分子生物学实验

琼脂糖凝胶的分辨率
凝胶浓度 0.5%
0.8% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%
分辨率（分离范围） 1,000-30,000 bp
800-12,000 bp 500-10,000 bp 400-7,000 bp 200-3,000 bp 100-1,500 bp
应用 未消化的基因组DNA
消化的基因组 DNA 质粒 DNA PCR产物和质粒 DNA PCR产物和质粒 DNA PCR产物
用primer5.0进行设计
下面复制我们需要的DNA序列到primer软件中。 1、打开primer5.0，点击File，New，DNASequence。
用primer5.0进行设计
2、把我们在NCBI上找的DNA序列粘贴进去（ctrl+v）。选择As Is，点击ok。
用primer5.0进行设计
实验内容
3、轻弹离心管混匀，低速离心收集，放于PCR热循环仪上，执行 以下程序： 94℃，3min； 94℃，30sec 48℃，40sec 32 cycles 72℃，60sec 72℃，10min； 4℃，forever 4、将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，与基因全长进行比 对。
DNA的PCR扩增
PCR技术的原理：聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction），简称PCR， 由Mullis于1985年创立，1987年获得专利， 1989年被美国著名《science》杂志列为十 项重大科技发明之首，1993年获诺贝尔化 学奖。如今，PCR技术已成为分子克隆工作 中必备的基本技术之一，并广泛渗透到医学 分子基因诊断、法医、考古学等诸多领域。 可以说PCR技术的发明给整个生命科学都带 来了一场革命，同时也为目的基因的快速克 隆提供了一种非常有效的手段。PCR的基本 原理如图所示。
CTAB法的原理
CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)十六烷基 三甲基溴化铵是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， 它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(≥0.7mol／L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3mol ／L NaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将 CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙 醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇随之被除去。
【操作步骤】
1、从NCBI中获取目的片段 2、用primer5.0进行设计
从NCBI中获取目的片段
1：登陆美国国立生物技术公信息中心（NCBI National center for biotechnology information ）网站， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。点击搜索框，输入你需要 查找的种名。点击search。
基因克隆特异PCR引物的设计
实验目的： 掌握PCR引物设计的基本原理
学习primer5.0的使用方法
实验原理
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷 酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时 应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这 个区域单链能形成二级结构，就要避开它。不要有聚 嘌呤或聚嘧啶存在。否则引物设计的就不合理。应重 新寻找区域设计引物。引物确定以后，可以对引物进 行必要的修饰，但3′端绝对不能进行任何修饰，因 为引物的延伸是从3′端开始的。
琼脂糖凝胶的染色与观察
琼脂糖Hale Waihona Puke Baidu胶的染色与观察
琼脂糖凝胶的染色与观察
根据电泳后DNA条带的相对位置，可以估计出DNA的大小。 我们可以在DNA样品电泳的同时，在相邻泳道加入DNA分子 量标准物，即所谓的“DNA Marker”。DNA Marker在凝胶中 电泳后呈现出多个DNA条带，每个DNA条带有着固定的长度， 这样根据目的DNA条带与Marker中DNA条带的相对位置，就 可以方便地估计出目的DNA的大小
试剂盒提取的主要步骤
基因组DNA的琼脂糖电泳检测 实验原理 实验设备及药品 实验内容
实验原理
DNA在琼脂糖凝胶中的电泳，涉及电荷效应 和分子筛效应。
1、电荷效应
在微碱性的电泳缓冲液中，DNA分子中的磷 酸基因发生解离，带有电量的负电荷，能在电
场中向正极迁移，这就是所谓的“电荷效应”。
实验原理
从NCBI中获取目的片段
2：在出现的新的界面中找到Genomes，在这个门类下找到 Nucleotide，进入另一界面。
从NCBI中获取目的片段
3：在出现的新的界面中查找你所需要的基因序列，进入另一界 面。
从NCBI中获取目的片段
4：找一篇点进去即可看到DNA序列。
用primer5.0进行设计
实验设备及药品
移液器，枪头，水 平凝胶电泳槽，稳 压电泳仪，微波炉， 250ml三角瓶 琼脂糖，0.5×TBE （0.025mol/L Tris-硼 酸 0.001mol/L EDTA 采用无菌水溶解混 匀，溶液体积为1L）， 6×DNA Loading Buffer。
实验内容
（1）1%琼脂糖凝胶的制备：称取0.2g琼脂糖 于250mL三角瓶中，加入20mL 0.5×TBE电泳 缓冲液，微波炉加热约1min使之溶解，然后拿 出观察是否有油状物，有则再次加热30s，等其 完全溶解拿出。加入2μLGelStain（10000×） 染色液，倒入制胶板，完全冷却后，拔出梳子， 形成完整的加样孔，置于电泳缓冲液中。 注意：①微波炉加热时防止溶液沸腾溢出；
PCR引物的设计原则
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异 性。 产物不能形成二级结构。 引物长度一般在15~30碱基之间。 G+C含量在40%~60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物5′端可以修饰。 引物3′端不可修饰。 引物3′端要避开密码子的第3位。
