高效液相色谱实验步骤和方法开发
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
样品：
① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)
1.改变容量因子 K’
谱图
① ① ①
② 5 0 / 5 0
4 0 / 6 0
③ ② ②
6 0 / 4 0
③③
2.调节α值改变选择性
同样强度的不同溶剂，改变了流动相α值
➢ 而HPLC可对80％左右的有机化合物进 行分离和分析
HPLC的广泛应用
➢ HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极 性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质 的分离和分析并且可以做制备
➢ 在医药、食品、农业、生命科学、化工、 环保等领域都有着广泛的应用潜力。
HPLC的应用领域
➢ 在食品研究中的分析应用 食品中的天然成分
液相色谱的应用以及方法开发
戴安中国有限公司
提纲：
一.HPLC的广泛应用 二.方法开发过程 一）选择HPLC检测器 二）分配色谱及选择流动相 三）方法开发的具体步骤 四）梯度洗脱方法
一.HPLC的广泛应用
➢ 据2004年统计，世界上化合物总数多 达4700多万种
➢ 在全部有机化合物中仅有20％左右的 样品适用于GC分析
**应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法
流动相的选择原则
样品易溶，且溶解度尽可能大 化学性质稳定，不损坏柱子 不妨碍检测器检测，所选波长处无吸收 * 黏度低，流动性好 * 无毒或低毒，易于操作 易于从其中回收样品 易于制成高纯度，即色谱纯 废液易处理，不污染环境
三）方法开发的具体步骤
先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k’ 值改变保留值 调节a值改变选择性
分离(制备)时要了解哪方面的情况？
要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?
使用文献方法注意点
色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相
是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）
COONa
CHO
COOH
保留时间很短，无
法完全分离。
OCH3
OH
OCH3
1
2
3
4
三甲氧基-四羟基苯甲醛 苯甲酸纳 苯甲醛 对甲氧基苯甲酸
3.离子抑制色谱
离子型化合物在反相色谱柱上不保留
改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离使样品 成中性
适用于弱酸性化合物的分离 加入TFA,磷酸盐等降低流动相的pH值，使样品 降低离子化 使用硅胶基质C18填料
使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内
离子抑制色谱实例
而 在 乙 腈 / 水 并 且 CHO pH=7时，多数组份
HPLC的应用领域
➢ 化妆品行业要控制和分析： 防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；
➢ 在公安、刑警破案工作需要 投毒药物、毒品分析等
➢ 在环境污染分析中的应用 废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚 类和胺类的检测
➢ 在无机离子分析中应用 –饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析
二.方法开发的过程
原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：比耳定律，A＝KCL 优点：1）对温度和流速不敏感
2）可用于梯度洗脱 3） 灵敏度较高，ng级检测 缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质
吸光度（ UV/Vis）检测的应用
大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测 定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的 检测器
✓ 碳水化合物 ✓ 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇 ✓ 脂肪酸和有机酸 ✓ 蛋白、肽、氨基酸
食品添加剂
✓ 酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂 ✓ 抗氧化剂、防腐剂 ✓ 颜料和染料（色素〕 ✓ 维生素
污染物
✓ 霉菌（黄曲霉毒素〕 ✓ 农药残留和兽药残留 ✓ 多环芳烃（PAHS〕和亚硝酸
HPLC的应用领域
➢ 在医药研究中分析应用
药物分析有USP、BP、CP等标准
▪ 常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血 管药、磺胺类消炎药等。 甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激 素和孕激素等。 抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、 四环素、氯霉素、诺氟沙星等。 中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙 等)、萜类 手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉胺 毒性小，L-异构体毒性很强) 医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。
分配色谱概述
反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离
洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱
流动相极性
流动相洗脱强度
反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度： 水< 甲醇<乙腈< 乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃 最常用的流动相组成“甲醇-水；乙腈-水”
