如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
组织病理学-增殖与凋亡
第五章细胞增殖和凋亡的检测第一节细胞增殖测定技术细胞增殖（cell proliferation）是机体的基本生物学特征，1951年Howard和Pelc用32P标记的方法，研究蚕豆根尖的细胞生长和分裂，首次提出了细胞分裂周期（cell divide cycle）的概念，将细胞增殖周期分为间期（gap phase）和有丝分裂期（mitosis phase,M期），前者包括DNA合成前期（gap1phase,G1期）、DNA合成期（synthesis phase,S期）和DNA合成后期（gap2phase,G2期），后者完成细胞分裂产生两个完全相同的子代细胞；在细胞周期中还存在一个G0期（图5-1），该期细胞不参与细胞增殖，只有在适当刺激后才可重新加入细胞周期。
根据细胞周期，可将细胞群分为分裂和非分裂两类细胞，前者指进入G1期后进行分裂的细胞，后者指处于G0期及非增殖的终末细胞。
分裂细胞与总细胞数的比值称增殖分数或生长分数，它决定细胞群的增殖活性，测定增殖分数可判断细胞群的增殖活性。
图5-1随着细胞化学、免疫组织化学及流式细胞术（flow cytometry,FCM）等技术的发展，细胞增殖活性已成为生理和病理研究领域最活跃的课题之一。
目前，测定细胞增殖活性的方法很多，常用的方法有下列几种。
一、核分裂计数核分裂像是细胞周期中惟一可以用形态学方法识别的时期，在普通光学显微镜下即能够进行。
Baak提出核分裂的识别标准的为：核膜消失；在核分裂中央缺乏透明区；核分裂像两侧或外周可见毛发样突起；胞浆嗜碱性。
Van Diest等亦提出类似标准，并强调要注意区别核分裂与核固缩及胞浆内随机排列的深染小点状物。
（一）核分裂计数（mitotic figure counting,MFC）方法核分裂计数有高倍视野法（high power fields,HPF）和核分裂指数法（mitotic index,MI）。
1．高倍视野法在高倍（×400）下，随机选择多个视野（≥10），分别观察并计数其中的核分裂像，然后计算出每个HPF中核分裂像的平均值。
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在维持机体内稳态、发育和疾病发生中起着重要作用。
因此，准确、可靠地检测细胞凋亡是细胞生物学和生物医学研究中的重要课题。
本文将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法，希望能为相关研究提供一些参考。
首先，细胞凋亡的形态学特征是细胞体积缩小、细胞核浓缩、细胞膜破裂和细胞内出现凋亡小体等。
因此，通过显微镜观察细胞形态变化是最直观的方法之一。
在实验中，可以使用荧光染料（如荧光素酶、荧光素酶底物等）标记细胞核和细胞膜，然后观察细胞形态的改变。
这种方法简单直观，但不够精确，需要结合其他方法进行验证。
其次，细胞凋亡过程中，细胞内的DNA发生断裂和片段化，产生特征性的DNA ladder。
因此，DNA ladder检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。
实验中，可以通过DNA提取、电泳等技术，检测细胞内DNA的片段化情况。
这种方法对于凋亡细胞的检测比较准确，但需要较多的细胞样本和专业的实验操作技术。
另外，细胞凋亡过程中，细胞膜上的磷脂会外翻，暴露磷脂酰丝氨酸（PS）在细胞表面。
因此，PS外露检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。
实验中，可以使用PS结合蛋白标记或荧光染料标记PS，然后通过流式细胞术或显微镜观察PS的表达情况。
这种方法对于凋亡细胞的检测比较灵敏，但需要较为昂贵的试剂和设备。
最后，细胞凋亡过程中，细胞内的一些蛋白酶活性会发生改变，如半胱氨酸蛋白酶（caspase）的活化。
因此，caspase活性检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。
实验中，可以使用荧光染料标记caspase活性底物，然后通过荧光显微镜或流式细胞仪检测caspase的活化情况。
这种方法可以直接反映细胞内凋亡信号通路的活性，但需要较为复杂的实验操作和数据分析。
综上所述，细胞凋亡的检测方法多种多样，各有优缺点。
在实际研究中，可以根据具体的研究目的和条件选择合适的方法进行细胞凋亡检测。
希望本文介绍的方法能够为相关研究提供一些帮助，推动细胞凋亡机制的深入研究，为疾病的防治提供新的思路和方法。
细胞增殖检测方法
细胞增殖检测方法
细胞增殖是细胞数量的增加和分裂的过程，对于检测细胞增殖的方法有很多种。
以下是一些常见的细胞增殖检测方法：
1. 细胞计数：通过显微镜观察和手工计数细胞数量，或使用自动化细胞计数仪进行细胞计数。
2. 细胞增殖染料：使用细胞增殖染料，如溴化乙锭（BrdU）或五溴乙酰胺（EdU），将其添加到培养基中，然后检测细胞摄取或转化这些染料的程度，以评估细胞增殖。
3. MTT试验：MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基-2H-四唑酮）试验通过测量细胞的代谢活力来评估细胞增殖。
MTT试剂会被活细胞还原为紫色的甲基噻唑咪唑离子，可以使用分光光度计测量产生的紫色产物的吸光度来确定细胞的增殖能力。
4. 细胞周期分析：通过流式细胞术检测细胞的DNA含量，可以确定细胞处于哪个细胞周期阶段，并评估细胞的增殖能力。
5. 细胞增殖标记：通过使用荧光标记物或融合蛋白来标记增殖细胞。
例如，使用荧光标记的抗体来检测细胞核内的增殖相关标记物，如Ki-67。
6. 实时细胞分析：使用实时细胞分析系统，如X-Celligence系统，可以通过记录电极传感器阻抗的变化来监测细胞的生长和扩张情况，从而评估细胞增殖。
