小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化方法(详细版)
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法如下：
1. 获取巨噬细胞：常用的来源包括小鼠、人类等。
可以通过小鼠或者人类的骨髓、外周血或者器官（例如脾脏、肺）中分离巨噬细胞。
2. 细胞培养基的准备：常用的细胞培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）等。
细胞培养基需要加入适量的无菌胎牛血清（FBS）或者人工合成的替代物，例如脂质体。
3. 细胞的分离：将获得的组织样本经过适当的处理，例如组织碎片化、酶消化等，使细胞释放出来。
4. 细胞的培养：将分离得到的巨噬细胞悬浮于细胞培养基中，通过离心将巨噬细胞沉淀在培养皿的底部。
5. 进一步培养：将巨噬细胞培养在37C的恒温培养箱中，提供合适的氧气和二氧化碳浓度，适当转移和补充新鲜的培养基。
6. 细胞的检测和分离：通过显微镜观察巨噬细胞的形态和数量，也可以使用流式细胞仪等方法对细胞进行检测和分析。
这些是常规的巨噬细胞培养方法，具体操作细节可能根据实验目的和细胞来源的不同而有所变化。
巨噬细胞原代培养方法
一、实验材料准备1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。
2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。
碘酒绵球和酒精绵球。
3. 器械：一次性注射器、手术器械。
二、实验方法如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。
不采用刺激物，直接开始下面的步骤。
1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。
用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。
2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。
3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。
台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。
4. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 μL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。
用4度遇冷的1640培养基做，细胞在外面一直放在冰里。
三、结果巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。
巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。
小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法(超详细~)
小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法（超详细）
实验前准备：
超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、2.5mL注射器、细胞吸管、3％肉汤淀粉溶液、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、细胞计数版、倒置显微镜等。
实验操作步骤
（1）我们对健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3％肉汤淀粉溶液1 mL，持续3d，以便刺激腹腔巨噬细胞产生。
注：3％肉汤淀粉溶液提前配制，高温除菌后使用。
（2）小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒。
（3）固定小鼠，暴露腹腔。
（4）无菌条件下用剪刀沿腹中线剪开皮肤，暴露腹膜，切记勿伤及腹膜壁。
（5）向腹膜腔注射DMEM培养基3mL，并轻柔小鼠腹部片刻。
（6）用吸管反复冲洗腹膜腔并回收灌洗液。
（7）移入无菌的10ml的离心管中，以1000r/min，离心 5min，弃上清液。
（8）加入 5ml DMEM 培养基重悬细胞，上述步骤重复两次。
（9）加入含有10% FBS的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×106 个/mL。
（10）将细胞悬液接种于 6 孔培养板中，放于37℃、5％二氧化碳
饱培养箱中培养，待后续实验研究。
小鼠骨髓细胞提取及培养
小鼠骨髓细胞的提取1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。
2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。
3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。
4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。
5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。
6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。
轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。
7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。