2、分子筛效应 由于一定浓度的琼脂糖凝胶具有一定的孔径大小，不
同分子量大小的DNA分子，在凝胶中迁移时受到的
空间位阻是不同的，分子量小的DNA分子，受到的
空间位阻小，在凝胶中的迁移速度快，而分子量大的
DNA分子，所受到的空间位阻大，在凝胶中的迁移 速度就慢，这样经过一定时间的电泳，不同分子量大 小的DNA分子就得以分离，这就是所谓的“分子筛 效应”。
用primer5.0进行设计
6、点击1发现Hairpin、Dimer、False Priming和Cross Dimer 都没有找到，说明这个符合要求。
用primer5.0进行设计
6、点击2发现Hairpin、Dimer出现了Found说明这个不符合要求， 我们要符合要求的。
用primer5.0进行设计
（3）电泳：在1×TBE电泳缓冲液中，120V电泳30min。
（4）紫外灯下观察Marker条带和提取的DNA条带，照 相，记录下DNA条带的相对位置关系，分析实验结果。 注意：
①紫外线会损伤皮肤和眼睛，操作时可用有机玻璃板挡 住；
②如果要从凝胶中回收DNA条带，紫外线照射时间不宜 过长，以免打断DNA。
②确保凝胶完全浸泡在电泳缓冲液中。
实验内容
（2）点样：取2μL DNA与1μLBuffer混匀，小 心加入加样孔内；并点2μL Marker作为对照。
注意：
①初次点样时手可能会抖动，可利用另一只 手作为支架； ②枪头探入加样孔即可，不要伸入加样孔以免 戳伤胶孔，导致样品渗漏。
实验内容
注意：正确连接正负极。
实验材料
仪器：PCR仪，EP管，移液器，枪头； 主要试剂：DNA，引物，无菌双蒸水， dNTP，2×Easy Taq SuperMix。
实验内容
1、稀释DNA：取5μL提取的DNA于1.5mlEP管中，加45μL的无菌 双蒸水，做成工作液。 2、选用适当量程的移液器与枪头，在0.2mL离心管中依次加入以下 成分（总体积10μL）： ddH2O 3.0 μL 引物 R 0.5 μL 引物 F 0.5 μL DNA 1.0 μL 2×Easy Taq SuperMix 5.0 μL
DNA的PCR扩增
PCR由三个基本反应组成（见图2）：①高 温变性（denaturation）：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成两条单链 DNA。②低温退火（annealling）：使温度 适当下降，引物与模板DNA中所要扩增的目 的序列的两侧互补序列进行特异性配对结合， 重新形成氢键。③适温延伸（extension）： 在Taq DNA聚合酶、4种dNTPs及Mg2+存在 下，引物3’端向前延伸，合成与模板碱基序 列完全互补的DNA链。以上变性、退火和延 伸便构成一个热循环，每一次循环的产物均 可作为下一次循环的模板，经过约25-30次 循环之后，也即经过数小时之后，介于两引 物间的目的DNA片段便可扩增105-107拷贝。
生物科学
分子生物学实验技术
分子生物学研究
植物基因组DNA提取
基因组DNA的琼脂糖电泳检测
分子实验的Primer设计 PCR扩增反应 PCR产物的电泳检测
DNA的提取和纯化
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实验目的
实验仪器及药品
实验步骤
实验目的
了解CTAB法抽提植物基因组DNA的原理； 熟悉分子生物学常用仪器设备的使用及常用试 剂的配制方法； 掌握植物基因组DNA的提取方法； 掌握真核生物基因组DNA分离和纯化方法； 了解不同染色体倍性生物基因组DNA的含量差 异。
实验仪器及药品
仪器：1.5mL离心管、水浴锅、研钵、研棒、离心 机、超净工作台、冰箱、移液枪、枪头、液氮 罐、高压灭菌锅等。 试剂：EasyPure Plant Genomic DNA Kit
实验步骤
Step 1 Step 2
Step 3
Step 4
细胞的 破碎
核酸的 纯化
核酸的 浓缩和 沉淀
核酸的 贮存
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适 的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA 序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特 异性与成功与否。要设计引物首先要找到 DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的 片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链 能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能 形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一 般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为 100~600碱基对。
琼脂糖凝胶的染色与观察
经过一段时间的电泳之后，不同分子量大小的DNA分子已经 相互分离，但是DNA分子在凝胶中无色无味，要想肉眼观察到， 就必须借助一定的染色技术，即采用EB（溴化乙锭）染色。EB具 有跟DNA中的碱基类似的平面结构，能够镶嵌到碱基对之间（见 图1）。在紫外灯的照射下，DNA所吸收的260nm的紫外光传递给 EB，以及EB本身在300nm、360nm吸收的射线，在可见光谱的红 橙区都将以590nm波长发射出来。这样，就能够在紫外灯下观察 到凝胶中DNA所在区域的条带（见图2）。 本实验用的是GelStain（10000×）染色液，有无毒的特点。
3、点击primer，出现一个新的窗口，点击search。
用primer5.0进行设计
4、选择PCR Primers，Pairs。PCR product Size尽量选择范围 大一点，Primer Length在20上下浮动就可以。点击ok。
用primer5.0进行设计
5、出现新窗口，点击ok。出现Search Results。Rating有100 最好。然后点击1、2、3、4等进行选择。
7、我们将所需要的引物序列记下来，可以发到专门的公司进行 引物制作。
DNA的PCR扩增
PCR技术具有快速、简便、灵敏等特 点，已被广泛地应用于分子生物学等各 个领域。本实验是对提取出的DNA进行 PCR扩增，反应后可以通过电泳检测片段 的扩增结果。通过此实验学习PCR反应的 基本操作步骤和实验原理。