这些方法可以单独或结合使用，以获得更全面和准确的细胞增殖信息。
凋亡检测的原理
凋亡检测的原理凋亡是生物体在生命周期中普遍发生的现象，它是一种秩序良好的细胞死亡方式。
在生物体的正常发育和组织恢复过程中，凋亡起着重要的作用。
因此，检测和理解凋亡的原理对于研究生物的发育、疾病和治疗具有重要意义。
凋亡的检测可以通过多种方法实现，其中一些方法依赖于特定的细胞生物学特征。
下面将介绍几种常用的凋亡检测方法及其原理。
1. 形态学检测形态学检测是最早也是最常用的凋亡检测方法之一。
凋亡细胞的形态学变化包括细胞体积缩小、核染色质凝聚和细胞质内出现凋亡小体等特征。
这些特征可以通过显微镜观察，如荧光显微镜或电子显微镜来检测。
2. DNA片段化检测DNA片段化是凋亡的典型标志。
在凋亡过程中，DNA分子经过酶的作用而发生断裂，形成大小不等的DNA片段。
这些片段可以通过凝胶电泳或荧光探针分析等方法检测到。
例如，TUNEL试剂可以标记DNA片段化的末端，并通过荧光显微镜观察。
3. 磷脂外翻检测磷脂外翻是凋亡细胞发生的重要事件之一。
在凋亡过程中，磷脂会从细胞内向细胞外翻转。
这种翻转可以通过磷脂酰丝氨酸（PS）的荧光探针或抗体来检测。
4. 即时检测即时检测方法可以实时监测凋亡的发生。
一些即时检测试剂可以通过荧光探针与凋亡标志分子相互作用，并产生荧光信号。
这些试剂可以直接添加到细胞培养物中，然后使用流式细胞仪等设备进行检测。
凋亡检测的原理主要基于凋亡过程中发生的特定生物学变化。
这些变化可以通过各种方法来检测和量化，从而达到准确判断细胞是否发生凋亡的目的。
凋亡检测的应用广泛，不仅可以用于基础研究，还可以应用于临床医学，如肿瘤治疗评估和药物筛选等领域。
总结起来，凋亡检测的原理主要包括形态学检测、DNA片段化检测、磷脂外翻检测和即时检测等方法。
这些方法的共同目标是通过观察和分析凋亡过程中的生物学变化来判断细胞是否发生凋亡。
凋亡检测的应用可帮助我们更深入地理解生物体的生命周期和疾病发生的机制，为未来的研究和治疗提供重要的参考依据。
细胞功能检测
细胞功能检测细胞功能检测是指对生物样品中的细胞进行测试和分析，以评估其功能状态和活性水平。
这种检测可以用于研究细胞生理学、疾病诊断和治疗等领域。
下面介绍几种常见的细胞功能检测方法。
1. 细胞生存和增殖检测：这种检测方法可以评估细胞的生存能力和增殖速度。
常见的方法包括细胞计数、细胞活力和增殖指标的测定。
细胞计数可以用显微镜观察和细胞计数仪进行，细胞活力可以通过测定细胞色素c释放量、ATP产量等指标来评估，增殖指标包括细胞周期、有丝分裂指数等的测定。
2. 细胞凋亡检测：细胞凋亡是正常的细胞死亡过程，对维持组织结构和功能起着重要作用。
细胞凋亡的检测可以使用多种方法，如细胞凋亡标记物的染色、DNA片段化检测和细胞凋亡相关蛋白的测定等。
常用的染色方法有TUNEL法、AnnexinV染色法等，可以直接或间接地检测细胞凋亡的存在和程度。
3. 细胞分化检测：细胞分化是未分化细胞向特定细胞类型发育和成熟的过程。
细胞分化的检测可以通过测定特定分化标记物的表达来评估。
例如，神经细胞的分化可以通过检测神经元特异性标记物如神经元特异性聚糖、神经元特异性酶等的表达来判断。
4. 细胞迁移和侵袭检测：细胞迁移和侵袭是细胞在体内的基本生理过程，在肿瘤的发生和转移中具有重要的作用。
细胞迁移和侵袭能力的检测可以使用Transwell迁移实验、划痕愈合实验等方法，通过观察细胞通过细胞孔隙和划痕进入下一层细胞的能力来评估。
5. 细胞代谢功能检测：细胞代谢是维持细胞生命活动所必需的重要过程之一，包括能量代谢、蛋白质合成和降解、核酸代谢等。
细胞代谢功能的检测可以通过测定细胞中某些代谢产物的含量、酶活性的测定、氧化还原能力的测定等来评估。
细胞功能检测是实验生物学研究和临床医学诊断的重要手段之一。
通过细胞功能检测，人们可以了解细胞在不同条件下的功能状态和活性水平，从而更好地研究细胞生理学机制、发现新的疾病标记物和药物靶点，为疾病的诊断和治疗提供新的线索和方法。
细胞增殖及细胞活力检测方法1
细胞增殖及细胞活力检测方法1细胞增殖及细胞活力检测方法1细胞增殖是指细胞数量的增加，是生物体生长和发育的基础过程。
细胞活力是指细胞代谢水平和功能状态的综合体现。
细胞增殖和细胞活力的检测方法在细胞生物学和生物医学研究中非常重要。
本文将介绍一些常用的细胞增殖和细胞活力检测方法。
一、细胞增殖检测方法1.平板计数法：平板计数法是一种直接计数方法，通过显微镜观察计数细胞数量。
首先，将细胞悬液均匀地涂布在显微镜滑片上。
然后，使用显微镜对细胞进行计数。
这种方法简单直接，但在大量细胞计数时比较耗时。
2.显微镜观察法：显微镜观察法是另一种直接计数方法。
通过显微镜观察细胞在培养皿中的覆盖度，以评估细胞增殖。
这种方法可以快速获得细胞增殖信息，但由于操作主观性较强，结果可能存在一定的误差。
3. MTT法：MTT法是一种间接计数方法，通过测定细胞代谢能力来估计细胞增殖。
首先，将MTT试剂加入细胞培养皿中，MTT会被活细胞还原成紫色的甲基化四氮唑盐（formazan）。
然后，通过比色法测定培养基中的甲基化四氮唑盐含量，从而间接反映细胞的增殖情况。
MTT法具有操作简便、结果可重复性好的优点。
4.WST-1法：WST-1法也是一种间接计数方法，通过测定细胞膜透过性来估计细胞增殖。
首先，将WST-1试剂加入细胞培养皿中，WST-1会被细胞色素P450酶一氧化还原成形成可溶性产物。
然后，通过光密度测定产生的产物浓度，从而间接反映细胞的增殖情况。
WST-1法灵敏度高，操作简单。
二、细胞活力检测方法1.ATP酶联反应法：ATP酶联反应法是一种直接测定细胞活力的方法。
ATP是细胞内的能量分子，可以反映细胞代谢水平。
通过酶联反应，将ATP转化为发光物质，然后使用发光仪测定发光强度，间接反映细胞活力。
这种方法灵敏度高，但样品处理复杂。
2.细胞膜透过性检测法：细胞膜透过性检测法是一种间接测定细胞活力的方法。