8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。
9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。
10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。
骨髓细胞的培养1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。
2、按照24孔板每个孔2-2.5million的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。
3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。
4、培养BM细胞的培养基是按照90% GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。
5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。
注意：1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都要保证无菌。
2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。
3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的，避免交叉污染。
小鼠 肿瘤相关巨噬细胞提取
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小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
巨噬细胞分离方法[汇总]
![巨噬细胞分离方法[汇总]](https://img.taocdn.com/s3/m/6ebbd0e54793daef5ef7ba0d4a7302768e996f76.png)
一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。
腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。
3～4天以后收集腹腔细胞。
2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。
放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。
消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H（含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。
轻轻按摩腹部5分钟。
3．以下均无菌操作。
剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。
合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。
二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。
仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。
以下过程注意无菌操作。
小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。
用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。
2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。
向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。
用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。
再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。
3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。
平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。
巨噬细胞诱导实验报告
一、实验目的1. 了解巨噬细胞的生物学特性及其在免疫反应中的作用。
2. 掌握巨噬细胞的诱导方法及实验操作技术。
3. 观察巨噬细胞的吞噬功能，评估其免疫活性。
二、实验原理巨噬细胞是一种具有吞噬功能的免疫细胞，主要来源于骨髓中的单核细胞。
在体外实验中，通过诱导剂如脂多糖（LPS）等刺激单核细胞分化为巨噬细胞。
巨噬细胞在免疫反应中发挥重要作用，如吞噬、活化T细胞、分泌细胞因子等。
本实验旨在通过诱导单核细胞分化为巨噬细胞，观察其吞噬功能，评估其免疫活性。
三、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠2. 试剂与耗材：胎牛血清（FBS）、RPMI-1640培养基、LPS、PBS、无菌操作台、超净工作台、显微镜、细胞培养皿、移液器、细胞计数板等。
四、实验方法1. 诱导巨噬细胞：取昆明小鼠，无菌操作下取脾脏，制成单核细胞悬液。
加入RPMI-1640培养基，调整细胞浓度为1×10^6/ml。
将细胞悬液加入培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24小时。
2. 诱导分化：向培养皿中加入适量LPS，使终浓度为10μg/ml。
继续培养24小时，使单核细胞分化为巨噬细胞。
3. 巨噬细胞培养：将诱导后的细胞悬液转入新的培养皿中，加入FBS至10%，继续培养24小时。
