小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化方法(详细版)

小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化实验前准备：

超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、75cm2细胞培养皿、2mL注射器、无菌40μm尼龙过滤器、细胞吸管、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、红细胞裂解液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、M-CSF因子、细胞计数版、倒置显微镜等。

操作步骤：

（1）C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒，固定小鼠。

（2）无菌条件下分离并取下小鼠的股骨和胫骨，小心不要打破骨头。然后放入事先含有75%酒精的75cm2的细胞培养皿中。

（3）移入生物安全柜中，进一步分离去除骨周围组织，然后将其移入含有1×PBS的另一细胞培养皿中清洗，最后再将其转移另一 75cm2细胞培养皿（含有1%双抗的DMEM的细胞培养基）中等待下一步处理。（4）用眼科组织剪去除股骨和胫骨的骨两端，然后含有2ml DMEM 细胞培养基的注射器从骨的一个断端冲洗骨髓细胞到10ml无菌离心管中，重复 3 次。

（5）1500r/min，离心 8min，弃上清液。

（6）加入5ml红细胞裂解液，吸管反复吹打，然后静置 3min。（7）1500r/min，离心 8min，弃上清液。

（8）加入5ml DMEM 细胞培养基重悬细胞，然后用40μm尼龙过滤器过滤细胞。

（9）1500r/min，离心 8min，弃上清液，重复 3 次。

（10）a 加入含有 20%FBS/ DMEM 的细胞培养液重悬细胞，到该步骤提取完毕。b 加入含有 20ng/ml的 M-CSF 的 20%FBS/ DMEM 细胞培养液重悬细胞，诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞。细胞计数，调整细胞浓度至1×106／mL。接种75cm2细胞培养皿中。

（11）放于37℃、5％二氧化碳饱培养箱中培养，待后续实验研究。