细胞在不同状态下，细胞膜透过性会发生变化。
细胞增殖 检测方法
细胞增殖检测方法细胞增殖是指细胞在生物体内不断分裂和繁殖的过程，是生物体生长和发育的基础。
检测细胞增殖的方法有很多种，以下将详细介绍几种常见的细胞增殖检测方法。
首先，细胞计数法是最常用的细胞增殖检测方法之一。
细胞计数法主要通过显微镜观察和数数的方式，计算细胞的数量来反映细胞增殖的情况。
可以通过细胞染色或细胞标记技术使细胞在显微镜下更易于观察和区分。
细胞计数法通常需要使用专业的细胞计数仪或显微相机来帮助实施，具有操作简单、结果准确等特点。
其次，MTT法是一种在体外细胞培养中常用的细胞增殖检测方法。
MTT法基于细胞中还原剂细胞线粒体呼吸将黄色硫代唑盐（MTT）还原为紫色的可溶性产物，最后通过比色法测定细胞数目和细胞活力。
MTT法操作简单、结果稳定可靠，广泛应用于药物筛选和细胞增殖研究中。
另外，细胞增殖标记法是通过标记DNA合成阶段的细胞来检测细胞增殖的方法。
常见的细胞增殖标记法有Brdu法和EDU法。
这两种方法都是通过标记新合成的DNA分子来反映细胞增殖情况，Brdu法利用抗体检测Brdu标记的DNA，而EDU法则利用稳定的EDU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）分子和荧光染料的结合来检测标记的DNA。
由于这两种方法都需要使用荧光染料或抗体检测，因此需要显微镜或流式细胞仪等设备来进行检测。
此外，细胞增殖检测还可以通过测定细胞凋亡（细胞死亡）来间接反映细胞增殖情况。
细胞凋亡是细胞自身程序性死亡的一种形式，常使用TUNEL（DNA末端标记术）法或Annexin V/PI双染法来检测细胞凋亡。
这些方法通过标记DNA 断裂或细胞膜破损来区分凋亡细胞和正常细胞，并通过荧光染料或抗体检测来反映细胞凋亡的程度。
细胞凋亡的明显增加往往意味着细胞增殖的受抑制。
总的来说，细胞增殖检测方法的选择应根据具体实验的目的、条件和资源来决定。
不同的方法各有优势和局限性，需要结合实际情况进行选择。
在细胞增殖检测中，细胞计数法是最常用的方法，MTT法和细胞增殖标记法是常见的体外检测方法，而通过检测细胞凋亡来间接反映细胞增殖情况也是一种有效的方法。
细胞凋亡检测步骤
细胞凋亡检测步骤
细胞凋亡检测步骤一般包括以下几个步骤：
1. 收集细胞样品：收集需要检测凋亡的细胞样品，可以是培养细胞、动物组织或人体组织。
样品应保持新鲜和完整。
2. 处理细胞样品：根据实验需要，对细胞样品进行处理，例如给予某种刺激物或药物，或者采用特殊培养条件。
3. 准备细胞悬液：将处理后的细胞样品转移到离心管中，并加入适量的培养基或缓冲液，制备细胞悬液。
悬液中细胞应保持单细胞状态。
4. 染色：根据实验要求，选择适当的染料对细胞进行染色。
常用的凋亡染色方法包括荧光染色和酶标法。
5. 流式细胞仪检测：将染色后的细胞悬液通过流式细胞仪进行检测。
流式细胞仪可以检测和分析细胞中的荧光强度或酶标信号，进而评估细胞凋亡程度。
6. 数据分析：根据流式细胞仪检测到的数据，进行数据分析，计算细胞凋亡率或凋亡指数等参数。
原来检测细胞增殖方法这么多(上)
原来检测细胞增殖方法这么多（上）细胞增殖是生物体内细胞数量增加的过程，它在生物体的生长、发育和组织修复中起着重要作用。
了解细胞增殖的情况对于研究细胞生物学、疾病发生机制以及药物筛选等方面具有重要意义。
为了检测细胞增殖，科学家们开发了多种方法，下面我们来详细介绍一些常见的方法。
1.细胞计数法细胞计数法是最常用的方法之一、其原理是通过直接计数细胞数量来间接反映细胞增殖情况。
常用的细胞计数方法包括显微镜计数法、细胞计数仪计数法以及细胞荧光染色等。
由于该方法简单易行，所需设备成本较低，因此得到了广泛应用。
2.MTT法MTT（3-（4,5-二甲基-2-噻唑唑-2-基）-2,5-二苯基-2H-四氮呋喃）法是一种间接测定细胞增殖的方法。
该方法基于细胞内的线粒体还原能力，用MTT试剂测定细胞培养物中细胞数量的变化。
MTT在细胞的活性线粒体内被还原成可溶于甲酸的紫色结晶形式（formazan），通过溶解结晶后的产物并通过分光光度计测定其吸光度，可以间接反映细胞增殖情况。
3. BrdU法BrdU（5-溴-2'-脱氧尿苷）法是一种直接测定细胞增殖的方法。
这种方法利用BrdU可以与细胞DNA中的脱氧胸腺嘧啶（dT）发生共价结合的特性，通过检测与BrdU结合的抗体标记来间接测定细胞增殖。
细胞在培养的过程中，加入BrdU，在细胞进行DNA合成时，BrdU会被引入到新合成的DNA链中。
接着，使用BrdU抗体进行染色，通过测定标记的BrdU数量可以判断细胞增殖情况。
K-8法CCK-8（Cell Counting Kit-8）法是一种使用水溶性杂环化合物的方法。
CCK-8试剂可以通过被细胞内的线粒体还原而变成可溶于水的有色产物。
通过测量CCK-8产生的颜色的光密度，可以间接反映细胞增殖情况。
相比于MTT法，CCK-8法的灵敏度更高、操作更简便。
除了上述方法之外，还有其他一些常用的细胞增殖检测方法，如流式细胞仪技术、荧光定量PCR、细胞增殖标记同位素示踪法等。
细胞增殖的检测方法和指标
细胞增殖的检测方法和指标
细胞增殖是生物体生长和发育的重要过程，也是许多疾病发展的关键环节。
为了检测细胞增殖，科学家们使用了多种方法和指标来评估细胞的增殖情况。
以下是一些常用的方法和指标：
1. 细胞计数，最直接的方法是通过显微镜观察和手动计数细胞数量。
这种方法简单直观，但是需要耗费大量时间，并且容易受到操作者主观因素的影响。
2. MTT（甲基噻唑蓝）法，MTT法是一种常用的细胞增殖检测方法，通过将MTT溶液加入培养皿，细胞内代谢活跃的细胞将MTT 还原成紫色的甲基噻唑蓝结晶沉淀，从而间接反映细胞数量。
3. CCK-8法，类似于MTT法，CCK-8法也是通过检测细胞内代谢活性来评估细胞增殖情况，它的优势在于操作简便、结果稳定。