正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度： 正己烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇
✓ 通过改变流动相的pH值，使样品成中性
✓ 加入“对离子”，使样品呈中性 请 记 住 ∶ 调节柱长度改变柱效及分离速度 每 次 改 变 一 个 参 数
反相色谱的方法开发
开发过程实例
色谱条件∶
✓ 色谱柱：C18，4.6mm×15mm ✓ 流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走梯度）
举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 ✓ 流速：1ml/min
1. 得到样品信息，确定分离目标 2. 确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求
3. 选择合适的检测器 4. 选择HPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件
5. 优化分离条件 6. 检查特定过程的问题及需要
7. 定量校正 8. 日常使用的确认
Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2
在收集色谱图的同时，得到光谱图 ➢ 提供许多有用的功能
-色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认 -可以发现单波长检测时未测到的峰 -任意波长的色谱再处理 -光谱信息-光谱库的建立检索和拟合
荧光（Fluorescence）检测原理
➢ 原理：发荧光的化合物吸收光（UV或VIS） 使其分子达到激发态，当其返回到基态时发 射光的现象即荧光
高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应
对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性
灵敏度：信噪比
灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音
的比值（S/N）
检测限（LOD）：S/N = 3
6:1
定量限（LOQ）：S/N = 10
好的信噪比有利于：
--多数公司售出的检测器中75%以上是吸 光度检测器（其中50%以上是紫外/可见检 测器，25%是PDA）
光电二极管矩阵（Photo Diode Array）
Photo Diode Array 简称：PDA或DAD
光电二极管矩阵检测器（ PDA ）的特点和用途
➢ 一种三维水平的吸光度检测器--采集三维谱图 ➢ 兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息
高分子化合物GPC,GFC分析以及复杂样品纯 化
二）色谱基本分类
色谱基本分类： 按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以分为：
1.分配色谱—分配系数 *** 2.亲和色谱—亲和力 3.吸附色谱--吸附力 4.离子交换色谱—离子交换能力 5.凝胶色谱（体积排阻色谱）--分子大小引起的体积排阻
分配色谱
S
更好的色谱峰确认
更好的定量
更好地完成色谱峰纯度/均一性
N
选择液相色谱的检测器
要考虑的因素： 你要分离的化合物/样品的化学特性 化学结构、分子量及紫外光谱等等 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等） 梯度还是等度 灵敏度需求 是否有双检测的需求
选择液相色谱的检测器
通用检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性
RI ELSD MS ug ng pg 104 否 103 是否是 是否否 否是是
选择性检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性
ABS FL ng pg 105 103 否否 否否 否否
EC Cond MS fg pg pg 106 105 103 是是是 是是是 是否是
吸光度（ UV/Vis）检测原理
一）选择HPLC检测器
对样品有响应并有一个输出信号
应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性 关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系 但是： 由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与 浓度之间关系的与线性偏离现象 并不是所有的检测器是线性的 受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可 能与其最佳水平有较大的差距
分配色谱分为： 正相色谱：固定相（填料）为极性，流动相为非极性 反相色谱：固定相（填料）为非极性，流动相为极性。 用得最多，约占60-70%
相对应的色谱柱： 反相柱：烷基硅烷键合硅胶填料，如C18（ODS） C8,C4,C3，苯基等 正相柱：典型的为硅胶柱，其它官能团为-CN氰基， -NH2氨基等
分配色谱的分离机理
❖ 在兽药研究中分析应用
HPLC 的应用领域
➢ 在生物化学和生物工程中的应用
氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究 核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)
➢ 在精细化工分析中的应用
醇、醛和酮、醚的分离分析 酸和酯的分离分析 表面活性剂的分析 聚合物的分析研究 药物、农药、染料、炸药等工业产品
第一步干什么?
想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样 品的分析方法 查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA--仪器制造商的文献，如Dionex,Waters
对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法
充分了解您自己的样品
分析时要了解哪方面的情况？
灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用?