4. 巨噬细胞吞噬实验：取鸡红细胞，用生理盐水洗涤后制成红细胞悬液。
将鸡红细胞悬液与巨噬细胞悬液按一定比例混合，置于37℃、5%CO2培养箱中培养30分钟。
5. 吞噬实验观察：取出培养皿，加入适量的戊二醛固定细胞，用PBS洗涤。
在高倍显微镜下观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况，计数吞噬细胞数量。
五、实验结果1. 巨噬细胞形态：诱导后的细胞呈圆形或多边形，细胞质丰富，细胞核明显。
2. 吞噬实验结果：在高倍显微镜下观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，吞噬细胞数量与对照相比明显增加。
六、实验分析本实验成功诱导了小鼠脾脏单核细胞分化为巨噬细胞，并观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
小鼠骨髓细胞提取及培养
小鼠骨髓细胞提取及培养小鼠骨髓细胞的提取1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。
2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。
3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。
4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。
5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。
6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。
轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。
7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。
8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。
9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。
10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。
骨髓细胞的培养1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。
2、按照24孔板每个孔的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。
3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。
4、培养BM细胞的培养基是按照90% GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。
5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。
注意：1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都要保证无菌。
2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。
3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的，避免交叉污染。
小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定
小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定[摘要] 目的建立小鼠三种不同部位巨噬细胞体外分离培养的方法，并对其进行鉴定。
方法分别从小鼠腹腔、脾脏、骨髓中分离获取巨噬细胞，经台盼蓝染色计数后于含10%胎牛血清的DMEM培养液、1%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养；通过活细胞形态观察；HE 染色光镜观察；吞噬鸡红细胞功能检测；酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。
结果获得高纯度的巨噬细胞，具有巨噬细胞的形态特征，具备良好的吞噬功能，鸡红细胞吞噬率分别为腹腔94.68%，脾脏92.47%，骨髓93.11%；酸性磷酸酶染色阳性率为腹腔89.43%，脾脏85.21%，骨髓88.55%；α-醋酸奈酚酯酶染色阳性率为腹腔85.32%，脾脏81.81%，骨髓85.76%。
结论小鼠三个不同部位均可简便实用的分离出巨噬细胞，可以满足不同的研究目的。
巨噬细胞不仅是许多病原体的宿主细胞,而且在先天性和后天性免疫应答过程中起着关键性作用[1-3],比如调节促炎和抗炎细胞因子的释放、吞噬或杀死胞内微生物和肿瘤细胞、降解和提呈抗原等。
它还可以与其他免疫细胞协同发挥更大的功能，比如树突状细胞、粒细胞、NK细胞和T细胞等。
小鼠巨噬细胞吞噬作用是反映机体非特异性免疫功能的主要指标，也是临床免疫学实验常用的方法之一。
现将已有的巨噬细胞分离方法改进，从3种不同部位分离小鼠巨噬细胞，并做以对比。
1 材料与方法1.1主要试剂和仪器DMEM培养基（Hyclone）；RPMI-1640培养基（GIBCO）；胎牛血清（GIBCO）；倒置显微镜（Olympus）；CO2培养箱（Binder，Thermo）。
1.2 从小鼠腹腔中分离巨噬细胞（1）取6~8周龄左右的小鼠，腹腔注射2mL无菌的液体石蜡。
待3~4d后收集腹腔细胞。
（2）颈椎脱臼法法处死小鼠，消毒，用注射器抽取5mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1~2 min，静置5min，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中。