4. BrdU（溴脱氧尿苷）标记法，BrdU法是通过将BrdU加入培养基，使其被活跃的细胞摄取并与DNA结合，然后使用特定抗体检测BrdU标记的细胞数量，从而评估细胞增殖情况。
5. Ki-67抗原检测，Ki-67是一种细胞周期相关的核抗原，其在增殖期的细胞中表达较高。
因此，通过检测细胞中Ki-67的表达情况可以间接评估细胞的增殖能力。
除了以上提到的方法外，还有一些其他的细胞增殖检测方法，如细胞周期分析、细胞增殖相关基因的表达检测等。
这些方法可以从不同的角度全面评估细胞的增殖情况，有助于科学家们更全面地了解细胞增殖的机制和调控。
在实际应用中，科学家们通常会根据具体的研究目的和条件选择合适的方法和指标来进行细胞增殖的检测和评估。
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。
用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。
但是具有放射性。
2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。
CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。
例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。
用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。
由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。
其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。
细胞凋亡常见的检测方法
细胞凋亡常见的检测方法
细胞凋亡常见的检测方法包括：
1. 细胞形态观察：细胞凋亡时，细胞会出现形态改变，如细胞体积减小、细胞核变小、细胞膜起泡等，可以通过显微镜观察细胞形态的改变来判断细胞是否发生凋亡。
2. 核染色观察：通过核染色技术，如单染色或双染色，可使用碘化丙啶、DAPI等荧光染料或Giemsa染色等方法，观察细胞核的形态和染色情况，从而判断细胞是否发生凋亡。
3. DNA损伤分析：通过DNA断裂、破碎等损伤的检测方法，如凝胶电泳分析、单细胞凝胶电泳分析、TUNEL染色等，可以检测细胞DNA的完整性，判断细胞是否发生凋亡。
4. 细胞膜的磷脂外翻：通过荧光标记磷脂的外露，如荧光标记的Annexin V结合细胞膜上翻暴露的磷脂，可以评估细胞凋亡程度。
5. 细胞色素C的释放：细胞凋亡时，线粒体膜破裂导致细胞色素C的释放，可以通过免疫荧光染色或Western blot等方法检测细胞色素C的定位及含量，来判断细胞是否发生凋亡。
6. caspase酶活性检测：Caspase酶是细胞凋亡过程的关键执行酶，通过检测Caspase活性、测定Caspase相关蛋白的水解活性，如Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等，可以判断细胞是否发生凋亡。
7. Annexin V/PI染色：通过Annexin V与细胞膜外露的磷脂结合，并使用胞内核酸染料PI进行双染色，可以实现对活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞的区分和定量。
细胞凋亡与增殖的原位检测
荧光染料Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜， 使其染上低蓝色，而凋亡细胞的膜通透性增强，因 此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞 的多，荧光强度要比正常细胞中要高，此外，凋亡 细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染 料能更有效地与DNA结合，并且凋亡细胞膜上的 p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使 凋亡细胞的蓝色荧光增强。
结果观察
细胞体积缩小及变形；核浓染及丧失亚形态结 构，可见核染色质呈新月形，或核碎裂成大小 不等核碎片；在组织学切片中可见巨噬细胞或 邻近的上皮细胞吞噬凋亡细胞或凋亡小体的现 象。
凋亡小 体
Hoechst 33342染色
一．期细胞核呈波纹状 （rippled）或呈折缝样 （creased），部分染色质 出现浓缩状态；
原位测定细胞增生活性所测的结果都可 定量表示，大大避免了主观因素的影响， 成为定量病理学的重要组成部分。
PART ONE
各种方法相关性的比较研究表明核分裂 像计数、Ki67 LI、PCNA LI及AgNORs 计数等之间均有明显的相关性。
如果您的实验室暂时尚不具备现代实验条 件．只要有显微镜，只要您能准确识别核 分裂像，只要能避免那些影响重复性的因 素，在创新思想的设计下，即便使用最简 单的方法，也可取得有意义的结果。
（2）染色方法
可采用常规的组织学染色方法，如苏木素-伊红染 色，特殊染色如甲基绿-派诺宁染色、 Giemsa染 色。
二．采用荧光染料 Hoechst33342和Hoechst33358 DAPI （4’，6’—diamidino-2-
henylindole） PI （propidium iodide）
如何在组织中检测细胞增殖分化和凋亡
如何在组织中检测细胞增殖分化和凋亡在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡是研究细胞生物学、组织学和疾病发展的重要课题。
本文将介绍一些常用的方法和技术来检测这些细胞生理过程，包括免疫组化、细胞增殖标记、细胞凋亡检测和分化指标。
一、免疫组化方法免疫组化是一种常用的方法，可用于检测特定蛋白在组织中的表达。