用于HPLC的检测器
没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相 色谱分离！
HPLC检测器可以分为： 溶质性质检测器（选择型） 对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流 动相的变化（选择型） 整体性质检测器（通用型） 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变 化作出响应（通用型）
理想的HPLC检测器
S R
示差折光（RI ）检测 的原理
原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样 各组分浓度。
优点：通用型检测器 缺点： 1）对温度变化敏感
2）不能用于梯度检测 3）灵敏度ຫໍສະໝຸດ Baidu，ug级检测
返回
示差检测器的应用
示差折光检测器是通用型检测器,如果选择 合适的溶剂，几乎所有的物质都可以检测
特别适用于检测没有紫外吸收的化合物,例 如糖类,醇类,酯类以及脂肪酸等
改变色谱柱
① THF / H2O ＝28 : 72 ② MeOH / H2O ＝58 : 42 ③ CH3CN / H2O ＝38 : 62
离子型化合物的色谱分离
离子型化合物的分离方式 多数化合物是离子型的！
使用离子交换柱：离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子
使用反相柱 离子抑制色谱法：通过改变流动相的pH值，使 样品成中性 离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中 性
O O
O
O
H3C
NH
O
➢ 生物技术及制药
O
O CH3
O
CH3 O
CH3
黄曲霉毒素 氨基甲酸酯类杀虫剂
示差折光（Refractive Index）检测
示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色 谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）
通常被认为是一种通用检测器 检测溶液中所有被溶解的溶质 － 非特异性 任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中 与真空中的速度之比值
➢ 优点：荧光检测器灵敏度高, pg级检测
➢ 缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需 要衍生
荧光检测器原理
荧光检测器的应用
➢ 环境中的污染物
多环芳烃(PAH)，多 酚，氨基甲酸酯等
多环芳烃（PAH）
➢ 食品、饮料
H3C CH3
CH3
CH3
食品中的毒素；例
OH
如：黄曲霉毒素 染料
CH3
维生素
维生素及衍生氨基 酸
① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)
1.改变容量因子 K’
谱图
① ① ①
② 5 0 / 5 0
4 0 / 6 0
③ ② ②
6 0 / 4 0
③③
2.调节α值改变选择性
同样强度的不同溶剂，改变了流动相α值
➢ 而HPLC可对80％左右的有机化合物进 行分离和分析
HPLC的广泛应用
➢ HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极 性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质 的分离和分析并且可以做制备
➢ 在医药、食品、农业、生命科学、化工、 环保等领域都有着广泛的应用潜力。
HPLC的应用领域
➢ 在食品研究中的分析应用 食品中的天然成分
液相色谱的应用以及方法开发
戴安中国有限公司
提纲：
一.HPLC的广泛应用 二.方法开发过程 一）选择HPLC检测器 二）分配色谱及选择流动相 三）方法开发的具体步骤 四）梯度洗脱方法
一.HPLC的广泛应用
➢ 据2004年统计，世界上化合物总数多 达4700多万种
➢ 在全部有机化合物中仅有20％左右的 样品适用于GC分析
**应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法
流动相的选择原则
样品易溶，且溶解度尽可能大 化学性质稳定，不损坏柱子 不妨碍检测器检测，所选波长处无吸收 * 黏度低，流动性好 * 无毒或低毒，易于操作 易于从其中回收样品 易于制成高纯度，即色谱纯 废液易处理，不污染环境
三）方法开发的具体步骤
先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k’ 值改变保留值 调节a值改变选择性
分离(制备)时要了解哪方面的情况？
要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?
