 密度梯度离心法 抗原肽-MHC分子四聚体技术 荧光激活细胞分选仪分离法 免疫吸附分离法 磁珠分离法
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外周血单核细胞的分离
稀释抗凝血
血浆 单个核细胞
淋巴细胞分离液
血细胞记数板
细胞计数池
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血细胞计数池的构造
白细胞计数区:
无效计数区
红细胞计数区:
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【计数原则】
计左不计右,计上不计下 1、
√ √ √ ×
2、“ S ”形随机计数
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