该方法通过对细胞或组织片进行抗体染色，来检测目标蛋白的存在和定位。
在细胞增殖方面，可以使用细胞增殖标记抗体，如Ki-67和PCNA等，来标记正在活跃增殖的细胞。
对于分化指标，可以使用特定抗体来检测目标蛋白在细胞中的表达程度。
细胞凋亡方面，可通过检测凋亡标志蛋白，如Caspase家族成员和Bcl-2家族成员等，来确定凋亡的发生。
二、细胞增殖标记细胞增殖标记是一种直接或间接标记增殖细胞的方法。
直接标记方法包括DNA染料（如荧光素-丙酮酸乙酯和乙溴脱氧尿嘧啶等）、核素标记（如3H-thymidine）和基于蛋白的标记（如30-ku小鼠脾球蛋白）。
间接标记方法则是通过检测增殖相关蛋白，如PCNA等，来获得增殖细胞的信息。
这些方法可以通过显微镜、流式细胞术和放射自显影等技术来检测增殖细胞的数量和活性。
三、细胞凋亡检测方法细胞凋亡检测是评估细胞凋亡程度和机制的关键方法。
一种常用的方法是荧光染料双染色，如使用荧光素-乙酸酯（FITC）标记的 Annexin V和 PI（碘化孟松多聚物）。
Annexin V 能够结合磷脂酰丝氨酸（PS），这是凋亡时胞膜翻转的产物，而PI则用于区分凋亡和坏死细胞。
通过流式细胞术或荧光显微镜观察染色的细胞，可以准确检测到凋亡细胞的存在。
四、分化指标检测细胞分化的评估可以使用特定的抗体或染料来检测分化标志物在细胞中的表达。
例如，对于神经元的分化，可以使用抗神经元特异性抗体，如βIII-Tubulin、Neurofilament和MAP2等。
对于其他类型的细胞，也可以使用相应的特异性抗体或染料来检测。
细胞增殖、活化、杀伤检测方法_解释说明以及概述
细胞增殖、活化、杀伤检测方法解释说明以及概述1. 引言1.1 概述细胞增殖、活化和杀伤是细胞生物学研究中的重要课题。
随着科技的不断进步，人们对细胞行为的了解也越来越深入。
在许多领域，如医学、生物工程和药物研发等，准确检测细胞的增殖、活化和杀伤情况至关重要。
细胞增殖是指细胞数量的增加过程，在生理和病理状态下都会发生。
了解细胞增殖速度不仅可以帮助我们了解细胞生长的规律，还可以评估某些疾病如癌症的发展程度。
因此，开发可靠且准确测量细胞增殖的方法是非常关键的。
细胞活化是指刺激后细胞内代谢水平的提高。
对于一些需要评估生物材料耐受性或测试新药剂对细胞外治疗效果时，准确测定细胞是否被有效激活至关重要。
细胞杀伤是通过某种方式使得部分或全部细胞死亡。
在免疫学、毒理学等领域中，准确检测细胞杀伤效果可以帮助我们评估药物或其他物质对细胞的影响程度。
为了解决这些问题，科学家们开发了多种方法来检测细胞的增殖、活化和杀伤情况。
本文的目的是对这些方法进行详细的解释说明，并概述它们各自的优势和局限性。
1.2 文章结构本文按照以下结构展开：首先是引言部分，介绍了文章涉及的主题和目的；接下来将分别详细介绍细胞增殖、活化和杀伤检测方法；最后对各种方法进行比较，总结研究结果并展望未来的研究方向。
1.3 目的本文的目的是提供一个全面而清晰的概述，使读者能够了解不同的细胞增殖、活化和杀伤检测方法。
通过详细讨论每种方法的原理、应用范围以及其优缺点，读者可以选择适合自己研究目标和实验条件的最佳技术。
此外，本文还将对未来的研究方向进行展望，以促进该领域更深入且有针对性的探索和发展。
2. 细胞增殖检测方法细胞增殖是指细胞通过分裂和繁殖产生新的细胞的过程。
在许多研究领域，如药物筛选、癌症治疗和组织工程等，准确评估细胞增殖能力至关重要。
本节将介绍几种常用的细胞增殖检测方法。
2.1 细胞计数法细胞计数法是最传统也是最常用的一种细胞增殖检测方法之一。
该方法通过显微镜下观察并手动计数已经增殖的细胞数量来评估细胞的增长情况。
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一--PI法
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法schoman无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。
主要操作步骤如下：1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。
2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。
3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。
4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h。
5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。
注意事项：1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。
如组织难以消化，可加入适量胶原酶。
另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。
2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。
3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。
4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。
其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。
在此不赘述。
yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA 结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。
应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。