使用文献方法注意点
色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相
是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）
COONa
CHO
COOH
保留时间很短，无
法完全分离。
OCH3
OH
OCH3
1
2
3
4
三甲氧基-四羟基苯甲醛 苯甲酸纳 苯甲醛 对甲氧基苯甲酸
3.离子抑制色谱
离子型化合物在反相色谱柱上不保留
改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离使样品 成中性
适用于弱酸性化合物的分离 加入TFA,磷酸盐等降低流动相的pH值，使样品 降低离子化 使用硅胶基质C18填料
使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内
离子抑制色谱实例
而 在 乙 腈 / 水 并 且 CHO pH=7时，多数组份
HPLC的应用领域
➢ 化妆品行业要控制和分析： 防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；
➢ 在公安、刑警破案工作需要 投毒药物、毒品分析等
➢ 在环境污染分析中的应用 废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚 类和胺类的检测
➢ 在无机离子分析中应用 –饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析
二.方法开发的过程
原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：比耳定律，A＝KCL 优点：1）对温度和流速不敏感
2）可用于梯度洗脱 3） 灵敏度较高，ng级检测 缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质
吸光度（ UV/Vis）检测的应用
大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测 定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的 检测器
✓ 碳水化合物 ✓ 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇 ✓ 脂肪酸和有机酸 ✓ 蛋白、肽、氨基酸
食品添加剂
✓ 酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂 ✓ 抗氧化剂、防腐剂 ✓ 颜料和染料（色素〕 ✓ 维生素
污染物
✓ 霉菌（黄曲霉毒素〕 ✓ 农药残留和兽药残留 ✓ 多环芳烃（PAHS〕和亚硝酸
HPLC的应用领域
➢ 在医药研究中分析应用
药物分析有USP、BP、CP等标准
▪ 常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血 管药、磺胺类消炎药等。 甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激 素和孕激素等。 抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、 四环素、氯霉素、诺氟沙星等。 中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙 等)、萜类 手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉胺 毒性小，L-异构体毒性很强) 医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。
分配色谱概述
反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离
洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱
流动相极性
流动相洗脱强度
反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度： 水< 甲醇<乙腈< 乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃 最常用的流动相组成“甲醇-水；乙腈-水”
正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度： 正己烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇
✓ 通过改变流动相的pH值，使样品成中性
✓ 加入“对离子”，使样品呈中性 请 记 住 ∶ 调节柱长度改变柱效及分离速度 每 次 改 变 一 个 参 数
反相色谱的方法开发
开发过程实例
色谱条件∶
✓ 色谱柱：C18，4.6mm×15mm ✓ 流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走梯度）
举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 ✓ 流速：1ml/min
1. 得到样品信息，确定分离目标 2. 确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求
3. 选择合适的检测器 4. 选择HPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件
5. 优化分离条件 6. 检查特定过程的问题及需要
7. 定量校正 8. 日常使用的确认
Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2
在收集色谱图的同时，得到光谱图 ➢ 提供许多有用的功能
-色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认 -可以发现单波长检测时未测到的峰 -任意波长的色谱再处理 -光谱信息-光谱库的建立检索和拟合
荧光（Fluorescence）检测原理
➢ 原理：发荧光的化合物吸收光（UV或VIS） 使其分子达到激发态，当其返回到基态时发 射光的现象即荧光
高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应
对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性
灵敏度：信噪比
灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音
的比值（S/N）
检测限（LOD）：S/N = 3
6:1
定量限（LOQ）：S/N = 10
好的信噪比有利于：
--多数公司售出的检测器中75%以上是吸 光度检测器（其中50%以上是紫外/可见检 测器，25%是PDA）