小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化方法(详细版)
小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化实验前准备：超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、75cm2细胞培养皿、2mL注射器、无菌40μm尼龙过滤器、细胞吸管、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、红细胞裂解液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、M-CSF因子、细胞计数版、倒置显微镜等。
操作步骤：（1）C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒，固定小鼠。
（2）无菌条件下分离并取下小鼠的股骨和胫骨，小心不要打破骨头。
然后放入事先含有75%酒精的75cm2的细胞培养皿中。
（3）移入生物安全柜中，进一步分离去除骨周围组织，然后将其移入含有1×PBS的另一细胞培养皿中清洗，最后再将其转移另一 75cm2细胞培养皿（含有1%双抗的DMEM的细胞培养基）中等待下一步处理。
（4）用眼科组织剪去除股骨和胫骨的骨两端，然后含有2ml DMEM 细胞培养基的注射器从骨的一个断端冲洗骨髓细胞到10ml无菌离心管中，重复 3 次。
（5）1500r/min，离心 8min，弃上清液。
（6）加入5ml红细胞裂解液，吸管反复吹打，然后静置 3min。
（7）1500r/min，离心 8min，弃上清液。
（8）加入5ml DMEM 细胞培养基重悬细胞，然后用40μm尼龙过滤器过滤细胞。
（9）1500r/min，离心 8min，弃上清液，重复 3 次。
（10）a 加入含有 20%FBS/ DMEM 的细胞培养液重悬细胞，到该步骤提取完毕。
b 加入含有 20ng/ml的 M-CSF 的 20%FBS/ DMEM 细胞培养液重悬细胞，诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞。
细胞计数，调整细胞浓度至1×106／mL。
接种75cm2细胞培养皿中。
（11）放于37℃、5％二氧化碳饱培养箱中培养，待后续实验研究。
分离巨噬细胞的方法
分离巨噬细胞的方法巨噬细胞是免疫系统中重要的成分之一，其功能是吞噬和消化细菌、病毒、细胞残骸等病原体或异常细胞。
为了研究巨噬细胞的生理和病理功能，科学家需要从体内或体外分离出巨噬细胞。
下面将介绍几种常用的分离巨噬细胞的方法。
1. 腹腔巨噬细胞分离法这是一种常用的方法，适用于小鼠或大鼠的巨噬细胞分离。
首先，用适当的方法将小鼠或大鼠的腹腔打开，将腹腔洗液抽取出来。
洗液中含有大量的巨噬细胞。
然后，将洗液经过离心，将沉淀中的巨噬细胞收集起来。
最后，用适当的培养基培养巨噬细胞，使其继续生长和分化。
2. 骨髓巨噬细胞分离法这种方法适用于从小鼠或大鼠的骨髓中分离巨噬细胞。
首先，将小鼠或大鼠的骨髓从骨骼中取出，并用适当的方法将骨髓细胞洗涤干净。
然后，将洗液经过离心，将沉淀中的骨髓巨噬细胞收集起来。
最后，用适当的培养基培养骨髓巨噬细胞，使其继续生长和分化。
3. 化学法分离巨噬细胞这种方法利用化学试剂的特定性质，使巨噬细胞与其他细胞分离。
例如，可以利用巨噬细胞表面特定的受体，使用特定的抗体标记巨噬细胞，并通过离心或磁珠分离得到纯净的巨噬细胞。
此外，还可以利用化学试剂的特殊性质，如巨噬细胞对特定染料的亲和性，来分离巨噬细胞。
4. 细胞排序分离巨噬细胞细胞排序是一种高级的细胞分离技术，可以根据细胞的特定性质，如大小、形状、表面标记等，将巨噬细胞从混合细胞中分离出来。
这种方法可以高效地分离出纯净的巨噬细胞群体，但设备和技术要求较高。
总结起来，分离巨噬细胞的方法有腹腔巨噬细胞分离法、骨髓巨噬细胞分离法、化学法和细胞排序法。
这些方法各有优缺点，科学家可以根据实验需求选择适合的方法。
通过分离巨噬细胞，科学家可以更好地研究巨噬细胞的生理和病理功能，为疾病的治疗和预防提供理论基础。
(完整word版)巨噬细胞的原代培养(word文档良心出品)
1 原理巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。
目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。
培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。
我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。
2试验材料昆明种小鼠10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供公鸡1只PRMI1640培养基新生小牛血清HEPESD-Hanks液青霉素链霉素3试验仪器无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳5m注射器注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。
二氧化碳培养箱生物显微镜高速冷冻离心机低温冰箱4实验步骤4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法:将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。
bmdm提取步骤
bmdm提取步骤
BMDM（Bone Marrow-Derived Macrophages，骨髓来源巨噬细胞）提取步骤如下：