细胞增殖凋亡检验方法汇总
细胞增殖、凋亡-检测方法汇总1.直接计数法面单粗暴、傻瓜式的检查方法！利用计数板或计数仪得出细该数目•然后对数目逬行比较。
方法需要对不同时间原的细胞分别固定•而后在光疑下计数,可绘制出细胞生长曲线。
而具不足之处在于无法区分壇蓿细胞与非增殖抵胞，下适合样品奴星參和评估特定亚群的情况。
2「H・TdR渗入法OH腺龜碇核百(TdR )是DNA持有的滅基「也是DNA合成的必需物氐用同位素中标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体渗入DNA合成代谢过程,通过液体闪烁计数器可迴走细胞的放射性强虐，间接放映出细胞增殖情况。
该方法优点在于敏感性高”客观性强,盍每性好.但是爲要一走设备集件，也存在放时性核素污染问题。
3、Brdu/EdU检测法Brdu&EdU均是胸腺嚅睫的衍生物r均可代替胸腺嚅噪在DNA合成期掺入细胞中。
不同的是J Brdu检测法可利用B「du专性抗体和具他細胞标记物对细'进行双重染色,可判断増殖细胞的种类及増殖速度，不仅适用于体外实验也能用于活体实验。
这个方法最大的缺点需要变性DNA才能与抗体结合,破坏了DNA双链结构r导致染色弥散、准确性降低等问题。
EdU检测法则基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性r适用于细胞増殖、细胞标记示踪筈方IEI的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。
EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500,®田胞内很容易就扩散,无需DNA变性。
rdU与EdU检测优缺点综合比较BrdU EdU 检测分子大很小检测方式免疫反应化学反应影响其他标记是否DNA变性需要不需要实验时间过夜 2.5小时检测灵敏度一般灵敏4、WITT检测法&CCK8检测法MTT检测法反映细胞的能臺代谢「是检测细胞増殖活力的一种简便准确方法°其原理是在活纟田胞生长和增殖过程中,线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解为蓝紫色的水不溶性的甲瓒(Formazan ),并沉积在细胞中(死细胞无此功能。
细胞增殖 检测方法
细胞增殖检测方法
细胞增殖是指细胞数量的增加。
检测细胞增殖可以通过多种方法，其中常用的方法包括：
1. 细胞计数：使用显微镜观察细胞培养物中的细胞数量，并通过计数来得出细胞增殖情况。
2. 晶紫染色法：晶紫染色可以染色细胞核，通过观察染色后细胞数量的增加来判断细胞增殖情况。
染色后的细胞可以在显微镜下观察，并可以使用图像处理软件进行图像分析。
3. DNA含量分析：细胞增殖时DNA含量也会增加，可以通过荧光染料如荧光素琥珀酰胺（Propidium Iodide）染色，使用流式细胞仪来分析DNA含量。
4. 噻吩蓝染色法（MTT法）：MTT法使用噻吩蓝（MTT）染料可以评估细胞活性和增殖能力。
活细胞将MTT染料转化为紫色的内盐，通过溶解细胞并测量溶液的吸光度来确定细胞增殖情况。
5. 细胞增殖标记物：细胞增殖标记物如脱氧尿苷（BrdU）或5-乙酰基-2'-脱氧尿苷（EdU）可以被细胞吸收并集成到新合成的DNA中。
这样，在染色时可以使用抗-BrdU或抗-EdU抗体染色，并通过观察标记物阳性细胞的数量来评估细胞增殖情况。
以上方法都可以用于检测细胞增殖情况，选择适合实验需求的方法进行研究。
需要注意的是，不同的方法可能具有不同的准确性和敏感性，因此在实验设计和数据分析过程中需要谨慎操作。
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在组织中检测细胞增殖、分化与凋亡得方法一、检测细胞增殖得方法(1)直接方法:通过直接测定进行分裂得细胞来评价细胞得增殖能力1、胸腺嘧啶核苷(3H-ＴｄR)渗入法胸腺嘧啶核苷(TdR)就是ＤNA特有得碱基,也就是DＮＡ合成得必需物质、用同位素３H 标记TdＲ即3H—TdR作为ＤNA合成得前体能掺入DAN合成代谢过程,通过测定细胞得放射性强度,可以反映细胞DＡN得代谢及细胞增殖情况。
但就是具有放射性、2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CＦＳE)检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(ＣFＳE)就是一种可穿透细胞膜得荧光染料,具有与细胞特异性结合得琥珀酰亚胺脂基团与具有非酶促水解作用得羟基荧光素二醋酸盐基团,使ＣFＳE成为一种良好得细胞标记物。
ＣFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内得氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时,CＦsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度就是亲代细胞得一半。
这样,在一个增殖得细胞群中,各连续代细胞得荧光强度呈对递减,利用流式细胞仪在48８nm激发光与荧光检测通道可对其进行分析、3、Ｂｒdu检测法Brｄｕ中文全名５—溴脱氧尿嘧啶核苷,为胸腺嘧啶得衍生物,可代替胸腺嘧啶在DＮＡ合成期(S期),活体注射或细胞培养加入,而后利用抗Brdu单克隆抗体,IＣＣ染色,显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物,双重染色,可判断增殖细胞得种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义４、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中,而非增值细胞缺乏这些抗原,您也可以通过特异性得单抗来对细胞增殖进行检测、例如,在人体细胞中,Ki—６7抗体识别同名蛋白,在细胞周期S期、G2期与M期表达,而在Ｇ0期与Ｇ1 期(非增殖期)不表达、用针对Ki-６7蛋白得单抗就可以检测细胞得增值情况、由于需要组织切片,这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受癌症研究者们得青睐,因为它能够用来检测体内肿瘤细胞得增殖。