光电二极管矩阵（Photo Diode Array）
Photo Diode Array 简称：PDA或DAD
光电二极管矩阵检测器（ PDA ）的特点和用途
➢ 一种三维水平的吸光度检测器--采集三维谱图 ➢ 兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息
高分子化合物GPC,GFC分析以及复杂样品纯 化
二）色谱基本分类
色谱基本分类： 按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以分为：
1.分配色谱—分配系数 *** 2.亲和色谱—亲和力 3.吸附色谱--吸附力 4.离子交换色谱—离子交换能力 5.凝胶色谱（体积排阻色谱）--分子大小引起的体积排阻
分配色谱
S
更好的色谱峰确认
更好的定量
更好地完成色谱峰纯度/均一性
N
选择液相色谱的检测器
要考虑的因素： 你要分离的化合物/样品的化学特性 化学结构、分子量及紫外光谱等等 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等） 梯度还是等度 灵敏度需求 是否有双检测的需求
选择液相色谱的检测器
通用检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性
RI ELSD MS ug ng pg 104 否 103 是否是 是否否 否是是
选择性检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性
ABS FL ng pg 105 103 否否 否否 否否
EC Cond MS fg pg pg 106 105 103 是是是 是是是 是否是
吸光度（ UV/Vis）检测原理
一）选择HPLC检测器
对样品有响应并有一个输出信号
应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性 关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系 但是： 由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与 浓度之间关系的与线性偏离现象 并不是所有的检测器是线性的 受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可 能与其最佳水平有较大的差距
分配色谱分为： 正相色谱：固定相（填料）为极性，流动相为非极性 反相色谱：固定相（填料）为非极性，流动相为极性。 用得最多，约占60-70%
相对应的色谱柱： 反相柱：烷基硅烷键合硅胶填料，如C18（ODS） C8,C4,C3，苯基等 正相柱：典型的为硅胶柱，其它官能团为-CN氰基， -NH2氨基等
分配色谱的分离机理
❖ 在兽药研究中分析应用
HPLC 的应用领域
➢ 在生物化学和生物工程中的应用
氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究 核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)
➢ 在精细化工分析中的应用
醇、醛和酮、醚的分离分析 酸和酯的分离分析 表面活性剂的分析 聚合物的分析研究 药物、农药、染料、炸药等工业产品
第一步干什么?
想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样 品的分析方法 查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA--仪器制造商的文献，如Dionex,Waters
对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法
充分了解您自己的样品
分析时要了解哪方面的情况？
灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用?
用于HPLC的检测器
没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相 色谱分离！
HPLC检测器可以分为： 溶质性质检测器（选择型） 对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流 动相的变化（选择型） 整体性质检测器（通用型） 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变 化作出响应（通用型）
理想的HPLC检测器
S R
示差折光（RI ）检测 的原理
原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样 各组分浓度。
优点：通用型检测器 缺点： 1）对温度变化敏感
2）不能用于梯度检测 3）灵敏度ຫໍສະໝຸດ Baidu，ug级检测
返回
示差检测器的应用
示差折光检测器是通用型检测器,如果选择 合适的溶剂，几乎所有的物质都可以检测
特别适用于检测没有紫外吸收的化合物,例 如糖类,醇类,酯类以及脂肪酸等
改变色谱柱
① THF / H2O ＝28 : 72 ② MeOH / H2O ＝58 : 42 ③ CH3CN / H2O ＝38 : 62
离子型化合物的色谱分离
离子型化合物的分离方式 多数化合物是离子型的！
使用离子交换柱：离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子
使用反相柱 离子抑制色谱法：通过改变流动相的pH值，使 样品成中性 离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中 性
O O
O
O
H3C
NH
O
➢ 生物技术及制药
O
O CH3
O
CH3 O
CH3
黄曲霉毒素 氨基甲酸酯类杀虫剂
示差折光（Refractive Index）检测
示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色 谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）
通常被认为是一种通用检测器 检测溶液中所有被溶解的溶质 － 非特异性 任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中 与真空中的速度之比值
➢ 优点：荧光检测器灵敏度高, pg级检测
➢ 缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需 要衍生
荧光检测器原理
荧光检测器的应用
➢ 环境中的污染物
多环芳烃(PAH)，多 酚，氨基甲酸酯等
多环芳烃（PAH）
➢ 食品、饮料
H3C CH3
CH3
CH3
食品中的毒素；例
OH
如：黄曲霉毒素 染料
CH3
维生素
维生素及衍生氨基 酸