准备小鼠：选用8~10周龄雄性C57BL/6小鼠，脱颈处死后，剔除腿部肌肉及骨盆和股骨的剩余软组织，剪开腿骨两端。
收集骨髓细胞：将小鼠的胫骨和股骨放入含有预热至37℃的DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素）的离心管中，用培养基冲洗骨髓腔，收集混合液。
分离细胞：将收集的混合液进行离心，收集骨髓细胞。
培养细胞：将收集的骨髓细胞接种于含10%胎牛血清、10% L929细胞上清的RPMI 1640培养基中，置于5% CO2、37℃的培养箱中培养。
每隔一天换液，培养7天后，用刮板收集成熟的BMDM。
以上步骤完成后，即可得到骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）。
这些细胞可用于后续的实验，如Western blotting检测细胞上清液中Caspase-1 p20及细胞裂解液中Caspase-1 p45蛋白表达等。
请注意，实验过程中应在无菌环境下进行，以确保细胞的健康和实验的准确性。
此外，实验过程中涉及的所有试剂和器具都应经过消毒处理，以防止微生物污染。
以上信息仅供参考，如需了解更多有关BMDM提取步骤的信息，建议查阅相关文献或咨询专业人士。
小鼠骨髓巨噬细胞提取步骤条件
小鼠骨髓巨噬细胞提取步骤条件提到小鼠骨髓巨噬细胞提取，听起来是不是有点高大上？其实没那么复杂，今天咱们就来聊聊这个有趣的过程，让你在实验室里也能当个“高手”。
准备好了吗？咱们一起探讨这段神奇的旅程吧！1. 准备工作在我们正式开始之前，得先做好准备工作。
说到准备，这可不是随便说说。
首先，咱们得确保实验室干净整洁，像个新婚的小屋一样。
再来，准备一些必备的器材，像是无菌的培养皿、移液器、离心管等等。
为了不让自己搞得一团糟，记得提前检查一遍，保证每样东西都在你手边，等着派上用场。
1.1 选小鼠小鼠的选择可是一门学问，嘿嘿！一般来说，咱们选择6到8周大的小鼠比较好，这时候的小家伙正是“青春期”，骨髓里的细胞活力满满。
注意啦，选择健康的小鼠可比挑选水果还重要，生病的小鼠提取出来的细胞就像旧电池，毫无用处。
顺便提一句，实验之前得做好伦理审查，咱们得对小生命有个底线，对吧？1.2 麻醉和取样小鼠准备好后，我们就得给它们麻醉了。
说到麻醉，那可得慎重，不要用家里的香水哦，咱们得用合适的麻醉剂。
然后，用小手术刀轻轻一划，咱们就能看到骨髓啦！其实，取样的过程还是蛮刺激的，就像打游戏一样，手要稳，心要静，别一紧张把鼠标摔了。
2. 骨髓细胞提取好了，接下来就是重头戏了！小鼠的骨髓提取出来后，咱们得进行离心处理。
这个过程听起来复杂，其实就像打蛋一样。
把骨髓放到离心管里，然后送进离心机，调好转速和时间，咔嚓一声就可以开始了。
这时候，可以泡杯茶，放松一下，等着看成果。
2.1 细胞分离离心完成后，细胞会分层。
顶部的液体是我们不需要的，下面的细胞沉淀就是咱们的目标。
小心翼翼地吸取上面的液体，留住底部的细胞，这就像分开面粉和糖，讲究技巧哦！吸取完毕后，加入培养基，让这些细胞在温暖的“家”里好好待着。
2.2 培养细胞现在，细胞进入培养阶段。
要想让它们长得好，咱们可得提供个舒适的环境。
这包括恒温、恒湿，光照条件也要控制好。
别忘了定期更换培养基，就像给植物浇水一样，细胞也需要“吃饭”。
原代骨髓来源的巨噬细胞BMDM提取与诱导
原代骨髓来源的巨噬细胞BMDM提取与诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages, BMDM）。
它最大的优点在于它是原代细胞，其性状和功能更贴近与小鼠机体本身的巨噬细胞，被广大研究人员充分肯定并接受。
其次每次试验先用现提，避免了实验室祖传细胞株培养变异的情况，试验结果稳定可靠。
实验所需的动物、试剂和相关器械实验动物：6-8周龄C57BL/J小鼠试剂：M-CSF（商品化的诱导因子）或L929细胞系、含10%FBS DMEM 高糖培养基、75%乙醇、无菌PBS（含双抗1%）。
实验器械：5mL注射器、剪刀、镊子、70μm细胞滤器、50ml离心管、T25细胞培养瓶或细胞培养板。
实验的具体流程1. 细胞因子M-CSF的获取M-CSF是一种诱导骨髓细胞向巨噬细胞分化的细胞因子，获取的途径有两种：1）找商业化的细胞因子产品直接购买，M-CSF的使用浓度在20-50ng/mL，不同品牌有所区别。
2）自己培养能够分泌这种细胞因子的细胞——L929细胞。
L929细胞种植在直径150mm的大皿中，第二天弃掉旧的培养基，PBS清洗3次后更换为新的培养基，放置在培养箱培养5-7天后收集培养基，将培养基1200rpm/min离心5min，取上清分装保存于-20℃待用，诱导骨髓巨噬细胞分化的培养基为含有15% L929培养基的DMEM高糖培养基。
2. 骨髓巨噬细胞的分离1）小鼠取腿骨小鼠脱臼处死，将小鼠放置在盛有足量75%乙醇的烧杯中浸泡消毒5min，移入小鼠至超净台，固定在白色泡沫板，用剪刀沿着小鼠大腿根部大转子将后肢剪下来，粗略去掉肌肉组织后放置在含有1%双抗的PBS培养皿内，再次移动到新无菌PBS精细剥离肌肉。
2）BMDM细胞提取和诱导将剥离好的股骨、胫骨分开，并用剪刀分别将股骨、胫骨两端剪断，使用5mL注射器吸取冷的诱导培养基将骨髓从股骨、胫骨中吹出，反复吹洗3次，直至腿骨内看不到明显的红色为止。
制备小鼠骨髓来源巨噬细胞
制备小鼠骨髓来源巨噬细胞一、材料：1.动物：6-8周小鼠（GFP+小鼠、野生型小鼠）。
2.配制培养液：含20%胎牛血清/双抗/M-CSF的DMEM培养液。
即：DMEM 40ml + 胎牛血清 10ml + 1X双抗 500ul + 5ulM-CSF3.盐溶液：0.9%氯化钠溶液（无菌），储存于4度。
4.红细胞裂解液（1X）。
5.消毒后的手术器械，注：3套剪子和镊子。
6.75%乙醇溶液。
7.2ml注射器。
8.6个15ml离心管，3个50ml离心管。
9.滤网3个。
10.6孔板3个。
11.培养皿6个。
12.纱布数块。