其她普遍使用得细胞增殖或细胞周期调控标志还包括,增殖细胞核抗原PCＮA、拓扑异构酶IIB与磷酸化组蛋白H3。
(2)间接方法:通过检测样品中健康细胞得数目来评价细胞得增殖能力１、MTT检测法MTT检测法主要反映细胞得能量代谢,就是检测细胞增殖活力得一种简便准确得方法,其原理就是在活细胞生长与增殖过程中,线粒体内得脱氢酶可将黄色得MTT分解成兰紫色得甲(Foｒmazａn),生成得甲量得多少与细胞得数量与细胞得活力成正比。
2、ATP检测细胞内得ATＰ含量受到了严格调控,检测ＡTP也可以得到细胞增殖得信息。
死亡细胞或即将死亡得细胞几乎不含ATP,在细胞溶解物或提取物中测得得ATP浓度与细胞数之间存在严格得线性关系。
利用荧光素酶ｌuｃifeｒaｓｅ及其底物荧光素lucｉferin得ＡＴＰ检测以生物发光为基础,能够为您提供非常灵敏得结果。
如果有ATＰ存在荧光素酶就会发光,而且其发光强度与ＡＴP浓度成正比,用能读取发光信号得光度计与酶标仪都可以方便得进行检测。
这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测与筛选。
二、检测细胞分化得方法1、流式鉴定细胞表面标志,以判断细胞就是否分化2、观察细胞形态,与已分化得细胞进行对比3、分化诱导评估其分化能力三、检测细胞凋亡得方法(1)形态学检测1、光学显微镜与倒置显微镜染色细胞:凋亡细胞得染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状与凋亡小体等典型得凋亡形态。
常用染色方法:①苏木精=伊红染色②甲基绿-派诺宁染色:与坏死相比,细胞凋亡得细胞内常有RＮＡ表达得增强,用甲基绿特异性染色DNA,派诺宁对RＮA亲与力强,若胞质呈派诺宁阳性为凋亡,阴性为坏死。
(前提就是已经判断细胞处于死亡形态,通过形态学判断)③吖啶橙染色法:。
它与细胞中DNA与ＲNＡ结合量存在差别,可发出不同颜色得荧光,与ＤNA结合量少发绿色荧光,与RＮA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。
该染料具有膜通透性,能透过细胞膜,使核DNA与RNA染色。
因此,在荧光显微镜下观察,吖啶橙可透过正常细胞膜,使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光;在凋亡细胞中,因染色质固缩或断裂为大小不等得片断,形成凋亡小体。
吖啶橙使其染上致密浓染得黄绿色荧光,或黄绿色碎片颗粒;而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失、吖啶橙染液有毒,操作时要戴手套,需避光、(凋亡小体)2、荧光显微镜与共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质得形态学改变为指标来评判细胞凋亡得进展情况。
常用得DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoｅｃhst 3３342),HO 3３258 (Hoｅchｓt 332５8), ＤAPI、三种染料与DNA得结合就是非嵌入式得,主要结合在DNA得Ａ－Ｔ碱基区、紫外光激发时发射明亮得蓝色荧光。
Hoeｃhst就是与DNＡ特异结合得活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ｍl得浓度,使用时用ＰBＳ稀释成终浓度为2～5ｍg/ml、DAPＩ为半通透性,用于常规固定细胞得染色。
储存液用蒸馏水配成1mg/ml得浓度,使用终浓度一般为0、5 ~1mｇ／ｍl。
结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质得形态学改变分为三期:Ⅰ期得细胞核呈波纹状(ｒippleｄ)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核得染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期得细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(如图)。
３、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。
凋亡Ⅰ期(pro—apｏpｔosiｓｎuclei)得细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(caｖiｔatｉonｓ)得空泡结构(如图);Ⅱa期细胞核得染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡得晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。
(2)检测凋亡标记物质1、磷脂酰丝氨酸外翻分析(AｎnexiｎV法)磷脂酰丝氨酸(Phｏｓphaｔidylserine, PS)正常位于细胞膜得内侧,但在细胞凋亡得早期,PS可从细胞膜得内侧翻转到细胞膜得表面,暴露在细胞外环境中(图3)、Annexiｎ—Ｖ就是一种分子量为35～３6KD得Cａ2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PＳ高亲与力特异性结合。