二、方法：1.复温培养液（预添加M-CSF）。
2.处死小鼠，于75%乙醇溶液中浸泡消毒5min。
拉扯双侧后腿直至听到清脆响声（提示股骨从髋骨脱臼）。
3.使用干净的剪刀、镊子沿一侧大腿环形剪开皮肤，向爪子方向剥离皮肤。
4.用镊子将腿部肌肉分开，露出股骨和胫骨（注意不要损伤骨头）。
5.切断股骨与髋骨间的韧带，切下踝关节以下的骨头。
将股骨和胫骨置于含有双抗（1X）的盐溶液中。
6.同法处理另一只腿。
7.用剪刀小心剥除骨骼上附着的组织，将骨头置于含有双抗（1X）的盐溶液中。
8.2ml无菌注射器吸1.5ml含有双抗（1X）的盐溶液，并准备好15ml离心管。
9.从膝关节处分离股骨和胫骨，丢弃膝盖骨。
一个无菌镊夹住股骨，用一把无菌剪刀剪掉股骨上端。
将针头插入骨髓腔，用盐溶液反复冲洗，将骨髓冲入15ml离心管。
冲洗过程中，上下移动针头刮扫骨髓腔。
每根骨头使用大约3ml盐溶液。
丢弃骨头。
10.同法处理胫骨（剪掉上下两端）。
11.将细胞悬液离心（1500rpm，5min）。
丢弃上清，加入红细胞裂解液（1X），每只小鼠需用2-3ml红细胞裂解液，混匀细胞悬液，室温静置10min。
给予2-3倍体积的盐溶液中止。
即：2ml红细胞裂解液，4-6ml盐溶液。
12.过滤：将细胞悬液离心（1500rpm，5min），丢弃上清，加入配好的DMEM，每只小鼠8ml，反复吹打，经滤器过滤（滤器下方记得吸一下，细胞悬液有残留），收集于50ml离心管中，将过滤好的细胞悬液打入6孔板内，每孔2ml。
巨噬细胞提取方法
我是按照经典的方法，注射淀粉肉汤3天后腹腔灌洗得来的，培养3小时除去上清液后纯化了巨噬细胞然后加药的，培养24小时后可以看到细胞已经贴壁了，但是我发现加了LPS的组细胞悬浮的比阴性组多，这个就很奇怪了，我的LPS浓度从10ng一直到20ug/mL都有设置，但是吞噬率无一超过阴性组的。
(1) 小鼠2 ml/只腹腔注射3%巯基乙醇酸钠，三天后颈椎脱臼处死小鼠，用75%乙醇浸湿3 min消毒，置超净台中；(2)用镊子将小鼠下腹部皮肤提起，剪开一个小口，将皮肤撕开，完全暴露腹膜；(3)用镊子提起腹膜，用10ml注射器向小鼠腹腔中注入6ml PBS缓冲液,针尖向上，避开肠和脂肪,反复回抽腹腔液，不同的方向冲洗数次，最后吸出腹腔液；(4)将细胞悬液1000r/min条件下离心10min，用PBS液洗涤l次，用含10%的胎牛血清RPMIl-1640将细胞悬起，台盼蓝染色，当活细胞数达到95%以上时调整细胞浓度至2×106个/ml。
(5)将细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，把细胞培养板放置于37℃5%CO2的培养箱中培养3h；(6)3h后取出细胞培养板，清洗1次，去除未贴壁的细胞，弃去上清液，然后每孔加入100mL RPMI-1640完全培养液,此时细胞培养板孔内的贴壁细胞即为纯化以后的小鼠腹腔巨噬细胞。
按照以上述制备和纯化腹腔巨噬细胞方法处理细胞后，200μL/孔加入不同浓度的阳性药LPS，阴性对照孔加200μL培养基，放置于培养箱中，培养24 h后取出细胞板，弃上清，用PBS液200μL/孔洗3遍，加0.1%中性红溶液200μL/孔，继续于培养箱中孵育3h。
取出细胞板，弃上清，用PBS液200μL/孔洗两遍后加细胞裂解液(醋酸与无水乙醇等体积混合) 200μL/孔，将96孔板放在微型振荡器上振荡10 min后，放在4℃冰箱12h过夜。
将细胞板520 nm 波长处测定吸光度。
按下式计算吞噬中性红增加率%=(给药孔A值一对照孔A值)/对照孔A值×100%。
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小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化实验前准备：
超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、75cm2细胞培养皿、2mL注射器、无菌40μm尼龙过滤器、细胞吸管、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、红细胞裂解液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、M-CSF因子、细胞计数版、倒置显微镜等。
操作步骤：
（1）C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒，固定小鼠。
（2）无菌条件下分离并取下小鼠的股骨和胫骨，小心不要打破骨头。
然后放入事先含有75%酒精的75cm2的细胞培养皿中。
（3）移入生物安全柜中，进一步分离去除骨周围组织，然后将其移入含有1×PBS的另一细胞培养皿中清洗，最后再将其转移另一 75cm2细胞培养皿（含有1%双抗的DMEM的细胞培养基）中等待下一步处理。
（4）用眼科组织剪去除股骨和胫骨的骨两端，然后含有2ml DMEM 细胞培养基的注射器从骨的一个断端冲洗骨髓细胞到10ml无菌离心管中，重复 3 次。
（5）1500r/min，离心 8min，弃上清液。
（6）加入5ml红细胞裂解液，吸管反复吹打，然后静置 3min。
（7）1500r/min，离心 8min，弃上清液。
（8）加入5ml DMEM 细胞培养基重悬细胞，然后用40μm尼龙过滤器过滤细胞。
（9）1500r/min，离心 8min，弃上清液，重复 3 次。
（10）a 加入含有 20%FBS/ DMEM 的细胞培养液重悬细胞，到该步骤提取完毕。
b 加入含有 20ng/ml的 M-CSF 的 20%FBS/ DMEM 细胞培养液重悬细胞，诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞。
细胞计数，调整细胞浓度至1×106／mL。
接种75cm2细胞培养皿中。
（11）放于37℃、5％二氧化碳饱培养箱中培养，待后续实验研究。