将Annexin—V进行荧光素(FITＣ、PE)或bｉotin标记,以标记了得Aｎｎexin－Ｖ作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡得发生、碘化丙啶(ｐropｉdine ioｄiｄe, PＩ)就是一种核酸染料,它不能透过完整得细胞膜,但在凋亡中晚期得细胞与死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染、因此将Annexｉn－Ｖ与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期得细胞以及死细胞区分开来。
２、线粒体膜势能得检测线粒体在细胞凋亡得过程中起着枢纽作用,多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同得细胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位得下降,被认为就是细胞凋亡级联反应过程中最早发生得事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、ＤＮA断裂)出现之前,一旦线粒体DYmt崩溃,则细胞凋亡不可逆转。
线粒体跨膜电位得存在,使一些亲脂性阳离子荧光染料如Ｒhｏｄａmiｎe 12３、３,3—Diｈｅxyloｘaｃarbｏcyanｉne ｉｏdiｄe［DｉOC6(３)]、Teｔrechｌｏrｏ—tｅtraethyｌbenzimidaｚol carbocyanｉne ｉodidｅ［JC—1］、Tetrameｔhyl rｈｏdamine methyl ester(TMRＭ)等可结合到线粒体基质,其荧光得增强或减弱说明线粒体内膜电负性得增高或降低。
将正常培养得细胞与诱导凋亡得细胞加入使用终浓度为Rhodamｉne 123(1mM)或终浓度为DiOC6(25nＭ),JＣ—１(１mM),TMRＭ(1０0nM),３7°Ｃ平衡３0mｉn,流式细胞计检测细胞得荧光强度。
3、TUNＥL法细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量得粘性3＇—ＯH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)得作用下,将脱氧核糖核苷酸与荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成得衍生物标记到DNA得3'－末端,从而可进行凋亡细胞得检测,这类方法(称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导得缺口末端标记法(termｉnal －deoｘynucleｏｔｉdyｌｔrａnsferase mediated nｉck enｄlａｂeｌing, TUNEL)。
由于正常得或正在增殖得细胞几乎没有DＮＡ得断裂,因而没有3'—OH形成,很少能够被染色。
TUNＥL实际上就是分子生物学与形态学相结合得研究方法,对完整得单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型得生物化学与形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养得细胞与从组织中分离得细胞得细胞形态测定,并可检测出极少量得凋亡细胞,因而在细胞凋亡得研究中被广泛采用、(3)ＤNA片断化检测１、大分子染色体DNA片段得测定细胞凋亡得早期,染色体断裂成为５0~3０0 kbp长得DＮA大片段、所有超过一定分子量大小得双链DNA分子在琼脂糖凝胶中得迁移速度相同。
线性DNA得双螺旋半径超过凝胶半径时,即达到分辨力得极限。
此时凝胶不再按分子量得大小来筛分DＮA,ＤＮＡ像通过弯管一样,以其一端指向电场一极而通过凝胶,这种迁移模式称之为"爬行”。
因此,细胞凋亡早期产生得5０～3０0 kbp长得ＤＮA大片段不能用普通得琼脂糖凝胶电泳来分离。
通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。
这个方法就是在凝胶上外加正交得交变脉冲电场。
每当电场方向改变后,大得DNA分子便滞流在爬行管中,直至新得电场轴向重新定向后,才能继续向前移动。
DNA分子量越大,这种重排所需要得时间就越长、当DNA分子变换方向得时间小于电脉冲周期时,DＮA就可以按其分子量大小分开。
２、ＤNＡLaddeｒ测定细胞凋亡时主要得生化特征就是其染色质发生浓缩, 染色质ＤNA在核小体单位之间得连接处断裂, 形成5０～3０0 kbp长得DＮA大片段, 或180～200 bp整数倍得寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DＮA ｌaｄder)。
细胞经处理后,采用常规方法分离提纯ＤNA,进行琼脂糖凝胶与溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型得ＤＮA ｌadder、如果细胞量很少,还可在分离提纯ＤＮＡ后,用32Ｐ-ＡTP与脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdＴ)使DNA标记,然后进行电泳与放射自显影,观察凋亡细胞中ＤNA ladder得形成。
３、凋亡细胞ＤNA含量得流式细胞计分析(4)Caspａse—3活性得检测Caspａse家族在介导细胞凋亡得过程中起着非常重要得作用,其中cａsｐase-3为关键得执行分子,它在凋亡信号传导得许多途径中发挥功能。
Ｃaｓpase－３正常以酶原(32KD)得形式存在于胞浆中,在凋亡得早期阶段,它被激活,活化得Casｐase—3由两个大亚基(17KD)与两个小亚基(12ＫD)组成,裂解相应得胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。